1 Chương Chương 1 1 Ứ Ứ ng ng Dụ Dụ ng ng ‘ ‘ D D ấ ấ u u ’ ’ Phân Phân Tư Tư ̉ ̉ Trong Trong Công Công Tá Tá c c Gi Gi ố ố ng ng Cây Cây Tr Tr ồ ồ ng ng D D ấ ấ u u phân phân tư tư ̉ ̉ (Molecular Markers/DNA Markers) (Molecular Markers/DNA Markers) 2 Sự khác biệt giữa cá thể/giống/loài = Polymorphism Phân biệt/nhận diện  đặc điểm nhận diện – ‘Dấu’ ‘DNA Marker’ Khá Khá i i ni ni ệ ệ m m : : D D ấ ấ u u (Marker) (Marker) = = đ đ ặ ặ c c đi đi ể ể m m dù dù ng ng đê đê ̉ ̉ phân phân bi bi ệ ệ t/nh t/nh ậ ậ n n di di ệ ệ n n Dấu di truyền (Genetic Marker) = đ đ ặ ặ c c đi đi ể ể m m dù dù ng ng đê đê ̉ ̉ phân phân bi bi ệ ệ t/nh t/nh ậ ậ n n di di ệ ệ n n vê vê ̀ ̀ bả bả n n ch ch ấ ấ t t di di truy truy ề ề n n Dấu phân tử (DNA Marker) = đặc điểm ADN dùng để phân biệt/nhận diện (về bản chất di truyền) Ứng dụng: Dùng để phân biệt/nhận diện sự khác nhau (về bản chất di truyền) giữa các cá thể/giống/loài Yêu cầu: + Khác nhau (Polymorphism) giữa các cá thể/các giống/các loài + mang tính đặc trưng và ổn định, ít/không bị thay đổi bởi đk ngoại cảnh 3 Đặc điểm của các loại ‘Genetic Marker’ ++++++ Mức độ Polymorph. +++++++++ Đòi hỏi kỹ thuật + +++ + Hình thái /Nông học +++++++ Phản ánh b/chất DT +++++ Chịu t/động ngoại cảnh +++++++ Số lượng Marker ADNProteinIsozymeMarker Dấu phân tử (Molecular Markers) = Dấu ADN (DNA Markers) Dấu phân tử được thiết lập và xác định dựa trên sự đa dạng (Polymorphism) xuất hiện ngẫu nhiên (Naturally) trên phân tử ADN (VD: mất, thay thế, thêm các base nitơ, hay thay đổi về ‘trình tự sắp xếp đặc biệt’ (patterns) của các base nitơ) Phân loại: có 2 nhóm dấu ADN - Dựa trên đột biến của 1 cặp base nitơ (thiếu, thay thế, thêm)  làm thay đổi điểm nhận diện của Enz cắt giới hạn (regconition sites) (RFLP, SCAR, SNP), hoặc thay đổi trình tự vị trí gắn của ‘con mồi’ (primer) (RAPD), hoặc thay đổi cả 2 (AFLP) - Dựa vào sự thay đổi về số lượng đoạn lặp lại của 1 trình tự sắp xếp đặc biệt của phân tử ADN (repetitive motif) (SSR) 4 Kỹ thuật phân tích Dấu phân tử • Cắt ADN (Restriction Digestion) • Phản ứng PCR • Điện di ADN (Gel Electrophoresis) Các dạng DNA Marker trên TV Dựa trên kỷ thuật cắt bằng Enz. cắt giới hạn (Digestion): - RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism) - DArT (Diversity Array Technique) Dựa trên kỷ thuật PCR: - RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA Marker) - SSR (Simple Sequence Repeat) - ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) - SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Dựa trên Digestion + PCR: - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - SCAR (Sequence-Characterized Amplified Regions ) 5 Các dạng DNA Marker trên TV Dựa trên kỷ thuật Digestion: - RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism) - DArT (Diversity Array Technique) Dựa trên kỷ thuật PCR: - RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) - SSR (Simple Sequence Repeat) - ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) - SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Dựa trên Digestion + PCR: - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - SCAR (Sequence-Characterized Amplified Regions ) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Nguyên tắc: + Cắt ‘genomic ADN’ bằng Enz. cắt giới hạn + Điện di để phân tách các đoạn cắt  Tìm và ghi nhận sự đa dạng (Polymorphism) Điểm nhận diện của mỗi Enz giới hạn có: + Trình tự đặc biệt của các base nitơ + Không phụ thuộc vào bất kỳ loại gien nào + Phân bố ngẫu nhiên khắp toàn bộ bộ gien của SV  Kiểu gien ≠ = vị trí điểm nhận diện của Enz giới hạn ≠  Kết quả cắt ≠ (đoạn được cắt có chiều dài ≠ ) 6 6 Nu-cutter GAATTC 4 Nu-cutter TCGA CTTAAG AGCT Enzymes cắt ADN ở vị trí chuyên biệt Điểm nhận diện thường có trình tự đối xứng (palindromes): RFLP (ttheo ) RFLP (ttheo.) RFLP ↔ Đa dạng về điểm nhận diện của Enz. cắt giới hạn Dạng k/quả: Có // Không 7 RFLP (ttheo.) RFLP = co-dominant (phân biệt được Heterozygote/Homozygote) Ưu điểm: Mức độ đa dạng tương đối cao (Relatively High Polymorphism) Marker mang tính đồng trội (Co-dominant) Kết quả ổn định (Reproductive) Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC Khuyết điểm: Đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và đắt tiền; Đòi hỏi số lượng lớn ADN Đòi hỏi ADN có độ sạch cao (tinh khiết) RFLP (ttheo.) 8 RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA Markers) Nguyên tắc: + Sử dụng 1 con mồi ngắn (~10 bp) (Primer F = Primer R) + Kỹ thuật PCR  Tổng hợp ngẫu nhiên các đoạn ADN trên khắp bộ gien (đoạn tổng hợp có chiều dài <1 Kb) + Điện di để phân tách các đoạn được tổng hợp  Tìm và ghi nhận sự đa dạng (Polymorphism) RAPD = Đa dạng (Polymorphism) về vị trí gắn của con mồi Kết quả điện di RAPD (ttheo ) 9 Cá thể 232 mang băng B là đồng hợp tử hay dị hợp tử ở locus B ?  Trội hoàn toàn (Có/không) ??? B Hạn chế của PPháp Băng B thực sự là do khác biệt về di truyền hay do sai sót về kỹ thuật ?  Tính ổn định ??? RAPD (ttheo ) A Ưu điểm: Phương pháp đơn giản, rẽ tiền và ít tốn thời gian nhất Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC Không đòi hỏi số lượng lớn ADN Không đòi hỏi ADN có độ sạch cao (tinh khiết) Khuyết điểm: Marker không chuyên biệt (Unspecific) Marker mang tính trội (Dominant) Kết quả không ổn định (UnReproductive) RAPD (ttheo ) 10 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) = RFLP + RAPD Nguyên tắc: + Cắt ‘Genomic ADN’ bằng Enz giới hạn + Gắn Adaptor ở 2 đầu mỗi đoạn được cắt + Kỹ thuật PCR với con mồi = Adaptor + Điện di để phân tích các đoạn ADN được tổng hợp  Tìm và ghi nhận sự đa dạng (Polymorphism) AFLP = Đa dạng về điểm nhận diện của Enz giới hạn + Đa dạng về vị trí gắn của con mồi AFLP (Các bước cơ bản) Mẫu A Mẫu B Mẫu A B Adaptor [...]