TCNCYH 38 (5) - 2005 XÂY DNG PHNG PHÁP CHN OÁN NHANH VI KHUN DCH HCH (YERSINIA PESTIS) T MU T VÀ NC NHIM KHUN Lê Thanh Hoà 1 , Nguyn Th Bích Nga 1 , Nguyn Th Ngc Dao 1 ,  Ngc Khuê 2 1 Vin Công ngh Sinh hc (Vin Khoa hc và Công ngh Vit Nam) 2 Phân Vin Công ngh mi và Bo v Môi trng (Trung tâm KHKT - CNQS), B Quc Phòng  ) . : .   Bnh dch hch là mt loi bnh truyn nhim cp tính. Vi khun d ch hch có th chn làm tác nhân khng b sinh hc. Chn đoán nhanh vi khun này t đt nc là cn thit. Vi khun dch hch cha 3 loi Plasmid đc hiu to nên các yu t đc lc gây bnh. Mc tiêu: (1) Xác đnh đ nhy và chính xác ca phn ng PCR chn đoán vi khun dch hch. (2) Thc hin phn ng PCR vi ngun khuôn là ADN tng s, ADN ca plasmid pPCP1 và vi khun nguyên vn vi đ pha loãng khác nhau (3 Gi nghim vi khun trong mu đt - nc và thc hin chn đoán nhanh bng PCR. i tng và phng pháp: Vi khun dch hch đã vô hot. ADN tng s bao gm ADN ca vi khun dch hch đc tách bng DNeasy Kit, dùng cp mi PLAF - PLAR (bám trên gen pla) đ nhân đo n gen pla có đ dài 480bp. Sau khi xác đnh đ nhy ca phn ng PCR, đ thc hin mc tiêu xây dng Kit chn đoán nhanh Y Pestis, vi khun đc hoà trong mu đt và nc theo phng pháp gi nghim đ kim nghim phn ng PCR nhm xây dng kit phát hin phân t. Kt qu Vi ADN tng s pha loãng, phn ng PCR thc hin thành công  hàm lng 0,6ng, tng đng vi 1 vi khun Y. Pestis. Vi vi khun nguyên vn (không cn tách ADN tng s), vi lng vi khun pha loãng  nng đ t 101 đn 102 (khong 100 - 10 vi khun) vn cho PCR đc hiu. Vi phng pháp gi nghim hoà vi khun vào trong mu đt, nc, PCR đc hiu vn thc hin thành công  đ pha loãng khong 1 ng ADN và 4 vi khun làm khuôn Kt lun: Nh vy, bc đu Kit chn đoán phân t vi khun d ch hch đã th  nghim thành công t các loi mu, k c t đt, nc s dng ch th gen pla ca Plasmid pPCP1. T khoá: dch hch, Yersinia pestis, plasmid pPCP1, gen pla, PCR, gi nghim. I. T VN  Vi khun dch hch (Yersinia Pestis) gây bnh nguy him cho ngi và đng vt, phân b khp th gii k c Vit Nam. Vùng Tây Nguyên và Duyên Hi min Trung Vit Nam, cho đn nay, vn có nhiu trng hp b dch hch, do vy, loi vi khun nguy him này vn là mi đe do sc kho cng đng [3,4]. Dch hch do b chét và loài gm nhm làm môi gii truyn lây gây bnh, và t n ti lu cu trong đt và nc, to nên ngun lây sang ngi. Có 3 loi plasmid mà vi khun này s hu bao gm, plasmid CD1 (chung vi Y. pseudotuberculosis và Y. enterocolitica); plasmid MT1 và pPCP1 (là 2 loi riêng ca Y. Pestis) [1]. Chn đoán nhanh vi khun dch hch không có gì khác là da vào phn ng PCR, s dng các gen đc lc ca các loi plasmid này làm ch th di truyn phân t, trong đó gen pla ca pPCP1 đc coi là tin tng nht [2,7]. Y. pestis phân lp  Vit Nam đã đc chính th c giám đnh, s dng gen pla, gii trình và phân tích trình t ca gen này và đng ký Ngân hàng Gen s AY305870 [2]. Plasmid đc lc pPCP1 ca vi khun dch hch Vit Nam có mc đ bo tn tuyt đi v thành phn nucleotit ca h gen, ít nht là qua so sánh 480 nucleotit ca phân đon gen pla, vi các chng KIM5; CO92 [8,9] và mt s chng ca n , th hin tính gây bnh thng nht toàn cu ca loài vi khun này [2]. M c tiêu: 1. Xác đnh đ nhy và chính xác ca phn ng PCR chn đoán vi khun d ch hch. 2. Thc hin phn ng PCR vi ngun khuôn là ADN tng s, ADN ca plasmid pPCP1 và vi khun nguyên vn vi đ pha loãng khác nhau. 1 TCNCYH 38 (5) - 2005 3. Gi nghim vi khun trong mu đt - nc và thc hin chn đoán nhanh bng PCR. II. I TNG VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU Vi khun dch hch Vit Nam Vi khun dch hch Vit Nam  dng môi trng nuôi cy và đã b vô hot qua nhit  100 0 C, do B môn Vi sinh vt, Trng i hc Y Hà Ni cung cp. Môi trng vi khun vô hot này đc bo qun  –20 0 C, cho đn khi s dng. Tách chit ADN tng s và ADN ca plasmid pPCP1 ADN tng s, là toàn b ADN có mt trong t bào vi khun bao gm ca vi khun và ca plasmid, đc tách chit bng b hoá cht là DNeasy kit ca Hãng Qiagen. Ly 200µl môi trng vi khun đã vô hot, ly tâm thu cn t bào. Dung gii, tinh sch và ly chit ADN bng các dung dch ca b kit theo hng dn, cui cùng thu ADN tng s và bo qun  –20 0 C, cho đn khi s dng. ADN ca plasmid pPCP1, đc thu nhn bng mt phng pháp khác, là s dng b hoá cht QiaPrep Spin Mini Kit ca Hãng Qiagen. V nguyên tc, hàm lng ADN thu đc ch cha ADN ca plasmid pPCP1; và nh vy s làm khuôn chc chn cho phn ng nhân đon gen pla trong h gen ca plasmid này. ADN thu đc bng các phng pháp trên đc kim tra trên thch agarose 0,8%, tính toán hàm lng cn thit cho phn ng PCR, và bo qun  –20 0 C cho đn khi s dng. Mt cách khác cung cp khuôn cho phn ng PCR là s dng nguyên vn vi khun, do trong quá trình phn ng t bào b bung ra gii phóng ADN (k c ADN ca plasmid) làm khuôn thc hin phn ng [2].  thc hin chn đoán nhanh, chúng tôi hoà loãng vi khun trong các mu đt và nc trc đó đã kim tra không có vi khun dch hch bng phng pháp nuôi cy và PCR, gi nghim nh là m u thu đc t hin trng. Sau đó, mu gi nghim đc s dng tách chit ADN tng s và thc hin phn ng PCR. Thc hin phn ng PCR: Phn ng PCR đc thc hin 1 chu k trong 5 phút  95 0 C; 35 chu k (95 0 C: 1 phút; 51 0 C: 1 phút; 72 0 C: 2 phút) và 1 chu k cui cùng  72 0 C trong 10 phút. Vi mi xuôi là PLAF (5'ATCTTACTTTCCGTGAGAAG3') và mi ngc là PLAR (5’ CTTGGATGTTGAGCTTCCTA 3'), phn ng PCR cho sn phm là đon ADN có đ dài 480bp nm trong cu trúc ca gen pla [6]. Sn phm PCR ca Y. pestis Vit Nam đc dòng hoá vào plasmid vect có tên gi là pCR2.1 (Invitrogen Inc.), sau khi tinh sch bng b hoá cht QiaQuick Purification Kit (Qiagen Inc.). Plasmid tái t hp đc chn lc theo qui trình (xem [10]). ADN ca plasmid tái t hp đc tách chit bng Kit ca Qiagen (QiaPrep Spin Mini Kit).  dài ca đon gen pla có trong plasmid tái t hp đc ki m tra trên thch 0,8%, sau khi x lý bng enzym gii hn EcoRI. 0.56kb 2.3kb 2.0bp 123M 480bp B trí thí nghim: Kho sát đ nhy ca PCR vi đ pha loãng cao nht có th thc hin đc: ADN tng s sau khi tách chit và kim tra hàm lng, đc pha  nng đ gc 100ng/µl. T nng đ này, ADN tng s đc pha loãng theo c s 2, gp đôi liên tc, tc là: 100ng/µl; 50ng/µl; 25ng/µl; 12,5ng/µl; 6,25ng/µl; 3,125ng/µl Vi các đ pha loãng khác nhau nh th này, 1µl ca mi mt nng đ đc s dng cho phn  ng PCR vi cp mi PLAF - PLAR, thc hin theo qui trình  mc 3. Gi nghim pha loãng vi khun vô hot trong mu đt - nc và thc hin phn ng PCR: Vi khun đc pha  nng đ gc 1000 vi khun/µl trong mu hn hp đt-nc ly t t nhiên, sau đó đc pha loãng liên tc theo c s 2. Vi các đ pha loãng khác nhau nh th này, 1 µl ca mi mt nng đ đc s dng cho phn ng PCR vi cp mi PLAF - PLAR, thc hin theo qui trình mô t  trên. 2 TCNCYH 38 (5) - 2005 III. KT QU Kt qu kho nghim đ nhy phn ng PCR vi các ngun ADN làm khuôn khác nhau. T 3 loi khuôn là ADN tng s đã đc tách chit, ADN ca plasmid pPCP1 và vi khun nguyên vn t bào, vi cp mi đc hiu PLAF - PLAR, phn ng PCR thc hin thành công, nhân mt đon gen pla ca plasmid pPCP1 có đ dài 480 bp (hình 1). Sau khi dòng hoá và gii trình trình t thu nhn chui nucleotit, chui này đc đa vào truy cp Ngân hàng Gen, s dng ch ng trình BLAST  đa ch: (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ) kt qu truy cp gii thiu  hình 2. Hình 1. Kt qu phn ng PCR thu nhn sn phm đon gen pla t vi khun dch hch phân lp  Vit Nam Ghi chú: M: Ch th ADN,  đây dùng ADN ca thc khun th Lambda ct bng enzym gii hn HindIII. Sn phm PCR có đ dài 480 bp, s dng cp mi PLAF - PLAR, vi các cách x lý ADN làm khuôn khác nhau: s 1: T ADN tng s ca vi khun; s 2: T ADN plasmid pPCP1 tách chit t vi khun; s 3: T vi khun nguyên  bào (không tách chit ADN). t  nhy ca phn ng PCR vi đ pha loãng cao nht, đã đc thc hin thành công, vi đ pha loãng cao nht ca các loi khuôn, sau khi tính toán, nh sau: - Vi khuôn là ADN tng s: Phn ng thc hin đc  nng đ là 0,6ng, tng đng vi 1 vi khun Y. Pestis. - Vi khuôn là ADN ca plasmid pPCP1: Phn ng thc hin đc  nng đ là 0,2ng; - Vi khuôn là vi khun nguyên vn (không cn tách ADN tng s): Phn ng thc hin đc  nng đ vi lng vi khun là khong 5 - 10 vi khun. - Tin hành pha loãng các loi khuôn và thc hin phn ng PCR và nhn thy, PCR đc hiu vn thc hin thành công  đ pha long rt cao, tng đng vi hàm lng khuôn ADN tng s là 0,1ng - 0,6ng/phn ng. S đng ký Ngân hàng Gen Tên loài có kt qu tng đng H s Giá tr 3 TCNCYH 38 (5) - 2005 gi|48629|emb|X15136.1|YPPLA Y.pestis plasmid pKYP1 pla gene 952 0.0 gi|5763810|emb|AL109969.1|YPPCP1 Yersinia pestis plasmid pPCP1 952 0.0 gi|2996216|gb|AF053945.1|AF053945 Yersinia pestis plasmid p 952 0.0 gi|155524|gb|M27820.1|YEPTPA Yersinia pestis plasminogen ac 936 0.0 gi|23194196|gb|AF528089.1| Yersinia pestis isolate assc Pla 872 0.0 gi|23194194|gb|AF528088.1| Yersinia pestis isolate pusc Pla 872 0.0 gi|23194192|gb|AF528087.1| Yersinia pestis isolate suau Pla 872 0.0 gi|23194190|gb|AF528086.1| Yersinia pestis isolate sull Pla 872 0.0 gi|23194188|gb|AF528085.1| Yersinia pestis isolate nabc Pla 872 0.0 gi|23194186|gb|AF528084.1| Yersinia pestis isolate nasp Pla 872 0.0 gi|23194184|gb|AF528083.1| Yersinia pestis isolate ansp Pla 872 0.0 gi|23194182|gb|AF528082.1| Yersinia pestis isolate anbc Pla 872 0.0 Hình 2. Kt qu truy cp Ngân hàng Gen s dng chui nucleotit ca gen pla thu nhn t vi khun dch hch Vit Nam đã đc xác đnh vi h s đng nht 100% vi gen pla ca plasmid pPCP1 ca vi khun dch hch (Yersinia Pestis) th gii. Ghi chú: Phn mm s dng là chng trình BLAST ca NCBI (Dãy s và ký t bên trái là s đng ký;  gia là tên loài; hai dãy cui cho bit mc đ chính xác ca kt qu phân tích sinh - tin hc t ong chng trình BLAST. r Kt qu phn ng PCR vi ngun khuôn là vi khun dch hch gi nghim pha loãng trong mu đt - nc. 123456789M Hình 3. Kt qu phn ng PCR thu nhn sn phm đon gen pla t khuôn là ADN tng s đã pha loãng Ghi chú: M: Ch th ADN,  đây dùng ADN ca thc khun th Lambda ct bng enzym gii hn HindIII. Sn phm PCR có đ dài 480bp, s dng cp mi PLAF - PLAR. ng chy 1 - 9: sn phm PCR, 4 TCNCYH 38 (5) - 2005 ( vi khuôn pha long gp đôi t s 1 (1000 vi khun); đn đng s 9 (khong 4 vi khun) vn có sn phm PCR dng tính mi tên ch dn) Vi kt qu kho sát đ nhy phn ng PCR đã đt đc, chúng tôi thy có th xây dng phng pháp chn đoán nhanh vi khun dch hch có ngun lây trong thiên nhiên. Vì an toàn sinh hc, mu vi khun nghiên cu chúng tôi đang có đã b vô hot, hn na không th phân lp trong t nhiên và duy trì loi vi khun này  phòng thí nghim ca chúng tôi, do vy, chúng tôi đ xut xây dng chn đoán nhanh bng ph ng pháp gi nghim. Thc cht ca phng pháp này là pha vi khun dch hch vô hot vào trong hn hp đt - nc ly t thiên nhiên, vi nng đ gc có s lng ban đu là 1000 vi khun/µl; sau đó pha loãng tip theo c s 2 liên tc: 1) 1000 vi khun/µl; 2) 500 vi khun/µl; 3) 250 vi khun/µl; 4) 125 vi khun/µl; 5) 62,5 vi khun/µl; 6) 31,25 vi khun/µl; 7) 15,625 vi khun/µl; 8) 7,8125 vi khun/µl; 9) 3,90625 vi khun/µl; 10) 1,953125 vi khun/µl. Vi khuôn là 1µl  mi nng đ pha loãng, chúng tôi ti n hành phn ng PCR đc hiu trên gen pla, vi cp mi PLAF - PLAR. Hình nh sn phm PCR thc hin thành công  các nng đ pha loãng đc trình bày  hình 3. Sn phm ca phn ng PCR nhìn thy rt rõ  các đng chy s 1 - 7; và vn phát hin đc  đng chy s 9, vi nng đ pha loãng 9 ln theo c s 2 t 1000 vi khun ban đu; tng đng v i 4 vi khun làm khuôn (đng chy s 9, hình 3). IV. BÀN LUN Do thành phn cp mi PLAF - PLAR đc thit k da trên chui gen pla, gen đc hiu riêng ca plasmid pPCP1, mà plasmid này li thuc s hu duy nht ca vi khun dch hch Yersinia pestis, cho nên tính đc hiu ca cp mi này là rt cao. iu này đc chng minh bng kt qu ca chúng tôi là phn ng PCR vi cp mi PLAF - PLAR là ht sc đc hiu và rt nhy, đc thc hin thành công ngay c khi vi lng ADN (các loi) có hàm lng rt thp, 0,1 - 0,6ng hay khong 1 - 10 vi khun nguyên vn làm khuôn. Mc dù đc pha loãng vào trong đt và nc và thc hin phn ng PCR, trong môi trng