TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên : Trương Thị Hồng Nhung Hoàng Minh Nguyệt Lớp : CNSH – K52 Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Giang KS. Nguyễn Thị Bích Lưu Bộ môn SHPT & CNVS – Khoa Công nghệ sinh học 1 Đề tài: “Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lý môi trường” 2  Ô nhiễm môi trường đã và đang là vấn đề cấp thiết và thu hút sự quan tâm của rất nhiều cá nhân, tổ chức cũng như nhiều quốc gia trên thế giới. Các công nghệ xử lý rác thải được sử dụng hiện nay đều vấp phải các vấn đề môi trường về lâu dài. Trong khi đó xử lý ô nhiễm môi trường bằng biện pháp sinh học, đặc biệt là việc sử dụng vi sinh vật trong xử lý rác thải đang là một công nghệ đem lại hiệu quả cao, ít tốn kém và bền vững.  Các vi sinh vật được sử dụng chủ yếu là các vi khuẩn có khả năng phân hủy các chất hữu cơ, một nguồn rác thải chủ yếu ở Việt Nam.  Với mục đích phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ở suối nước nóng để khởi đầu cho việc nghiên cứu sâu hơn quá trình phân giải các chất hữu cơ trong rác thải của vi sinh vật ưa nhiệt, chúng em tiến hành đề tài: “Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lý môi trường” 3 Mục đích và yêu cầu: 1. Mục đích:  Phân lập, tuyển chọn ra một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt có hoạt tính enzyme để ứng dụng trong xử lý môi trường. 2. Yêu cầu:  Phân lập được các chủng vi khuẩn ưa nhiệt từ suối nước nóng.  Xác định điều kiện tối ưu để nuôi cấy vi khuẩn ưa nhiệt:  pH thích hợp.  Nhiệt độ thích hợp.  Xác định hoạt tính một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt phân lập được. 4 5 1. Đối tượng:  Mẫu thu thập: Mẫu nước lấy từ một số suối nước nóng. 6 2. Địa điểm:  Địa điểm: Bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ Vi sinh – Khoa CNSH – ĐH Nông Nghiệp Hà Nội. 3. Thời gian nghiên cứu:  Thời gian: Từ 3/2009 đến 3/2010. 2.1. Nội dung.  Tìm kiếm, thu thập, phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn ưa nhiệt từ suối nước nóng.  Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để nuôi cấy vi khuẩn ưa nhiệt.  Xác định các hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt.  Xác định độ bền nhiệt của enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt. 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu: Nước, bùn, đất ở lòng suối ở những điểm có nhiệt độ khác nhau > 40 0 C. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy: Môi trường LB – Agar 1. Pepton : 10g/L 2. NaCl : 5g/L 3. Cao nấm men : 5g/L 4. Agar : 18g/L pH = 7.0 8 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 2.2.3. Phương pháp nhuộm Gram  Bước 1: Cố định tiêu bản vi khuẩn bằng cách cố định trên ngọn lửa đèn cồn rồi nhuộm bằng dung dịch tím tinh thể (crystal violet), thường dùng dung dịch Gentian 1%, lên vết bôi trong khoảng một phút rồi rửa bằng nước cất.  Bước 2: Nhuộm tiếp bằng dung dịch Iot ( dung dịch lugol) trong 1 phút rồi rửa vết bôi bằng nước cất.  Bước 3: Phủ lên vết bôi dung dịch ethanol 95% : Acetone (1:1) trong khoảng 1 phút rồi rửa lại bằng nước sạch.  Bước 4: Nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm màu đỏ ( safrnin hoặc fucsin Ziehl ) 30 – 60 giây rồi rửa lại bằng nước sạch và hong khô trong không khí.  Để tiêu bản khô và tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính dầu 100. Vi khuẩn bắt màu tím là vi khuẩn Gram (+) còn vi khuẩn bắt màu hồng là vi khuẩn Gram (-). 2.2.4. Phương pháp thử khả năng sinh Enzyme ngoại bào của vi khuẩn:  Phương pháp đục lỗ trên thạch: môi trường gồm agar (18g/l) + nước cất + 1% cơ chất tương ứng với từng loại enzyme được hấp khử trùng, đổ vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội, dùng khuyên đục lỗ (đường kính 1cm). Nhỏ dịch nghiên cứu vào lỗ thạch. Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 50oC thời gian 18h – 24h. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng; sau đó đo đường kính vòng phân giải (D). Từ đó ta có kích thước vòng phân giải (D- d).  Môi trường thử khả năng sinh enzyme protease: agar + cơ chất (0,1 % cazein) + nước cất, thuốc nhuộm lugol (5%).  Môi trường thử khả năng sinh enzyme amylase: agar + cơ chất (0,1% tinh bột) + nước cất, thuốc nhuộm là dung dịch KI (0,1%).  Môi trường thử khả năng sinh enzyme cellulase: agar + cơ chất (0,1% CMC) + nước cất, thuốc nhuộm lugol (5%). 10 . học 1 Đề tài: “Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lý môi trường” 2  Ô nhiễm môi trường đã và đang. cơ trong rác thải của vi sinh vật ưa nhiệt, chúng em tiến hành đề tài: “Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong