Đang tải... (xem toàn văn)
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM SALMONELLA TYPHI TP HỒ CHÍ MINH, 2021 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, trước hết chúng.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM SALMONELLA TYPHI TP HỒ CHÍ MINH, 2021 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, trước hết chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Thành Luân khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm Tp Hồ Chí Minh truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho chúng em suốt trình học tập rèn luyện trường Dù cố gắng khơng thể tránh khỏi sai sót Rất mong thơng cảm đóng góp ý kiến q thầy bạn để khóa luận hồn thiện Cuối cùng, xin kính chúc thầy bạn sức khỏe, thành công công việc sống Chúng em xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, tháng 09, năm 2021 SVTH MỤC LỤ PHIẾU GIAO NHIỆM VỤ .iii BẢN NHẬN XÉT CỦA GVHD iv LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH ẢNH .iv DANH MỤC BẢNG BIỂU .vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Nêu đôi nét salmonella ( Đặc điêm, độc tố, ngộ độc, nguồn lây nhiễm, biện pháp phòng ngừa) 1.1.1 Đặc điểm hình thái Salmonella typhi .3 1.1.2 Độc tố: .3 1.1.3 Các nguồn lây nhiễm: 1.1.4 Triệu chứng: 1.1.5 Biện pháp phòng ngừa .5 1.2 Tầm quan trọng S typhi 1.3 Vì phải sử dụng phương pháp phân tích Salmonella Typhy khác nhau.6 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 2.1 Nghiên cứu 1: Enrichment-ELISA để phát Salmonella typhi từ thực phẩm nước 2.1.1 Nội dung nghiên cứu: 2.1.2 Kết nghiên cứu: 2.2 Nghiên cứu 2: Phát nhanh vi khuẩn Salmonella typhi trứng bị ô nhiễm cách sử dụng RT - PCR 11 2.2.1 Tổng quan: .11 2.2.2 Nguyên liệu nghiên cứu 12 2.2.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu .12 2.2.4 Kết 13 2.3 Nghiên cứu 3: Phát trực tiếp Salmonella typhi sản phẩm tươi sống cách sử dụng cảm biến sinh học từ tính đàn hồi dựa phage 15 2.3.1 Vật liệu phương pháp .16 2.4 Nghiên cứu 4: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Multiplex Pcr phát vi khuẩn Salmonella sp.s enterica gây ngộ độc thực phẩm 19 2.4.1 Nội dung nghiên cứu .19 2.4.2 Nguyên liệu nghiên cứu 19 2.4.3 Phương pháp xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR loại vikhuẩn Salmonella sp Staphylococcus aureus 19 2.4.4 Kết nghiên cứu 20 2.4.5 Đề xuất quy trình multiplex PCR cặp mồi để phát nhanh đồng thời vi khuẩn Salmonella sp Staphylococcus aureus thực phẩm gen invasive gen nuclease 21 2.4.6 KẾT LUẬN 22 2.5 Nghiên cứu 5: Phương pháp lai huỳnh quang chỗ (FISH) để phát nhanh Salmonella thịt cừu băm nhỏ 23 2.5.1 Đầu dò Oligonucleotide 23 2.5.2 FISH protocol 23 2.5.3 Hiệu FISH .24 2.5.4 Phát vi khuẩn Salmonella thịt cừu băm nhỏ 24 2.5.5 Kết nghiên cứu 25 CHƯƠNG KIẾN NGHỊ .26 3.1 Nhận định phương pháp Enrichment-ELISA để phát Salmonella typhi 26 3.2 Nhận định phương pháp RT - PCR 26 3.3 Nhận định phương pháp sử dụng cảm biến sinh học từ tính đàn hồi dựa phage 26 3.4 Nhận định phương pháp Multiplex Pcr .27 3.5 Nhận định phương pháp lai huỳnh quang chỗ (FISH) 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO .28 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình chụp salmonella ( nhuộm màu đỏ) kính hiển vi Hình 2.1 Độ nhạy phương pháp sandwich ELISA kháng thể kép để phát S typhi (Đường ngang thể giá trị ngưỡng cho sELISA) 10 Hình 2.2 Kết tối ưu hóa nhiệt độ ủ mồi gen fimC S Typhi 14 Hình 2.3 Đường cong khuếch đại nuôi cấy dự trữ vi khuẩn Salmonella typhi với mẫu DNA nồng độ 56 nanogam đối chứng âm tính 14 Hình 2.4 Đường cong nóng chảy (melting curve) Salmonella typhi ni cấy với mẫu DNA 56 nanogam 15 Hình 2.5 Đường cong khuếch đại đường cong kiểm tra độ nhạy gen fimC Salmonella typhi 15 Hình 2.6 Đường cong khuếch đại đường cong nóng chảy đánh giá xác nhận fimC-F (mồi thuận) fimC-R (mồi ngược) Salmonella Typhi với ba mẫu trứng 15 Hình 2.7 Sơ đồ quy trình sử dụng để phát trực tiếp Salmonella typhi bề mặt cà chua cảm biến sinh học ME 17 Hình 2.8 Hiển thị số lượng lớn tế bào Salmonella bề mặt cảm biến 17 Hình 2.9 ảnh SEM hiển thị số lượng giới hạn nhỏ hơnSalmonella tế bào đến bề mặt cảm biến 18 Hình 2.10 Ảnh chụp SEMphotomicrograph bề mặt cà chua có gai Salmonella 18 Hình 2.11 Sự thay đổi đo tần số cộng hưởng cảm biến sinh học ME cảm biến điều khiển sau tiếp xúc với bề mặt cà chua tăng đột biến với nồng độ khác Salmonella 18 Hình 2.12 Kết điện di kiểm tra mật độ tế bào Salmonella sp Staphylococcus aureus ni cấy phát phản ứng multiplex PCR 21 Hình 2.13 Kết phản ứng multiplex PCR phát đồng thời Salmonella sp Staphylococcus aureus .21 Hình 2.14.Tế bào S Typhi nhuộm DAPI mức độ ô nhiễm nhân tạo khác 24 Hình 2.15 Tế bào S Typhi phát đầu dị Salm63 mức độ nhiễm nhân tạo khác 25 DANH MỤC BẢNG BIỂU BẢNG 2.1 Định lượng S typhi môi trường tiền tăng sinh khác để phát sELISA 10 BẢNG 2.2 Định lượng S typhi chất lỏngtăng sinh khác để phát sELISA 10 BẢNG Phát S typhi mẫu thực phẩm khác EnrichmentELISA 11 Bảng 2.4 Độ tinh khiết nồng độ DNA phân lập mẫu nuôi cấy gốc mẫu trứng bị nhiễm vi khuẩn Salmonella typhi 13 Bảng 2.5 Mật độ tế bào Salmonella sp Và Staphylococcus aureus ni cấycó thể phát phản ứng multiplex PCR 20 Bảng 2.6 Trình tự Oligonucleotide mẫu dò Salm63 22 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày nay, xã hội phát triển nhu cầu chất dinh dưỡng cao, màu sắc thực phẩm cải thiện nhằm tăng giá trị cảm quan cho thực phẩm Vệ sinh thực phẩm vấn đề ưu tiên hàng đầu nước ta giới Thực phẩm không đảm bảo vệ sinh gây bệnh ảnh hưởng lâu dài đến sức khỏe người tiêu dùng Đặc biệc thịt, cá, rau… chợ số cửa hàng khác có nguy nhiễm bẩn gây ngộ độc cho người tiêu dùng Đa số vụ ngộ độc vi sinh vật gây Có nhiều báo, phóng nói nói nguy hiểm, hậu Nhưng tình trạng ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng Các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm thường Clostridium botinium, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa … Nhưng Salmonella đặc biệt vi khuẩn Salmonella typhi nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Salmonella typhi xâm nhập vào thể người thơng qua sản phẩm thịt, cá,… mang Khi vào thể vi khuẩn gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người Ngoài tiêu chuẩn nước ta nước quy định chặt chẽ xuất Salmonella typhi thực phẩm Đặc biệt sản phẩm sữa, thịt, phomat,… Nếu có mặt Salmonella typhi khơng chấp nhận Theo tơng tư 05/2012/TT-BYT Chính cần có nhiều kỹ thuật phân tích Salmonella typhi để xác định xác khách quan Xuất phát từ mong muốn biết thêm Salmonella typhi chất độc, thực phẩm thường nhiễm, phương phương pháp định danh định tính … Nên nhóm định làm đề tài “Salmonella typhi” để tìm hiểu rõ Mục tiêu đề tài Tìm hiểu sơ S typhi Biết phương pháp dùng để xác định S typhi Nội dung nghiên cứu Tìm hiểu S typhi Các phương pháp dùng xác định S typhi Bố cục luận văn gồm có phần Phần 1: Mở đầu: trang đến trang Phần 2: Tổng quan: từ trang đến trang Phần 3: Phương pháp nghiên cứu: từ trang đến trang 25 Phần 4: Kết bàn luận: từ trang 50 đến trang 68 Phần 5: Kết luận kiến nghị: trang 26 đến 27 Phần 6: Tài liệu tham khảo: trang 28 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Nêu đôi nét salmonella ( Đặc điêm, độc tố, ngộ độc, nguồn lây nhiễm, biện pháp phịng ngừa) 1.1.1 Đặc điểm hình thái Salmonella typhi Salmonella trực khuẩn hình que, gram âm, khơng có nha bào, hiếu khí kỵ khí tùy tiện, chủ yếu di động, có đường kính từ 0,7-1,5 μm, chiều dài từ 2-5 μm,sinh độc tố sinh chủ yếu qua đường tiêu hóa người