12 TCNCYH 34 (2) - 2005 Phát hiện một trờng hợp đột biến lặp đoạn exon 2 xảy ra trong quá trình sao chép gen dystrophin ở bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne. Trần Vân Khánh 1 Và Tạ Thành Văn 2 1 , Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia 2 , Bộ môn Hóa-Hóa sinh, Trờng Đại học Y khoa Hà nội. Gen dystrophin là một gen có cấu trúc rất dài, điều này đã làm cho quá trình phiên mã của gen trở nên phức tạp hơn, đặc biệt là ở đầu gen 5. Trong nghiên cứu này chúng tôi công bố một bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne có đột biến lặp đoạn exon 2. Điều rất đáng chú ý là đột biến này không xuất hiện ở ADN (genome). Chính vì vậy, chúng tôi giả thiết rằng đây là kết quả của quá trình trans-splicing xảy ra trong quá trình sao chép của gen dystrophin. Nguyên nhân và cơ chế của hiện tợng này cha đợc biết rõ ràng và hiện đang đợc tiếp tục nghiên cứu. I. Đặt vấn đề Duchenne là một loại bệnh gây nên do đột biến gen dystrophin. Đây là một gen lớn có chiều dài khoảng 3000 kb, nằm trên nhiễm sắc thể X, mã hóa 14 kb mARN là hợp phần của 79 exon [1, 2]. Hơn 90% trình tự gen là tổ hợp các intron, một vài intron có chiều dài rất lớn điển hình là intron 2 (khoảng 157 kb). Tại đây thờng xảy ra một số lỗi trong quá trình hoàn thiện các tiền mARN. Một trong các khâu của quá trình hoàn thiện tiền mARN là cắt bỏ các intron và ghép nối các exon lại với nhau. Quá trình này đòi hỏi một số trình tự quan trọng nằm ở đầu 5 tận (acceptor splicing site), 3 (donor splicing site) và tại vị trí nhánh của intron (branch consensus site). Ngoài ra quá trình này còn cần một số vùng trình tự khác nằm trong exon bao gồm vùng giàu base purine (purine-rich region), vùng tăng cờng quá trình ghép nối (splicing enhancer sequence- SES) và vùng trình tự nhận biết exon (exon recognition sequence). Gần đây ngời ta chứng minh rằng một số nhóm các protein tham gia vào quá trình nhận biết SES góp phần quan trọng trong quá trình hoàn thiện các tiền mARN. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng trong quá trình này, đột biến thêm đoạn thờng gặp hơn cả so với một số đột biến khác. Cho đến nay một vài exon đợc sao chép lại từ intron của gen dystrophin đã đợc công bố nh exon X, exon 2a và exon 3a. Các exon này lần lợt đợc sao chép từ intron 1, 2, 3 và hợp nhất để tạo ra cấu trúc mARN của dystrophin [3, 7]. Trans- splicing là một hiện tợng ít đợc biết đến hơn trong quá trình hoàn thiện các tiền mARN. Trong nghiên cứu này chúng tôi công bố một bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne có đột biến lặp đoạn exon 2. Điều rất đáng chú ý là đột biến này không xuất hiện ở ADN. Chính vì vậy, chúng tôi giả thiết rằng đây là kết quả của quá trình trans- splicing xảy ra trong quá trình sao chép của gen dystrophin. 13 II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Đối tợng Bệnh nhân DMD đợc chẩn đoán dựa vào những triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình: yếu cơ có tính chất tiến triển, phì đại cơ cẳng chân, mất khả năng đi lại ở tuổi 12, nồng độ CK tăng cao trong máu ngoại vi và sinh thiết cơ có hình ảnh điển hình của bệnh. 2.2. Phơng pháp nghiên cứu ADN đợc tách chiết từ máu ngoại biên theo qui trình phenol/chloroform chuẩn. Để xác định đột biến xóa đoạn, lặp đoạn hay thêm đoạn ở mức độ ADN, phơng pháp Southern blot đã đợc tiến hành dựa theo quy trình của một báo cáo trớc đây [2]. mARN tổng số đợc tác chiết từ máu ngoại biên và tổng hợp cADN theo kỹ thuật của Chomczynsky [4]. Để xác định một số đột biến bất thờng xảy ra trong quá trình phiên mã, 20 cặp mồi khác nhau đã đợc sử dụng. Toàn bộ chiều dài gen dystrophin đợc khuyếch đại từ cADN bằng phản ứng polymerase chain reaction (PCR). Thêm vào đó một cặp mồi với chiều xuôi bổ xung với exon 1 (1C: 5- ATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAG-3) và chiều ngợc bổ xung với exon 4 (c4r: 5- GTTCAGGGCAGAAGTCTTG-3) đã đợc sử dụng để định vị rõ ràng hơn đột biến lặp đoạn ở vùng 5 tận. Sản phẩm của phản ứng PCR đợc điện di trên gel agarose với nồng độ từ 2-3%. Để xác định trình tự, sản phẩm phản ứng PCR đã đợc cắt ra và tinh chế từ gel sau đó đợc đa vào vector tạo dòng PT7-blue (Novagen). Trình tự gen đợc xác định bằng máy đọc trình tự tự động (model 373A, Applied Biosystems, Foster City, California, USA). III. Kết quả 3.1. Phản ứng khuếch đại cADN từ exon 1 đến exon 4 Sử dụng kỹ thuật PCR với 20 cặp mồi khác nhau chúng tôi đã khuyếch đại toàn bộ chiều dài cADN của gen dystrophin. Kết quả của phản ứng PCR đã cho thấy: ở vùng 5 của gen này có 2 vạch tơng ứng với 2 sản phẩm PCR có kích thớc lớn hơn bình thờng. Sự thay đổi này gợi ý có sự đột biến thêm đoạn tại vùng gen tại đầu 5. Với mục đích định vị chính xác vùng đột biến, chúng tôi đã sử dụng thêm một cặp mồi khác khuyếch đại vùng gen nhỏ hơn kéo dài từ exon 1 đến exon 4, sau đó chạy điện di trên gel với nồng độ agarose cao (3%) nhằm mục đích phân tách các sản phẩm PCR. Hai sản phẩm PCR đợc xác định có kích thớc là 387 bp và 287 bp (hình 1a). Trình tự của các nucleotide của sản phẩm PCR này đã khẳng định rằng đầu 3 của exon 2 gắn trực tiếp với đầu 5 của một exon 2 khác gây ra hiện tợng lặp một đoạn của exon này, bên cạnh đó 162 bp của exon X cũng đợc xác định. Đoạn này nằm giữa exon 1 và exon 2 (hình 1b). C P Mk 1c-c4r 1 2 2 3 4 1 X 2 3 4 2 1 2 3 4 387bp 287 bp 225 bp A } 2 sản phẩm PCR của bệnh nhân. Sản phẩm PCR bình thờng tơng ứng với mẫu đối chứng. } B Exon X Exon 1 Exon 2 Exon 2 13 Hình 1: A, Sản phẩm khuyếch đại của cADN kéo dài từ exon 1 đến exon 4. Hai sản phẩm (387 và 287 bp) đợc khuyếch đại từ mẫu cADN của bệnh nhân (dòng P), cả 2 sản phẩm này đều có kích thớc lớn hơn so với mẫu đối chứng ( 225 bp - dòng C); C, mẫu đối chứng của ngời bình thờng; P, bệnh nhân. Mk: Marker Hae III-digested Ô 174 phage ADN. B, Trình tự của vùng đột biến lặp đoạn exon 2 (gi:M18533) và exon X (gi: 306722) ở đầu 5 tận của gen dystrophin. Hình bên trái: Trình tự đầu 3 của exon 1 gắn trực tiếp với đầu 5 của exon X; Hình bên phải: Trình tự đầu 3 của exon 2 gắn trực tiếp với đầu 5 của một exon 2 khác. 3.2. Kết quả phản Southern blot xác định đột biến trên ADN sử dụng đoạn dò Bgl II Exon 2 lặp đoạn ở đầu 5 của gen dystrophin đã đợc xác định trên một bệnh nhân DMD. Hiện tợng lặp đoạn này không xác định đợc ở ADN (genome) của tế bào bằng kỹ thuật Southern blot mà chỉ xác định đợc ở mức độ mARN (transcript). Kết quả Southern blot của sản phẩm lai tạo exon 2 đã cho thấy: một vạch lai tạo duy nhất có kích thớc tơng ứng với kích thớc của sản phẩm bình thờng (hình 2A). Kết quả mô tả vị trí xác định bởi đầu dò Bgl II đợc diễn dải ở hình 2B. A 13 Hình 2. A, Kết quả lai tạo của phản ứng Southern blot sử dụng đoạn dò Bgl II. Dòng 1: sản phẩm lai tạo của bệnh nhân; Dòng 2: sản phẩm lai tạo của mẫu đối chứng. B, Quá trình trans-splicing. Ba mô hình trans-splicing của gen dystrophin đợc chỉ dẫn bằng các dòng kẻ khác nhau. IV. Bàn luận Việc phân tích khởi đầu bằng kỹ thuật Southern blot. Tuy nhiên đột biến vẫn cha đợc xác định cụ thể do kỹ thuật này chỉ dừng ở mức độ phân tích ADN. Theo nhiều báo cáo đợc tổng kết từ trớc đến nay thì nhiều trờng hợp đột biến không xảy ra ở ADN mà phát sinh trong quá trình sao chép do nhiều nguyên nhân khác nhau [3, 6, 7]. Để nghiên cứu sâu hơn ở mức độ mARN, bằng phản ứng PCR chúng tôi đã dùng 20 cặp mồi khác nhau khuyếch đại toàn bộ chiều dài của gen dystrophin từ cADN. Kết quả PCR đã cho thấy một đoạn gen ở vùng 5 tận có 2 vạch tơng ứng với 2 sản phẩm PCR có kích thớc lớn hơn bình thờng. Điều này cho phép chúng tôi đa ra giả thuyết rằng đột biến thêm đoạn hoặc lặp lại đoạn gen đã có thể xảy ra ở vùng 5 . Để định vị rõ hơn vùng đột biến, chúng tôi sử dụng thêm một cặp mồi khác nhằm mục đích khuyếch đại vùng gen nhỏ hơn kéo dài từ exon 1 đến exon 4, sau đó chạy điện di trên gel với nồng độ agarose cao để có thể phân tích một cách chính xác các sản phẩm PCR. Kết quả cho thấy hai sản phẩm PCR đợc xác định có kích thớc là 387 bp và 287 bp. Kết quả xác định trình tự nucleotide của các sản phẩm PCR này đã chỉ ra rằng đầu 3 của exon 2 gắn trực tiếp với đầu 5 của một exon 2 khác gây ra hiện tợng lặp một đoạn của exon này, bên cạnh đó 162 bp của exon X cũng đợc xác định. Đoạn này nằm giữa exon 1 và exon 2. Trình tự của exon X đã đợc báo cáo trớc đây bởi Roberts 1993 [6]. Đây là một pseudoexon và đợc coi nh là một hiện tợng bình thờng trong quá 1 2 Ex 4 (12.8 kb) B Ex 2 (6 kb) Ex 3 (3 kb) 1 X 23 4 1 2 2 3 4 1 X 2 2 3 4 1 2 2 3 4 1 X 4 2 2 3 4 2 3 1 13 trình sao chép và hoàn thiện để tạo mARN trởng thành của gen dystrophin. Trong nghiên cứu này, exon 2 lặp đoạn ở đầu 5 của gen dystrophin đã đợc xác định trên một bệnh nhân đợc chẩn đoán là DMD. Điều đáng chú ý là hiện tợng lặp đoạn này không xác định đợc ở ADN bằng kỹ thuật Southern blot mà chỉ xác định đợc ở mức độ mARN. Kết quả Southern blot cho thấy sản phẩm lai tại exon 2 có một vạch duy nhất có kích thớc tơng ứng với kích thớc của sản phẩm bình thờng. Từ đó, chúng tôi có thể kết luận rằng hiện tợng lặp đoạn của exon 2 ở đầu 5 tận của gen dystrophin là do hiện tợng trans-splicing xảy ra trong quá trình sao chép của gen. Trans-splicing là một hiện tợng xảy ra trong quá trình hoàn thiện các tiền mARN. Sản phẩm của quá trình này phát sinh từ 2 sản phẩm tiền mARN của dystrophin, trong đó 2 đoạn mARN là sản phẩm của các quá trình sao chép khác nhau đợc ghép nối với nhau để tạo ra một sản phẩm mới Hiện tợng trans-splicing của gen này lần đầu tiên đã đợc tìm thấy trên loài khuẩn trypanosomes [8] và nó đã đợc coi nh là một hiện tợng khác thờng của quá trình sao chép. Tiếp sau đó nó đợc phát hiện trên một số loại giun tròn (nematodes) và tế bào thực vật. Điều này chứng tỏ rằng đây là một hiện tợng khá phổ biến và xảy ra tại rất nhiều mô khác nhau. ở thời điểm đó, một số nhà khoa học đã nghĩ rằng quá trình trans-splicing có thể cung cấp cho họ những ý tởng để nghiên cứu một số liệu pháp điều trị mới nếu hiện tợng này chỉ xảy ra ở một số tổ chức nhất định, đặc biệt nếu không xảy ra trên ngời và động vật có vú. Tuy nhiên trans-splicing sau đó lại tiếp tục đợc phát hiện ở tế bào gan chuột bởi Caudevilla [3]. Tác giả này đã phát hiện ra rằng rất nhiều dạng mARN khác nhau của gen cartidine octanoyltransferase có hiện tợng lặp đoạn của exon 2 hay exon 2 và 3 mà không xác định đợc ở ADN. Cho đến nay hiện tợng