... 2000 ) Ứng dụng của dấu phân tử Dấu phân tử được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: – – – – – Nghiên cứu và phân tích ngân hàng vật liệu di truyền, ChNn đoán về di truyền, Khảo sát và lập lý lịch giống hoặc các SV chuyển gien N ghiên cứu bộ gien Phân tích phả hệ và sự quan hệ giữa các SV trong quá trình tiến hóa – Tìm sự liên kết giữa dấu phân tử và các đặc điểm mong muốn chọn giống. .. Repeats/Microsatellites) SSR có trong bộ gien của tất cả SV nhân thật (Eukaryote) và có chứa từ vài đến vài trăm đoạn lặp (Copies) của 1 trình tự đặc biệt (Motif) từ 1-4 base nitơ • Rất đa dạng (nhiều alen/locus) • Rất nhiều locus SSR (hàng 1000 locus) trong mỗi loài SV Nguyên tắc: + Kỹ thuật PCR với 2 con mồi (F/R) tương ứng với 2 đầu của SSR + Điện di để phân tách các đoạn được tổng hợp Tìm... Đối tượng áp dụng có giới hạn Cần nhiều thời gian và công sức để thu thập thông tin trước về đối tượng NC 14 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Các dạng SNP 15 MicroArray Slide spot pingroup subarray gene SNP (ttheo ) Stable (L.kết bền) Unstable (L.Kết không bền) L.kết không bền có thể bị cắt bằng Enz S1 hoặc bị tách L.kế bề có thể bằ hoặ bị tách thành mạch đơn ở những đk đặc biệt thành mạ nhữ... sử dụng đề tìm sự đa dạng trong cùng loài; • Thường sử dụng để tìm quan hệ gia phả SSR (ttheo ) Ưu điểm: Mức độ đa dạng rất cao (High Polymorphism) Phương pháp nhanh và rẽ tiền Marker mang tính đồng trội (Co-Dominant) Không đòi hỏi số lượng và chất lượng ADN Marker chuyên biệt (specific) Kết quả rất ổn định (Reproductive) Khuyết điểm: Cần biết trước thông tin về đối tượng NC Đối tượng áp dụng. .. Cy5-labeled Cy3Cy5cloned amplicons of 2 of these parents 17 Nguyên tắc phát hiện đa dạng (Diversity Arrays) Genotype1 Genotype2 A B C D E F G H Dấu phân tử ‘lý tưởng’ ??? Cần có 5 ưu điểm: • Có mức độ đa dạng từ cao rất cao • Mang đặc tính đồng trội • Phân bố ngẫu nhiên và rộng khắp bộ gien của SV • Dễ thực hiện và rẽ tiền • Có tính ổn định cao 18 Đặc điểm của các dấu ADN (DNA Markers) RFLP... hình) AFLP (ttheo ) Ưu điểm: Không cần biết trước thông tin về đối tượng NC Mức độ đa dạng rất cao (High Polymorphism) Marker tương đối chuyên biệt (specific) Kết quả rất ổn định (Reproductive) được áp dụng trên nhiều loài SV khác nhau Khuyết điểm: Phương pháp tương đối phức tạp và tốn kém Marker mang tính trội (Dominant) Đòi hỏi số lượng ADN tương đối lớn Đòi hỏi ADN có độ sạch cao (tinh khiết) 11 . 1 Chương Chương 1 1 Ứ Ứ ng ng Dụ Dụ ng ng ‘ ‘ D D ấ ấ u u ’ ’ Phân Phân Tư Tư ̉ ̉ Trong Trong Công Công Tá Tá c c Gi Gi ố ố ng ng Cây Cây Tr Tr ồ ồ ng ng D D ấ ấ u u phân phân tư tư ̉ ̉ (Molecular. bả bả n n ch ch ấ ấ t t di di truy truy ề ề n n Dấu phân tử (DNA Marker) = đặc điểm ADN dùng để phân biệt/nhận diện (về bản chất di truyền) Ứng dụng: Dùng để phân biệt/nhận diện sự