động vật bị nhiễm bệnh Chúng dẫn đến triệu chứng bệnh sốt thương hàn (Salmonella typhi, Salmonella paratyphi) Hình 1.1 salmonella kính Hình chụp ( nhuộm màu đỏ) hiển vi Salmonella enterica serotype typhi(Salmonella typhi),thuộc nhóm huyết D phân loài I chi Salmonella, vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, Gram âm, gây nhiễm trùng tồn thân sốt thương hàn người Các đặc điểm S typhicả kiểu gen kiểu hình giống với chi Salmonella 1.1.2 Độc tố: Độc lực S typhi phức tạp đa yếu tố Độc lực S typhi phụ thuộc vào khả xâm nhập tế bào hình thành lớp bảo vệ lipopolysaccharide (LPS), diện kháng nguyên Vi, sản xuất tiết invitro (gen xâm nhập), loại protein xâm nhập vào tế bào không phân bào, nơi vi khuẩn tồn nhân nội bào Các chủng Salmonella typhi tổng hợp hai loại tế bào phổ biến mầm bệnh đường ruột aerobactin enterochelin Sản sinh độc tố bao gồm enterotoxin, nhiều yếu tố độc lực biểu chủng S typhi Nó tạo nội độc tố có cấu trúc tương tự độc tố tả làđộc tố tế bào, tương tự độc tố ruộtdo Yersinia enterocolitica sản xuất Một yếu tố độc lực quan trọng khác biệt S typhi sản xuất kháng ngun Vi Kháng ngun Vi đóng vai trị quan trọng sinh bệnh học S typhi thời gian sống sót đại thực bào máu 1.1.3 Các nguồn lây nhiễm: Salmonella typhi mầm bệnh có đặc điểm sống mơ bạch huyết ruột non, gan, lách, máu người bị nhiễm bệnh Nó có phổ biến nước phát triển có hệ thống vệ sinh kém, thiếu thuốc kháng sinh nước châu Á, châu Mỹ Latinh, châu Phi Salmonella typhi gây bệnh thương hàn, chứng sốt bệnh tồn thân Nó lây qua đường phân - miệng, chủ yếu qua thức ăn nước bị ô nhiễm Những người bị sốt thương hàn mang vi khuẩn máu đường ruột Một số lượng nhỏ (1-5%) người khỏi bệnh tiếp tục nuôi dưỡng vi khuẩn túi mật họ ổ chứa cho mầm bệnh lại tiếp tục lây lan sang người khác Cả người bệnh người mang mầm bệnh nhiễm S typhi phân Do đó, lây nhiễmS typhi phổ biến ăn thức ăn uống đồ uống xử lý người để rơi S typhi vật dụng có chứa vi khuẩn vào nước dùng để uống rửa thực phẩm Sốt thương hàn phổ biến nơi thường xuyên rửa tay vànguồn nước có khả bị nhiễm bẩn từ cống rãnh 1.1.4 Triệu chứng: Sốt thương hàn bệnh ngấm ngầm với đặc điểm sốt, nhức đầu, táo bón, khó chịu, ớn lạnh đau có đặc điểm lâm sàng giúp phân biệt cách xác với nhiều loại bệnh truyền nhiễm khác Biểu bệnh nặng (bao gồm sốc nhiễm trùng), xuất huyết hoại tử mảng Peyer hồi tràng (PP), dẫn đến mô thủng, viêm phúc mạc, nhiễm trùng huyết tử vong Cơ chế sinh bệnh sốt thương hàn phụ thuộc vào kích thước chất cấy tế bào S typhi ăn vào, độc lực chủng, phản ứng miễn dịch vật chủ tiếp xúc trước Các triệu chứng đặc trưng bệnh thường bao gồm đột ngột sốt cao, nhức đầu buồn nôn Các triệu chứng phổ biến khác bao gồm chán ăn, tiêu chảy, đau bụng, lách to (tùy thuộc vào vị trí nó), táo bón, tiến triển thành sốt, xuất nốt đỏ thân Thời gian tiến triển đến biểu lâm sàng chậm, dao động từ đến 56 ngày, với 10–20 ngày điển hình Có thể phân lập mầm bệnh dễ dàng từ máu nước tiểu giai đoạn trước bệnh Cơn sốt kéo dài vài tuần, thời gian vi khuẩn đến túi mật nhân lên mật Nhiễm khuẩn Salmonella typhi túi mật dẫn đến tái nhiễm trùng đường ruột dịch mật giàu mầm bệnh chảy vào ruột non Từ gây viêm, loét hoại tử hồi tràng Điều thường xảy tuần thứ ba bị bệnh đánh dấu độ 59 ° C;(7) Đoạn DNA nhiệt độ 60 ° C; (8) Nhiệt độ đoạn DNA 61 ° C Hình 6.3 Đường cong khuếch đại nuôi cấy dự trữ vi khuẩn S typhi với mẫu DNA nồng độ 56 nanogam đối chứng âm tính Hình 7.4 Đường cong nóng chảy (melting curve) S typhi nuôi cấy với mẫu DNA 56 nanogam Kết cho thấy độ nhạy cặp mồi Salmonella Typhi fimC-F (mồi thuận) fimCR (mồi ngược) phát mẫu DNA có nồng độ thấp 4528 pg / μL đường cong khuếch đại nồng độ nhỏ giá trị Ct 23,90 (Hình 4) Hình 8.5 Đường cong khuếch đại đường cong kiểm tra độ nhạy gen fimC 14 Salmonella typhi Hình 9.6 Đường cong khuếch đại đường cong nóng chảy đánh giá xác nhận fimC-F (mồi thuận) fimC-R (mồi ngược) S Typhi với ba mẫu trứng 2.3 Nghiên cứu 3: Phát trực tiếp Salmonella typhi sản phẩm tươi sống cách sử dụng cảm biến sinh học từ tính đàn hồi dựa phage Cảm biến sinh học ME cảm biến khơng dây, có dao động cộng hưởng tần số cộng hưởng kích hoạt phát thông qua từ trường.Cảm biến điều khiển giống hệt với cảm biến sinh học đo lường, phage Cả hai cảm biến đo lường điều khiển bị chặn với BSA để giảm ràng buộc không xác định Tần số cộng hưởng cảm biến đo lường điều khiển đo trước sau đặt cảm biến cà chua Kính hiển vi điện tử quét (SEM) sử dụng để xác minh liên kết cụ thể S typhi 2.3.1 Vật liệu phương pháp 2.3.1.1 Chế tạo bệ cộng hưởng đàn hồi Các bệ cộng hưởng đàn hồi có kích thc bng 0,028mmì0,2mmì1mm c ch to t METGLASđhp kim 2826MB Các bệ cảm biến làm siêu âm, axeton, sau etanol, ủ 220oC trong chân không (10-3 Torr) để loại bỏ ứng suất dư Sau ủ, hai lớp mỏng phim (Cr Au) rải lên tất mặt bệ cảm biến Lớp Cr lắng để cải thiện độ bám dính bệ cộng hưởng ME lớp Au Lớp Au cung cấp lớp bảo vệ chống ăn mòn cho cộng hưởng, bề mặt tương thích sinh học để cố định phage 2.3.1.2 Sự cố định phage E2 Thực khuẩn thể cố định bệ máy cộng hưởng ME, đặt lọ chứa 300μl huyền phù phage E2 (5×1011vir/ml 1×TBS) Sau quay ủ rơto (8 vịng/phút) 1h Sau cố định, cảm biến rửa ba lần dung dịch TBS hai lần với nước cất vô trùng để loại bỏ muối thực khuẩn thể không liên kết lỏng lẻo Các cảm biến sinh học ME nhúng vào dung dịch BSA 1mg/ml giờ, sau 15 rửa nước cất.Cảm biến điều khiển giống hệt cảm biến sinh học đo lường ngoại trừ thiếu lớp phủ E2 phage, hai xử lý BSA 2.3.1.3 Phát trực tiếp vi khuẩn Salmonella bề mặt cà chua S typhi mẫu cấy thu từ phịng thí nghiệm cung cấp dạng huyền phù nồng độ 5×108 CFU/ml Các huyền phù pha lỗng nước cẩn thận để chuẩn bị cho huyền phùvới nồng độ từ 5×101 đến 5×107 CFU/ml Tất giải pháp thử nghiệm chuẩn bị ngày với thử nghiệm cảm biến sinh học, lưu trữ 4◦C cân nhiệt độ phòng nồi cách thủy trước thí nghiệm Hình 10.7 Sơ đồ quy trình sử dụng để phát trực tiếp S typhi bề mặt cà chua cảm biến sinh học ME Đường cong tần số cộng hưởng cho cảm biến sinh học ME cảm biến điều khiển sau tiếp xúc với bề mặt cà chua có gai hình ảnh SEM tương ứng bề mặt cảm biến sinh học: (a) Cà chua có 5×108 CFU/ml 16 Hình 11.8 Hiển thị số lượng lớn tế bào Salmonella bề mặt cảm biến (b) Cà chua có 5×106 CFU/ml \ Hình 12.9 ảnh SEM hiển thị số lượng giới hạn nhỏ Salmonella tế bào đến bề mặt cảm biến (c) Cảm biến điều khiển tiếp xúc với cà chua có gai 5×10 CFU/ml Lưu ý liên kết Kết Do phân bố không đồng Salmonella tế bào bề mặt cà chua, cảm biến tiếp xúc với tế bào, số lượng tế bào liên kết phụ thuộc vào vị trí mà cảm biến rơi bề mặt cà chua Điều có nghĩa phản ứng cảm biến sinh học đặt bề mặt cà chua khơng đưa dấu hiệu xác việc cà chua có bị nhiễm hay khơng Do đó, cần phải áp dụng nhiềucảm biến sinh học ME cho vùng khác cà chua 17 Hình 13.10 Ảnh chụp SEMphotomicrograph bề mặt cà chua có gai Salmonella Nồng độ (a) 5×108 CFU/ml, (b) 5×106 CFU/ml (c) 5×103 CFU/ml, (d) bề mặt cà chua tươi Sự phân bố củaSalmonella tế bào bề mặt cà chua trở nên không đồng nồng độ giảm Chú thích: Sự thay đổi tần số cộng hưởng cảm biến sinh học ME đo lường Sự thay đổi tần số cộng hưởng cảm biến điều khiển Hình 14.11 Sự thay đổi đo tần số cộng hưởng cảm biến sinh học ME cảm biến điều khiển sau tiếp xúc với bề mặt cà chua tăng đột biến với nồng độ khác Salmonella Đối với nồng độ 5×102 CFU/ml cao hơn, đo khác biệt thống kê (> 80%) cảm biến kiểm soát đo lường, cho thấy cà chua bị nhiễm bẩn xác định Kết luận Bề mặt cà chua có gai với chất huyền phù chứa Salmonella