đt - nc gi nghim có vi khun dch hch nh th này,  nng đ pha loãng vi s lng ch cn khong 4 vi khun làm khuôn, phn ng PCR chn đoán s có mt ca chúng vn cho kt qu dng tính. Chúng tôi cho rng, vic chn đoán mt loi vi sinh vt gây bnh có s hu plasmid đc lc nh vi khun dch hch vi pPCP1, phng pháp tt nht và chính xác nht vn là phát hin gen “đc lc” ca chúng nm trên loi plasmid đó. Phng pháp ca chúng tôi phù hp vi đnh hng chn đoán trc tip bng PCR trên các gen “đc lc” ca các plasmid c ng sinh  vi khun gây bnh, đã đc thc hin trong nhng nm gn đây trên th gii [5,11]. V. KT LUN Vi ngun làm khuôn là ADN hn hp (ADN tng s); ADN ca plasmid tách riêng hay nguyên vn t bào vi khun không cn tách chit, phn ng PCR vn cho kt qu ht sc đc hiu, to c s xây dng phng pháp chn đoán nhanh và chính xác. Phn ng PCR đc hiu, cho phép thu nhn đc đon gen pla có đ dài 480 cp nucleotit có ngun gc t plasmid pPCP1 ca vi khun dch hch phân lp t i Vit Nam. Gi nghim hn hp vi khun vi đt - nc, phn ng PCR vn cho kt qu dng tính  đ pha loãng cao, cha s lng vi khun khong 4 vi khun làm khuôn trong 1 phn ng. T kt qu gi nghim chúng tôi khng đnh phng pháp chn đoán nhanh vi khun dch hch t đt - nc và môi trng nhim khun thc hin nhanh, chính xác, phát hin trc tip vi khun  s lng rt thp (4 - 10 vi khun) mà không cn thit nuôi cy và tách chit ADN. TÀI LIU THAM KHO 1. ào Xuân Vinh (1989). c đim sinh hc ca các chng vi khun dch hch phân lp  Tây Nguyên, Lun án PTS. Y hc, Trng i hc Y Hà Ni. 2. ào Xuân Vinh, Chu M.C. và cs. (2002). "Bc đu nghiên cu DNA ca mt s chng Y. pestis phân lp ti Tây Nguyên bng enzym ct đon (Restriction)". Tp chí Y hc thc hành, s 10 (432 + 433), tr. 29 - 31. 3. Lê Thanh Hoà (2003a). “Các loi plasmid ca vi khun dch hch (Yersinia Pestis) và ng 5 TCNCYH 38 (5) - 2005 dng chn đoán phân t ti Vit Nam”, tr 69 - 78. Sách: "T khoa hc sinh hc phân t đn cuc sng và chm sóc sc kho". Báo cáo khoa hc Hi ngh Sinh hc phân t và Hoá sinh toàn quc. Hà Ni, 22 - 24/10/2003. Nhà xut bn Nông nghip, Hà Ni, Vit Nam, 384 trang. 4. Lê Thanh Hoà (2003b). Giám đnh phân t vi khun gây bnh dch hch Yersinia pestis (Lehmann and Neumann 1896) phân lp ti Vit Nam s dng gen pla ca plasmid pPCP1. Tp chí Y hc Vit Nam, 283(4): 1 - 11. 5. Chu, M.C. (2000). Laboratory Manual of Plague Diagnostic Test CDC, 3rd edition, WHO, pp. 67 - 89. 6. Engelthaler, D. M., Hinnebusch, B. J., Rittner, C. M., Gage, K. L. (2000). Quantitative competitive PCR as a technique for exploring Flea - Yersina pestis dynamics. Am J Trop Med Hyg. 62(5): 552 - 560. 7. Hu, P., Elliott, J., McCready, P., Skowronski, E., Garnes, J., Kobayashi, A. Brubaker, R.R, and Garcia, E. (1998). Structural organization of virulence - associated plasmids of Yersinia pestis. J. Bacteriol. 180 (19): 5192 - 5202. 8. Parkhill, J., Wren, B. W., Thompson, N.R. và cng s. (2001). Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague. Nature 413, 523 - 527. 