ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP DH06SH Bài Tiểu Luận : CHẨN ĐOÁN BỆNH NEWCASTLE BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO GVHD: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: TRẦN THỊ THANH PHẤN MSSV: 06126110 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2 MỤC LỤC I. ĐẶT VẤN ĐỀ 4 II. TỔNG QUAN 5 1 Bệnh Newcastle 5 1.1 Khái quát về bệnh Newcastle 5 1.2 Virus gây bệnh 6 1.2.1 Hệ thống phân loại 6 1.2.2 Đặc điểm hình thái và lý hóa của virus 7 1.2.3. Các đặc tính sinh học 8 1.3 Đặc điểm dịch tễ học của bệnh Newcastle 12 1.3.1 Phân bố và diễn biến của bệnh 12 1.3.2 Vật chủ 12 1.3.3 Đường xâm nhập và truyền lây của virus 12 1.4 Đặc điểm bệnh học 13 1.4.1 Quá trình sinh bệnh 13 1.4.2 Triệu chứng và bệnh tích 14 2. Phương pháp nuôi cấy tế bào. 16 2.1 Khái niệm 16 2.2 Các loại tế bào nuôi cấy: Tế bào biểu mô, Nguyên sợi bào, Tế bào cơ, 16 2.3 Một số máy móc thiết bị cần thiết 16 2.4 Thành phần môi trường. 16 2.5. Kiểm soát việc nuôi cấp tế bào 17 2.6. Thu hoạch tế bào 18 2.7. Bảo quản tế bào. 18 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3 2.8. Nguyên nhân gây nhiễm trùng trong nuôi cấy tế bào 18 2.9. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào 18 3. Chẩn đoán bệnh Newcastle bằng phương pháp nuôi cấy tế bào 19 1. Thu thập và gởi mẫu đi chuẩn đoán bệnh 19 1.1 Mẫu cơ 19 1.2. Mẫu huyết thanh 19 2. Xử lý mẫu 21 3. Phương pháp chuẩn bị môi trường xơ phôi gà ( CEF) một lớp 21 3.1 Nguyên liệu 21 3.2 Trypsin có tế bào 22 3.3 Cấy tế bào vào chai 23 4. Kiểm tra mẫu bệnh phẩm 23 IV. KẾT LUẬN 25 V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Newcastle hiện nay đang là mối quan tâm hàng đầu trong chăn nuôi gà bởi bệnh lây lan rất nhanh, tỷ lệ chết cao làm ảnh hưởng trực tiếp đến kinh tế hộ gia đình. Hơn thế bệnh còn là mối nguy cơ bùng phát dịch trên diện rộng gây ô nhiễm môi trường và sức khoẻ cộng đồng. Ảnh hưởng của bệnh Newcastle đối với nền kinh tế gia cầm toàn cầu rất lớn, là một trong những b ệnh gây tác hại lớn đến sự phát triển của ngành chăn nuôi gia cầm thế giới. Ngoài ra thiệt hại liên tục do bệnh Newcastle gây ra sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng cũng như chất lượng thực phẩm cho người dân. Trong thực tế đã có nhiều người thường có tư tưởng chủ quan khi thấy trong thời gian dài trong gia đình nhà mình không bị bệnh Newcastle đã không thực hiện đúng quy trình nh ỏ và tiêm phòng vaccine Newcastle từ đó đã dẫn đến nguy cơ mắc bệnh cao.Từ đó mỗi khi có dịch bệnh xảy ra công tác kiểm soát dịch bệnh trở nên khó khăn hơn. Vì vậy việc chẩn đoán mẫu bệnh phẩm để xác định nguyên nhân gây chết của gia cầm có phải là do virus Newcastle gây ra hay không có ý nghĩa thực tế rất lớn nhằm góp phần làm giảm tối đa các rủi ro có thể xảy ra cũng như ngăn chặn không cho dịch bệnh lan tràn sang các khu vực khác và trên thế giới. Vì vậy công tác kiểm soát dịch bệnh sẽ dễ dàng hơn và hiệu quả hơn. Hiện nay có rất nhiều kỷ thuật phân tử để chẩn đoán bệnh Newcastle như dùng phôi gà, phương pháp huyết thanh học, phương pháp thử thách, phương háp kháng thẻ huỳnh quang và một trong những phương pháp chẩn đoán chính xác hiệu quả và đặc trưng nhất chính là phươ ng pháp nuôi cấy tế bào. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 5 II. TỔNG QUAN 1 Bệnh Newcastle 1.1 Khái quát về bệnh Newcastle Bệnh Newcastle hay còn gọi là bệnh dịch tả hay bệnh gà rù. Bệnh do virus avian paramyxovirus type 1 (APMV-1) gây nên chủ yếu trên các loài gia cầm, trong đó gà là loài mẫn cảm nhất. Trong các tài liệu chuyên môn trước đây, bệnh Newcastle còn gọi là bệnh pseudo-poutry plague, avian pest, avian distemper… Virus newcastle rất đa dạng về độc lực và thường gây ra nhiều dạng bệnh với mức độ nghiêm trọng rất khác nhau. Sự đa dạng này thường gây ra một số khó khăn trong vi ệc nhận dạng được bệnh ngay khi có virus Newcastle xâm nhập vào đàn gia cầm (Trần Đình Từ, 1995). Bệnh Newcastle phức tạp ở chỗ các chủng virus khác nhau có thể gây ra những biến động rất lớn về mức độ nghiêm trọng của bệnh, kể cả một vật chủ đã biết rất rõ như gà. Để phân chia các thể hay các týp bệnh lý của bệnh Newcastle dựa vào các triệu chứng lâm sàng của gà, Beard và Hanson (1984) [72] đã tóm tắ t như sau: (1) Thể Doyle (1927) [99] là thể bệnh Newcastle cấp tính, gây tử vong cho gà ở mọi lứa tuổi. Thường xuất huyết ở đường tiêu hóa và thể bệnh này được gọi là thể bệnh Newcastle độc lực cao hướng nội tạng ( VVND: Viscerotropic velogenic Newcastle disease). (2) Thể Beach ( Beach, 1942) [69] cũng là thể bệnh Newcastle cấp tính thường gây tử vong ở gà mọi lứa tuổi. Các triệu chứng hô hấp và thần kinh thường xuất hiện nổi trội vì vậy được gọi là bệnh Newcastle độc lực cao hướng thần kinh (NVND: Neurotropic velogenic Newcastle disease). (3) Thể Beaudette ( Beaudette and Black, 1946) [74] là một thể Newcastle nhẹ hơn, thường chỉ gây tử vong ở gà con. Virus gây ra týp bệnh này thuộc nhóm virus có độc lực trung bình ( Mesogenic NDV) và một số chủng virus thuộc nhóm này đã được sử dụng làm vaccine virus sống dùng để tiêm chủng lặp lại. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 6 (4) Thể Hitchner ( Hitchner và Johnson,1948) [127] là một thể bệnh đường hô hấp nhẹ gây ra bởi nhóm virus có độc lực thấp ( Lentogenic NDV), thường sử dụng để sản xuất các loại vaccine virus sống. (5) Thể ruột, không triệu chứng ( asymptomatic-enteric form) ( Lancaster, 1981) [156] là thể gây nhiễm ở đường ruột bởi các virus gần như không có độc lực, không gây bệnh rõ ràng ( Apathogenic or avirulent NDV). 1.2 Virus gây bệnh 1.2.1 Hệ thống phân loại APMV-1 hay virus Newcastle được xếp vào chi Rubulavirus thuộc họ phụ Paramyxovirinae của họ Paramyxoviridae. Các họ virus Paramyxoviridae, Filoviridae, Rhabdoviridae và Bornaviridae tạo nên bộ Mononegavirales, có bộ gen là một RNA chuỗi đơn âm ( negative single strained RNA) không phân đoạn, với nucleocapside có cấu trúc đối xứng xoắn ( Murphy và ctv, 1999) [176]. Có chín nhóm huyết thanh Avian Paramyxovirus đã được công nhận và ký hiệu từ APMV-1 đến APMV-9 (Alexander, 1988) [48]. Trong số này virus Newcastle ( APMV-1) là tác nhân gây bệnh quan trọng nhất đối với gia cầm, nhưng APMV-2, APMV-3, APMV-6 và APMV-7 cũng có vai trò gây bệnh nhất đị nh Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 7 1.2.2 Đặc điểm hình thái và lý hóa của virus Soi kính hiển vi điện tử tương phản âm thấy các tiểu thể virus Newcastle có dạng đa hình thái, tiêu biểu cho các thành viên của chi Rubulavirus. Các hạt dạng tròn có kích thước khoảng 100-500 nm, còn các dạng sợi có bề ngang khoảng 100 nm với chiều dài thay đổi mỗi khi quan sát. Bề mặt hạt virus được bao bọc với các mấu lồi dài khoảng 8 nm. Trong hầu hết các vi ảnh điện tử, Nucleocapside thường có “dạng x ương cá trích” điển hình cho Paramyxovirus với chiều dài khoảng 18 nm, cấu trúc đối xứng xoắn, có thể được quan sát dưới dạng sợi tự do hoặc nhô ra từ các tiểu thể virus bị đứt gãy ( Murphy và ctv, 1999; Alexander, 2003) [176, 53] .http://en.wikipedia.org/wiki/Paramyxovirus Bộ gen của Avian Paramyxovirus chứa một RNA đặc trưng duy nhất, chuỗi âm với trọng lượng phân tử khoảng 5.10 6 Da ( Kolakofsky và ctv, 1974) [151], chiếm khoảng 0,5 % trọng lượng hạt virus. Giải mã trình tự Nucleotide của bộ gen của virus Newcastle cho thấy có độ dài bao gồm 15.186 Nucleotide ( Philips và ctv, 1998) [188]. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 8 Hạt virus có khoảng 20-25% Lipid có nguồn gốc từ tế bào vật chủ và khoảng 6% carbonhydrade. Tổng trọng lượng phân tử của một hạt virus trung bình là khoảng 5.10 8 Da, tỉ trọng trong đường Sucrose là 1,18-1,2 g/l ( Alexander, 2003) [53]. Điện di các tiểu thể virus Newcastle tinh sạch đã bị phá vỡ trên gel Polyacryamid thường cho thấy ít nhất 7 chuỗi Polypeptide. Tuy nhiên một trong 7 chuỗi này là Protein actin của vật chủ tích hợp vào hạt virus. 1.2.3. Các đặc tính sinh học a. Hoạt tính gây ngưng kết hồng cầu Khả năng gây nhưng kết hồng cầu ( Haemagglutination: HA) của virus Newcastle và các APMV khác là do Protein HN bám dính vào các thụ thể nằm trên bề mặt hồng cầu. Đặ c tính này và sự ức chế ngưng kết đặc hiệu bởi huyết thanh miễn dịch đã được chứng minh là công cụ hiệu quả trong chẩn đoán bệnh Newcastle. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 9 Hồng cầu gà thường được dùng trong phản ứng HA nhưng virus Newcastle có thể gây ngưng kết hồng cầu của các loài lưỡng thê, bò sát và những loài chim khác ( Lancaster, 1966) [154]. Avian Paramyxovirus còn có thể làm ngưng kết các tế bào không phải là hồng cầu nếu chúng có thụ thể phù hợp. a. Hoạt tính Neuraminidase Enzyme neuraminidase cũng là một thành phần của phân tử HN. Enzyme này có khả năng lấy đi các thụ thể từ tế bào vật chủ nhằm ngăn cản s ự bám trở lại vào bề mặt tế bào của các hạt virus đã được giải phóng và sự ngưng tụ virus. b. Sự dung hợp tế bào và sự tan huyết Virus Newcastle và các APMV khác có thể làm tan vỡ hồng cầu hay sự dung hợp với tế bào khác bởi cùng một cơ chế. Hiện tượng bám vào vị trí thụ thể khi tái sản được tiếp nối bởi sự dung hợp màng của virus với màng tế bào dẫ n đến sự dung hợp của ít nhất hai hay nhiều tế bào, hình thành các tế bào khổng lồ khi các tiểu thể virus mọc chồi từ các màng tế bào. Màng rắn chắc của hồng cầu thường bị vỡ bởi sự dung hợp của virus (Alexander, 2003) [53]. c. Sự tạo mảng của virus Sự tạo mảng ở môi trường tế bào của các chủng virus Newcastle khác nhau cả về hình dạng lẫn kích thước có hai hình thái của m ảng: sang hoặc đỏ và kích thước Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 