với nồng độ từ 5×101 đến 5×108 CFU/ml Salmonella bề mặt cà chua trở nên không đồng nồng độ dung dịch chiết xuất giảm Sự thay đổi tần số cộng hưởng cảm biến sinh học đo lường, thay đổi tần số cộng hưởng cảm biến điều khiển không đáng kể Hình ảnh SEM xác minh thay đổi tần số cảm biến đo lường phù hợp với ràng buộc cụ thể Salmonella vi khuẩn đến bề mặt cảm biến sinh học 18 2.4 Nghiên cứu 4: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Multiplex Pcr phát vi khuẩn Salmonella sp.s enterica gây ngộ độc thực phẩm 2.4.1 Nội dung nghiên cứu Theo nghiên cứu Freitas cộng vào năm 2010 sử dụng phương pháp multiplex PCR để phát nhanh diện vi khuẩn S enteritidis S typhinurium xuất thịt gia cầm thơng qua gen xâm lấn invA [1] Do đó, nghiên cứu nhằm hướng đến việc xây dựng quy trình phát nhanh vi khuẩn Salmonella sp Staphylococcus aureus kỹ thuật multiplex PCR, tìm kiếm phương pháp sử dụng mồi đặc hiệu tối ưu nhận diện đoạn gen đặc hiệu invA nuclease đểphát gen gây độc vi khuẩn Salmonella sp Staphylococcus aureus Đây cho kỹ thuật ứng dụng cách nhanh chóng đơn giản, có độ nhạy cao Nó đồng thời khuếch đại hai hay nhiều chuỗi gen phản ứng tương tự nhằm phát loạt tác nhân gây bệnh phép phân tích 2.4.2 Nguyên liệu nghiên cứu Các loại thực phẩm tươi sống thịt gia cầm thịt gà, thịt động vật thịt bò, trứng sò huyết bày bán chợ lại không đảm bảo chất lượng vệ sinh.Trong số nhóm có nguy tạp nhiễm cao, nhóm vi khuẩnđược nghi ngờ nhiễm nhiều làCampylobacter, Coliforms, Vibrio spp Staphylococcus sp.Salmonella, Escherichia coli Chúng thường ý xuất thường xuyên thực phẩm Đặc biệt nhóm vi khuẩn Salmonella sp Staphylococcus aureus ví dụ điển hình cho vi khuẩn Gram âm Gram dương gây bệnh phổ biến có nguy cao dẫn đến việc kháng kháng sinh điều trị bệnh truyền nhiễm 2.4.3 Phương pháp xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR loại vikhuẩn Salmonella sp Staphylococcus aureus DNA tổng số tách chiết từ vi khuẩn Salmonella sp Staphylococcus aureus có nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8 thường sử dụng làm khuôn cho phản ứng multiplexPCR Ngưỡng phát phản ứng xác định nồng độ DNA thấp mà cho phép hình thành vạch sản phẩm PCR xuất hình ảnh điện di Phản ứng multiplex PCR xem dương tính (+) xuất hai vạch sản phẩm PCR 284bp 439bp điện di gel agarose 1% 2.4.4 Kết nghiên cứu Qua nghiên cứu cho thấy ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR xác định nồng độ DNA đạt mức thấp 300 CFU/mL Salmonella sp Và đạt 70 CFU/mL S aureus mà cho phép nhận diện sản phẩm khuếch đại DNA từ phản ứng PCR qua điện di agarose 1% Khi nồng độ khuôn Salmonella 19 sp giảm đến mức 30 CFU/mL nồng độ S aureus giảm xuống mức CFU/mL sản phẩm PCR khơng cịn xuất ảnhđiện di giếng số Đó giới hạn phát Salmonella sp S aureus Có thể xem việc nhận diện tối thiểu phương pháp với Salmonella sp nên dùng mức 300 CFU/mL trở lên 70 CFU/mL S aureus Bảng 15.5 Mật độ tế bào Salmonella sp Và S aureus ni cấycó thể phát phản ứng multiplex PCR +: phản ứng dương tính -: phản ứng âm tính Hình 16.12 Kết điện di kiểm tra mật độ tế bào Salmonella sp S aureus nuôi cấy phát phản ứng multiplex PCR M: thang chuẩn HypperLadder DNA kb Giếng số 1: kiểm tra âm tính, giếng 2-8 tương ứng với nồng độ vi khuẩn Salmonella sp 2.4.5 Đề xuất quy trình multiplex PCR cặp mồi để phát nhanh đồng thời vi khuẩn Salmonella sp Staphylococcus aureus thực phẩm gen invasive gen nuclease Thông qua thông số thiết lập trên, quy trình multiplex PCR phát đồng thời Salmonella sp Staphylococcus aureus thực phẩm đề xuất sau: quy trình thực phản ứng multiplex PCR 25 µL/30 chu kỳ nhiệt phản 20 ứng với 1,5 µL 10X PCR buffer, 1,5 µL MgCl2 25 mM, dNTPs 2,5 mM, µL nồng độ mồi invA-F/R 10 µM, µL nồng độ mồi nuc-F/R 10 µM, 0,2 µL Taq Polymerase