Đang tải... (xem toàn văn)
I Vì sao phải sử dụng các phương pháp phân tích Salmonella Typhy khác nhau Salmonella nói chung và S Typhi nói riêng là một trong những mối quan tâm hàng đầu của kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm chúng ta.
I Vì phải sử dụng phương pháp phân tích Salmonella Typhy khác Salmonella nói chung S Typhi nói riêng mối quan tâm hàng đầu kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm ln tìm cách để tối ưu hóa việc định danh, định tính hay xác định có mặt chúng thực phẩm nguồn nước có nhiều phương pháp phân tích đối tượng S Typhi, từ phương pháp nuôi cấy truyền thống đại PCR, Multix – PCR, Realtime – PCR,… Tuy nhiên,mỗi phương pháp có ưu nhược điểm khác Tùy theo hoàn cảnh, thời gian, mục đích hay điều kiện kỹ thuật mà đưa lựa chọn phương pháp phù hợp II Phát nhanh vi khuẩn Salmonella typhi trứng bị ô nhiễm cách sử dụng RT - PCR Tổng quan: RT – PCR (Realtime – PCR) phương pháp phân tích dùng để khuếch đại phân tử ADN in vitro, cho phép phát tồn Salmonella Typhy thực phẩm hay không RT - PCR phương pháp thay để phát vi khuẩn gây bệnh từ thực phẩm có Salmonella Typhy Phương pháp RT – PCR đucợ cho có độ nhạy độ đặc hiệu cao so với phương pháp PCR thông thường thời gian cần thiết nhanh phương pháp truyền thống phương pháp nuôi cấy (Dorak, 2006; Drahovská cộng sự, 2001; Liu, 2010) Do đó, phương pháp sử dụng cho phịng thí nghiệm pháp y phòng thử nghiệm thực phẩm với số lượng mẫu nhỏ cung cấp kết nhạy, nhanh chóng Năm 2019, Muktiningsih Nurjayadi cộng thực nghiên cứu: Phát nhanh vi khuẩn Salmonella typhi trứng bị ô nhiễm cách sử dụng RT PCR Nguyên liệu nghiên cứu Trứng thực phẩm thường bị nhiễm khuẩn Salmonella Typhi đặc tính mơi trường phù hợp cho chúng phát triển sinh sản S Typhi từ đất xâm nhập vào bên vỏ trứng, chúng lòng trắng trứng bảo vệ khỏi tác nhân gây ảnh hưởng khác (Buck cộng sự, 2003) Vật liệu phương pháp nghiên cứu Phân tích RT – PCR nhìn chung bao gồm bước Khuếch đại trình tự đích đặc hiệu PCR với có mặt mẫu dị huỳnh quang Gắn mẫu dò huỳnh quang chu trình khuếch đại Tạo tín hiệu huỳnh quang kích thích chu trình Phát tín hiệu huỳnh quang hệ thống phát huỳnh quang Phân tích số liệu (theo TCVN 11133:2015) 3.1 Chuẩn bị mẫu nuôi cấy Các mẫu cấy vi khuẩn Salmonella Typhi nuôi 24 môi trường đặc hiệu SSA (Merck) 37°C đĩa phương pháp phết Các dịng vi khuẩn hình thành khuẩn lạc sau ni cấy qua đêm (18 giờ) môi trường Luria Broth (Deben Diagnostics.Ltd) 37°C cách sử dụng tủ ấm Đối với mẫu trứng bị nhiễm vi khuẩn S Typhi nhân tạo, pha loãng dung dịch từ huyền phù qua đêm S Typhi Để xác định số lượng khuẩn lạc bị nhiễm mẫu trứng, mL huyền phù pha loãng độ 10− 4, 10− 10− nuôi môi trường SSA (Merck) phương pháp đĩa phết ủ 37°C 24 Huyền phù chọn để tính tốn nồng độ vi khuẩn huyền phù tạo số khuẩn lạc từ 30 đến 300 dựa tiêu chuẩn đếm đĩa FDA BAM (Sổ tay phân tích vi khuẩn Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm) Số lượng khuẩn lạc hình thành tính CFU/mL ni cấy 3.2 Mẫu trứng nhân tạo nhiễm S Typhi Trứng mua chợ, sau luộc chín nghiền mịn vơ trùng Chuyển mẫu trứng sang đĩa chiếu