9. Perry, R. D., Straley, S. C., Fetherston, J. D., Rose, D. J., Gregor, J. and Blattner, F. R. (1998). DNA sequencing and analysis of the low - Ca2 + - response plasmid pCD1 of Yersinia pestis KIM5. Infect Immun. 66 (10): 4611 - 4623. 10. Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (3rd ed.) Cold Springs Harbor Press, Cold Springs Harbor N.Y 11. Tsukano, H., Itoh, K., Suzuki, S., Watanabe, H. (1996). Detection and identification of Yersinia pestis by polymerase chain reaction (PCR) using multiplex primers. Microbiol. Immunol. 40(10): 773 - 775. Summary MOLECULAR APPROACH FOR RAPID DIAGNOSTIC KIT TO DETECT YERSINIA PESTIS FROM INFECTED SOIL - WATER SAMPLE Yersinia pestis is the cause for the acute infection and may be chosen for biological terrorism. Rapid diagnosis of this agent from infected soil - water is essential. Y. pestis habours 3 specific plasmids providing virulent factors to the bacterium. Objectives: (1) Testing the sensitivity and accurateness of PCR for Y. pestis. (2) Carrying out PCR using total genomic DNA serially diluted as a template. (3) Undertaking PCR on artificical experimentation by diluting Y. pestis in soil water as samples to test PCR – based fast diagnostic approach. Methods: Yersinia pestis (inactivated) was used. Genomic DNA was extracted by DNeasy kit (Qiagen Inc). Using primer - pairs PLAF - PLAR (binding on pla gene of plasmid pPCP1) a specific product of PCR was 480 bp. After determination of the PCR sensitivity, a molecular - based diagnostic kit was developed. Sensitivity and specificity of this kit was tested by PCR using diluted genomic DNA and bacterium itself; and mix of these templates in water and soil as samples. Results: With the diluted genomic DNA, it was successful to obtain specific PCR with 0,6ng template, which is equal to a single bacterium. Additionally, successful PCR amplification was obtained using the whole bacterium (without extraction of genomic DNA) and diluted quantity ranging from 101 to 102. Based on these results, the bacterium was artificially diluted with sample of soil - water as a natural isolate for PCR amplification. As a result, specific PCR product was obtained by 1 ng genomic and 4 bacteria per template. Conclusions: Evidently, approach for PCR - based diagnostic kit was successfully carried out from any template including soil - water samples with high fidelity, using the pla gene genetic marker of pPCP1 of Y. pestis. Keywords: plague, Yersinia pestis, plasmid pPCP1, gen pla, PCR, artificial experimentation. 6 . nghim vi khun trong mu đt - nc và thc hin chn đoán nhanh bng PCR. II. I TNG VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU Vi khun dch hch Vi t Nam Vi. loãng khác nhau (3 Gi nghim vi khun trong mu đt - nc và thc hin chn đoán nhanh bng PCR. i tng và phng pháp: Vi khun dch hch đã vô hot.