U/mL, DNA khn 10 µL Hình 17.13 Kết phản ứng multiplex PCR phát đồng thời Salmonella sp S aureus M: thang chuẩn DNA 100 bp Giếng số 1: kết dương tính Staphylococcus aureus Giếng số 2: kết dương tính Salmonella sp Giếng số 3: kết âm tính Salmonella sp Giếng số 4: kết dương tính với Salmonella sp Staphylococcus aureus Chu trình nhiệt phản ứng PCR bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu (ở mức nhiệt độ 95 °C vòng phút), giai đoạn khuếch đại 30 chu kỳ (biến tính mức 94 °C 30 giây, gắn mồi nhiệt độ 55 °C vòng 30 giây, kéo dài mạch bổ sung mức 72 °C 30 giây), giai đoạn kéo dài cuối (ở mức nhiệt độ 72 °C vòng phút) giai đoạn ủ, bảo quản (ở °C sửdụng sản phẩm) Bằng cách kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% dung dịch đệm TAE 0,5X có hiệu điện mức 100V vòng 30 phút máy đọc Geldoc có bước sóng 312 nm Qua kết điện di khẳng định mẫu nhiễm Salmonella sp kết xuất vạch sản phẩm có kích thước 284bp (giếng 2), mẫu nhiễm Staphylococcusaureus xuất vạch sản phẩm có kích thước 439bp (giếng 1) Mẫu nhiễm cả2 vi khuẩn Salmonella sp Staphylococcus aureus đồng thời xuất vạch sản phẩm 439bp 284bp (giếng 4) cuối mẫu âm tính đánh giá khơng xuất vạch gelagarose điện di (giếng 3) 21 2.4.6 KẾT LUẬN Phát định danh vi sinh vật thực phẩm nhằm mục đích nhanh chóng phát ngun nhân gây ngộ độc thực phẩm ngăn ngừa cách có hiệu Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy chủ yếu truyền thống, tốn nhiều thời gian, phức tạp độ đặc hiệu chưa cao Cho nên ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR xem ứng dụng nhanh chóng, có độ nhạy cao đơn giản Thông qua nghiên cứu này, việc xây dựng thành cơng quy trình phát nhanh vi khuẩn Salmonella sp S aureus kỹ thuật multiplex PCR đánh dấu bước đầu cho kết tiềm nghiên cứu sản phẩm thu nhận khuếch đại gen invasive nuclease loài vi khuẩn Tuy nhiên, vấn đề xảy sản phẩm chưa đồng độ dài trình tự gần nên gây khó khăn nhận diện gen vi khuẩn Độ nhạy phản ứng multiplex PCR ×102 CFU/mL Salmonella sp 70 CFU/mL Staphylococcus aureus 2.5 Nghiên cứu 5: Phương pháp lai huỳnh quang chỗ (FISH) để phát nhanh Salmonella thịt cừu băm nhỏ 2.5.1 Đầu dò Oligonucleotide Salm63 (5′- TCGACTGACTTCAGCTCC- ′, Pishgam Co, Iran) mẫu thăm dò dùng để phát Salmonella mẫu thịt Trình tự chỉnh so sánh với trình tự rRNA 23S có sẵn Samlmonella Typhi cách sử dụng phần mềm ProbeCheck, ngân hàng gen SILVA ( Bảng ) Đầu dò đánh dấu đầu 'với thuốc nhuộm huỳnh quang cy3 (Ví dụ; 552 nm, Em; 565 nm) Bảng 18.6 Trình tự Oligonucleotide mẫu dị Salm63 Salm-63 sequence 3’ C C T C G A C T T C A G T C A G C T Acc.numbe 1742 175 r Salmonella typhi AE014613 G G A G C U G A A G U C A G C C G A 2.5.2 FISH protocol 2.5.2.1 Cố định Sau 18 ủ mẫu môi trường Buffered Peptone Water (BPW) nhiệt độ 37°C, 22 5’ 1ml tế bào huyền phù trộn với paraformaldehyde (4%) giữ lạnh 30 phút Kết tiếp, tế bào thu hồi cách ly tâm (5000 g ,10 phút), rửa nhiều lần với ml PBS.10 μl phần tế bào rửa chuyển vào tiêu sau tiêu ủ 60°C 20 phút Kế tiếp, cho thêm 10 μl etanol có nồng độ liên tiếp (50%, 70% 96%) vào mẫu ủ 60°C phút cho nồng độ cồn 2.5.2.2 Lai ghép Cho M Nacl, M Tris-Hcl, 10% SDS với giá trị pH 7,3 vào đệm lai tạo Sau chỉnh cách thay đổi nồng độ formamide từ đến 60% ( v /v) Cho μl đệm lai trộn với dung dịch đầu dò oligonucleotide μl chuyển vào phiến kính với vi khuẩn cố định, tiêu ủ trong buồng bão hòa tối 60°C 2.5.2.3 Rửa Dùng đệm chứa M Tris-Hcl, 10% SDS, 0,5 M EDTA, M NaCl để thực Độ nghiêm ngặt đệm rửa đạt cách điều chỉnh nồng độ NaCl Các tiêu lai chuyển vào dung dịch đệm rửa làm nóng trước ủ 15 phút 60°C Sau đó, tiêu rửa nước khử ion làm khô luồng không khí Để chống lại màu, phiến kính phủ 10 μl dung dịch DAPI μg ml -1 2.5.3 Hiệu FISH Đánh giá thực với kính hiển