tia UV 30 phút Mẫu trứng làm nhiễm huyền phù vi khuẩn theo tỉ lệ thể tích 1:1 Các mẫu thử nghiệm sử dụng huyền phù vi khuẩn độ pha loãng 10-6 Mỗi mẫu ủ 37°C 18 tủ ấm 3.3 Phân lập AND Lấy nguồn ni cấy, mẫu đối chứng dương tính, mẫu thử nghiệm mẫu đối chứng âm tính 1mL chuyển vào ống Eppendorf, ly tâm với tốc độ 5000/ phút phút để tạo cặn DNA vi khuẩn phân lập từ cặn hình thành kit thương mại từ QIAamp DNA Mini Kit (ATL, AL, AW1, AW2, AE buffer) Độ tinh khiết DNA phân lập đo tỷ lệ A260/A280 nồng độ DNA máy quang phổ GE Nanovue Uv –Vis 3.4 Tối ưu hóa nhiệt độ ủ 3.5 Tiến hành thử nghiệm đo đạc Kiểm tra xác nhận nuôi cấy vi khuẩn Salmonella Typhi Thử nghiệm độ nhạy độ đặc hiệu mồi fim-C Salmonella Typhi từ nuôi cấy gốc Kiểm tra xác nhận mồi fim-C mẫu trứng bị nhiễm bẩn Kết Độ tinh khiết nồng độ DNA phân lập từ nuôi cấy gốc mẫu trứng bị nhiễm vi khuẩn Salmonella typhi cách sử dụng Máy quang phổ GE Nanovue UV-VIS trình bày Bảng Bảng Độ tinh khiết nồng độ DNA phân lập mẫu nuôi cấy gốc mẫu trứng bị nhiễm vi khuẩn Salmonella typhi Hình ảnh hóa kết q trình mồi DNA trình khuếch đại Các dải DNA tạo khoảng nhiệt độ 56°C đến 61°C so sánh với thang DNA có kích thước 95 cặp bazơ thể Hình Hình Kết tối ưu hóa nhiệt độ ủ mồi gen fimC Salmonella Typhi, (1) Thang DNA 100 bp; (2) Kiểm soát tiêu cực;(3) Đoạn ADN nhiệt độ 56 ° C;(4) Đoạn DNA nhiệt độ 57 ° C;(5) Đoạn DNA nhiệt độ 58 ° C;(6) Đoạn DNA nhiệt độ 59 ° C;(7) Đoạn DNA nhiệt độ 60 ° C; (8) Nhiệt độ đoạn DNA 61 ° C Hình Đường cong khuếch đại nuôi cấy dự trữ vi khuẩn Salmonella typhi với mẫu DNA nồng độ 56 nanogam đối chứng âm tính Hình Đường cong nóng chảy (melting curve) Salmonella typhi nuôi cấy với mẫu DNA 56 nanogam Kết cho thấy độ nhạy cặp mồi Salmonella Typhi fimC-F (mồi thuận) fimC-R (mồi ngược) phát mẫu DNA có nồng độ thấp 4528 pg / μL đường cong khuếch đại nồng độ nhỏ giá trị Ct 23,90 (Hình 4) Hình 4.Đường cong khuếch đại đường cong kiểm tra độ nhạy gen fimC Salmonella typhi Hình Đường cong khuếch đại đường cong nóng chảy đánh giá xác nhận fimC-F (mồi thuận) fimC-R (mồi ngược) Salmonella Typhi với ba mẫu trứng Bàn luận Việc có phương pháp nhanh, nhạy đặc hiệu để định danh vi khuẩn tình ngộ độc thực phẩm vi khuẩn gây bệnh gây nên vô cần thiết Việc giúp chữa trị cho nạn nhân hiệu dễ dàng hết RT – PCR phương pháp tối ưu cho trường hợp RT – PCR phân tích nhanh phát đối tượng vi khuẩn gây bệnh S Typhi nhạy Việc áp dụng phương pháp để phát S Typhi trứng góp phần kiểm sốt vụ việc ngộ độc thực phẩm xảy ... nhân hiệu dễ dàng hết RT – PCR phương pháp tối ưu cho trường hợp RT – PCR phân tích nhanh phát đối tượng vi khuẩn gây bệnh S Typhi nhạy Việc áp dụng phương pháp để phát S Typhi trứng góp phần... fimC Salmonella typhi Hình Đường cong khuếch đại đường cong nóng chảy đánh giá xác nhận fimC-F (mồi thuận) fimC-R (mồi ngược) Salmonella Typhi với ba mẫu trứng Bàn luận Việc có phương pháp nhanh, ... khuẩn Salmonella typhi với mẫu DNA nồng độ 56 nanogam đối chứng âm tính Hình Đường cong nóng chảy (melting curve) Salmonella typhi nuôi cấy với mẫu DNA 56 nanogam Kết cho thấy độ nhạy cặp mồi Salmonella