này cũng đã đợc tìm thấy trên gen của ng ời, Fluriot đã tìm thấy hiện tợng lặp đoạn của exon 1a ở vùng 5 của gen estrogen receptor-á mà hiện tợng này cũng không đợc xác định ở ADN bằng Southern blot [5]. Cho đến hiện nay, trans-splicing đã đợc chứng minh là một hiện tợng xảy ra khá phổ biến. Tuy nhiên nguyên nhân và cơ chế của hiện tợng này vẫn cha đợc biết rõ ràng và hiện vẫn đang đợc các nhà khoa học tiếp tục quan tâm nghiên cứu. Tài liệu tham khảo 1. Trần Vân Khánh và Tạ Thành Văn. Bệnh loạn dỡng cơ Duchenne và Becker: Đặc điểm lâm sàng và cơ chế sinh học phân tử. Tạp chí thông tin Y học 2004 (đã gửi đăng) 2. Ahn, A.H., and Kunkel, L. M. The structural and functional diversity of dystrophin. Nat. Genet. 3, 283-291, (1993). 3. Caudevilla, C., Serra, D., Miliar, A., Codony, C., Asins, G., Bach, M., Hegardt, F. G. Natural trans-splicing in carnitine octanoyltransferase pre-mARNs in rat liver. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 12185-12190, (1998). 4. Dwi Pramono, Z. A., Takeshima, Y., Surono, A., Ishida, T., Matsuo, M. Novel criptic exon in intron 2 of the human dystrophin gene evolved from an intron by acquiring consensus sequences for splicing at different stages of 14 anthropoid evolution. Biochem biophys Res Commun 267, 321-328, (2000). 5. Fluriot, G. Natural trans-spliced mARNs are generated from the human estrogen receptor-alpha (hER alpha) gene. J Biol Chem. 277, 26244-26251, (2002). 6. Roberts, R. G., Bentley, D. R., Bobrow, M. Infidelity in the structure of ectopic transcripts: a novel exon in lymphocyte dystrophin transcripts: Hum Mutat 2, 293-299, (1993). 7. Suminaga, R., Takeshima, Y., Adachi, K., Yagi, M., Nakamura, H., Matsuo, M. A novel cryptic exon in intron 3 of the dystrophin gene was incorporated into dystrophin mARN with a single nucleotide deletion in exon 5. J Hum Genet 47, 196-201, (2002). 8. Sutton, R. E., Boothroyd, J. C. Evidence for trans-splicing in trypanosomes. Cell 47, 527-535, (1986). Summary Repeating exon 2 mutation caused by trans-splicing dystrophin gene in Duchenne muscular dystrophin (DMD) patient The Dystrophin gene is the largest human gene, mutations in this gene cause Duchenne muscular dystrophin (DMD) disease. This is complex genomic unit exhibiting many errors splicing during mARN process. More than 10 alternative splicing products have been identified in the 5’ region of the dystrophin gene. In this study, two dystrophin transcripts including one containing exon 2 and exon X duplications, other one containing single exon 2 duplication were identified in peripheral blood lymphocytes of DMD case. Interestingly, genomic Southern blot analysis ruled out the hypothesis of duplication of dystrophin at exon 2. Therefore, these data suggested that exon 2 duplication transcripts were likely generated by trans-splicing event that occurring during the mARN maturation in which RNA segments of two independent transcripts are spliced together to generate a new mARN species. However, the mechanisms modulating the trans-splicing activity of the dystrophin exon 2 remain to be clarified. . 12 TCNCYH 34 (2) - 20 05 Phát hiện một trờng hợp đột biến lặp đoạn exon 2 xảy ra trong quá trình sao chép gen dystrophin ở bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne. . của exon 2 ở đầu 5 tận của gen dystrophin là do hiện tợng trans-splicing xảy ra trong quá trình sao chép của gen. Trans-splicing là một hiện tợng xảy ra