vi huỳnh quang (kính hiển vi Optika, B600TIFL, Ý) trang bị camera CCD đơn sắc làm mát hình ảnh huỳnh quang đánh giá Image J phiên 1.37 (NIH, Hoa Kỳ) Hình ảnh tế bào nhuộm cy3 tế bào nhuộm màu DAPI trường hiển vi lưu dạng tệp ảnh Số lượng tế bào nhuộm cy3 DAPI trường hiển vi đếm phần mềm Image J, sau hiệu suất cường độ FISH tính sau: Hiệu FISH (%) = (tế bào nhuộm cy3 / tế bào nhuộm DAPI)x100 (1) Hiệu FISH (%) =( Cường độ FISH ô / Cường độ c FISH nền) 2.5.4 Phát vi khuẩn Salmonella thịt cừu băm nhỏ Thịt cừu tươi băm nhỏ dễ bị nhiễm khuẩn Salmonella việc phát loại vi khuẩn nhiều thời gian thời hạn sử dụng sản phẩm Do đó, nguy lây nhiễm cao Các hình ảnh thu mức độ ô nhiễm nhân tạo khác 23 thịt cừu tươi thịt cừu khử trùng thể Hình 2.14 Hiệu suất cường độ huỳnh quang hình ảnh vẽ Hình 2.15 Mức độ nhiễm làm tăng số lượng tế bào huỳnh quang phát Hình 19.14.Tế bào S Typhi nhuộm DAPI mức độ ô nhiễm nhân tạo khác (a) 10 CFU / g (b) 10 CFU / g (c) 10 CFU / g (d) 10 CFU / g (e) 10 CFU / g Tế bào Salmonella mẫu thịt băm quan sát lọc UV Thanh, μm Hình 20.15 Tế bào S Typhi phát đầu dò Salm63 mức độ ô nhiễm nhân tạo khác (a) 10 CFU / g (b) 10 CFU / g (c) 10 CFU / g (d) 10 CFU / g (e) 10 CFU / g Tế bào Salmonella mẫu thịt băm quan sát lọc Xanh Thanh, μm (Để giải thích tham chiếu đến màu sắc giải hình này, người đọc tham khảo phiên web viết này.) Nói chung, cường độ huỳnh quang thấp mẫu tươi có lẽ nhiễu cao Làm nóng protein bị biến tính làm bất hoạt vi khuẩn có mẫu thịt Hiệu FISH tăng lên cách tăng mức độ nhiễm bẩn mức độ nhiễm bẩn cao, khác biệt ý nghĩa mẫu khác 2.5.5 Kết nghiên cứu Cơng trình nghiên cứu cho kết nhanh xác Đồng thời phương pháp ích bị tác động điểu kiện khác chất ức chế dung dịch Ngoài ra, phương pháp tối ưu hóa nên dùng phân tích lần sau có mức kinh phí tháp Từ cơng trình nghiên cứu dùng làm phương pháp trọng tài để đánh giá hiệu phương pháp khác Ngoài từ nghiên cứu dùng để làm nên tảng để xây dựng phát triển kỹ thuật sau 24 CHƯƠNG KIẾN NGHỊ 3.1 Nhận định phương pháp Enrichment-ELISA để phát Salmonella typhi -Enrichment-ELISA phương pháp nhanh, nhạy cụ thể để phát S typhi từ mẫu thực phẩm nước Phương pháp Enrichment-ELISA phát triển nghiên cứu với giao thức ngắn mở rộng phiên bản, 10 đến 28 tương ứng, giảm đáng kể thời gian phát qua phương pháp nuôi cấy truyền thống để phát S.typhi từ mẫu thực phẩm nước Phương pháp sử dụng quy trình sàng lọc nhanh để giám sát mơi trường tình hình bùng phát 3.2 Nhận định phương pháp RT - PCR Việc có phương pháp nhanh, nhạy đặc hiệu để định danh vi khuẩn tình ngộ độc thực phẩm vi khuẩn gây bệnh gây nên vô cần thiết Việc giúp chữa trị cho nạn nhân hiệu dễ dàng hết RT – PCR phương pháp tối ưu cho trường hợp RT – PCR phân tích nhanh phát đối tượng vi khuẩn gây bệnh S Typhi nhạy Việc áp dụng phương pháp để phát S Typhi trứng góp phần kiểm sốt vụ việc ngộ độc thực phẩm xảy 3.3 Nhận định phương pháp sử dụng cảm biến sinh học từ tính đàn hồi dựa phage Cảm biến sinh học từ tính đàn hồi dựa phage (ME) đứng tự nghiên cứu hệ thống cảm biến sinh học không dây để phát mầm bệnh theo thời gian thực Do đó, xác định diện mầm bệnh mục tiêu cách theo dõi thay đổi tần số cộng hưởng cảm biến sinh học Do tính chất khơng dây sử dụng để phát từ xa theo thời gian thực chỗ giám sát Một số lượng lớn cảm biến sinh học ME triển khai giám sát đồng thời Quan trọng hơn, phát gắn kết mầm bệnh mục tiêu vào số nhiều cảm biến sinh học ME Do đó, việc sử dụng nhiều cảm biến sinh học ME có khả cho phép xác định số lượng nhỏ mầm bệnh lượng lớn thực phẩm 25 Thử nghiệm tương lai so sánh kết cảm biến sinh học ME với phương pháp phát mầm bệnh truyền thống, chẳng hạn PCR nuôi cấy tế bào ELISA 3.4 Nhận định phương pháp Multiplex Pcr Sau tìm hiểu nhóm em nhận thấy phương pháp phát triển để xây dựng thành kit thương mại giúp định danh nhanh vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Ngoài phương pháp làm tảng để xây dựng phương pháp khác để phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm 3.5 Nhận định phương pháp lai huỳnh quang chỗ (FISH) Phương pháp khắc phục hạn chế phương pháp ELISA, PCR phương pháp dựa nuôi cấy kết bị ảnh hưởng mạnh chất ức chế có thực phẩm Thơng thường thời gian để xác định S Typhi thịt cừu băm nhỏ thường lớn thời gian sử dụng sản phẩm Ngoài thịt cừu băm nhỏ diện tích bề mặt tiếp xúc với dụng cụ cao nên nguy bị lây nhiễm cao Tuy nhiên phương pháp phân tích thơng thường thường nhiêu thời gian nên việc phương pháp đời góp phần khắc phục khó khăn Khơng có khả phân tích nhanh cịn có khả giúp phân biệt tế bào S Typhi sống chết Không xảy phản ứng với kháng nguyên không mong muốn Tuy nhiên phương pháp quan tâm lớn đến formamide, muối nhiệt độ thơng số ảnh hưởng đến cường độ hiệu phương pháp Do phương pháp thường nhắm mục tiêu vào RNA ribosome nên sử dụng để phát S Typhi mà không cho biết thêm độc tố Sau thời nghiên cứu nhóm em nhận thấy phương pháp phát có tiềm để trở thành phương pháp ứng dụng rộng rãi 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] S.KUMAR (2008) Enrichment-ELISA for Detection of Salmonella typhi From Food and Water Samples Elsevier [2] JUNG SUNG JE (2005) Quantitative Detection of Salmonella typhimurium Contamination in Milk, Using Real-Time PCR The Korean Society for Microbiology and Biotechnology [3] Suiqiong Li (2010) Direct detection of Salmonella typhimurium on fresh produce using phage-based magnetoelastic biosensors Open Access [4] Nguyễn Thành Luân (2019) NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCRTRONG PHÁT HIỆN VI KHUẨN Salmonella sp.VÀ Staphylococcus aureus GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM Tạp chí Khoa học Công nghệ Thực phẩm 18 [5] De Freitas C G (2010) PCR multiplex for detection of Salmonella enteritidisand typhymirium and occurrence in pourtry meat International Journal of FoodMicrobiology 139 [6] Trần Thị Xuân Mai (2018) Phát nhanh Salmonella spp., Salmonella enterica diện thực phẩm bằngkỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR) Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 20b [7] Lee, S H A multiplex real-time PCR for differential detection and quantification of Salmonellaspp., Salmonella enterica serovar typhimurium and enteritidis in meats Journal of VetSciences 10 [8] Nguyễn Tuấn Anh (2015) Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp phát nhanhbệnh tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) kỹ thuật PCR Đại học Nông Lâm [9] Le Loir Y Staphylococcus aureus and food poisoning Genetics Molecular Research [10] Normanno G Coagulase-positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy International Journal of Food Microbiology 98 [11] GhazalehSalimi Efficiency of fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the rapid detection of Salmonella in minced lamb meat: Method analysis and optimization The Journal of Microbiological Methods 27 28 ... xuất Salmonella typhi thực phẩm Đặc biệt sản phẩm sữa, thịt, phomat,… Nếu có mặt Salmonella typhi khơng chấp nhận Theo tơng tư 05/2012/TT-BYT Chính cần có nhiều kỹ thuật phân tích Salmonella typhi. .. phát nhanh Salmonella typhi từ mẫu thực phẩm mẫu nước RT – PCR (Realtime – PCR) phương pháp phân tích dùng để khuếch đại phân tử ADN in vitro, cho phép phát tồn Salmonella Typhy thực phẩm hay không... phương pháp phân tích dùng để khuếch đại phân tử ADN in vitro, cho phép phát tồn Salmonella Typhy thực phẩm hay không RT - PCR phương pháp thay để phát vi khuẩn gây bệnh từ thực phẩm có Salmonella