10 của mảng tương quan với độc lực của chủng virus đối với gà ( Reeve và postr, 1971) [194]. d. Độc lực của virus Khả năng mẫn cảm với virus Newcastle thay đổi theo loài vật chủ. Gà rất nhạy cảm với virus Newcastle Ở gà khả năng mắc bệnh Newcastle chủ yếu được quyết định bởi chủng virus, mặc dù liều nhiễm, đường lây nhiễm, tuổi và các yếu tố môi trường c ũng có tác động. Gà càng non thể bệnh càng cấp tính. Giống gà không có ảnh hưởng nhiều đến tính mẫn cảm của gà đối với bệnh. Con đường lây nhiễm tự nhiên ( mũi, mắt, miệng) thường dẫn đến các triệu chứng hô hấp, trong khi tiêm vào bắp thịt, tĩnh mạch, màng não thì tăng các triệu chứng thần kinh. Hanson và Bradly (1955) [121] đã xếp các chủng virus Newcastle vào ba nhóm có độc lực khác nhau: virus Newcastle độc lực cao, virus Newcastle độc lực trung bình và virus Newcastle độc lực thấ p dựa vào ba mốc thời gian gây chết phôi gà sau khi virus được tiêm vào túi niệu là < 60 giờ, từ 60-90 giờ và trên 90 giờ. Những nghiên cứu tiếp theo bởi khả năng gây bệnh của virus Newcastle dựa vào giá trị MDT ( Mean Death Time), ICPI ( Intracerebra Pathogenicity Index), IVPI ( Intravenous Pathogenicity Index) đã củng cố và sáng tạo thêm sự phân nhóm này ( bảng 1.2). Bảng 1.2: Phân loại nhóm độc lực của virus Newcastle được đánh giá qua các chỉ số độc lực cơ bản Nhóm độc lực MDT (giờ) ICPI IVPI Viscerotropic VNDV* <60 1.5-2.0 2.0-3.0 Neurotropic VNDV* <60 1.5-2.0 2.0-3.0 Mesogenic NDV 60-90 1.0-1.5 0.0-0.5 [...]... nhiễm bệnh 23 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Chủng độc lực mạnh gây bệnh tích tế bào có kích thước 2-4 mm Chủng độc lực vừa nhóm Mesogenic gây bệnh tích tế bào với kích thước mảng nhỏ 0.6-1.5 mm Đối với chủng độc lực yếu ta phải bổ sung vào môi trường tế bào chất Mg và DEAE mới thấy tế bào bị nhiễm 24 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào IV KẾT LUẬN Bệnh Newcastle. .. dụng nuôi cấy vô trùng + Vệ sinh cá nhân + Chọn nguồn huyết thanh 2.9 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào - Trong chẩn đoán bệnh - Chẩn đoán và điều trị ung thư - Sản xuất kháng thể đơn dòng - Sản xuất vaccine 18 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào - Chẩn đoán biến đổi gen và sản xuất các sản phẩm sinh học ( hormon, enzyme trị liệu ) 3 Chẩn đoán bệnh Newcastle bằng phương pháp nuôi. .. kiện phòng thí nghiệm vẫn tự phân chia, thực hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào 2.2 Các loại tế bào nuôi cấy: Tế bào biểu mô, Nguyên sợi bào, Tế bào cơ, Tế bào thần kinh, Lympho bào 2.3 Một số máy móc thiết bị cần thiết Tủ cấy vô trùng chuyên nuôi cấy tế bào, tủ ấm thường và tủ ấm CO2 tủ lạnh thường và lạnh sâu, bình Nito lỏng, hệ thống nước cất hai lần, hệ thống... Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3.3 Cấy tế bào vào chai - Pha môi trường phát triển: + Trong một lít môi trường căn bản có: • • 200000 UI penniciline • 200 mg streptomycine • 50 mg Mycostatin • - 5% huyết thanh bê sơ sinh ( NCS) 0.75% NaHCO3 Pha tế bào vào môi trường và ra chai: Pha trực tiếp số lượng tế bào thích hợp đã được xác định vào môi trường phát triển Lắc đều tế bào trong... soát việc nuôi cấp tế bào - Đưa tế bào vào môi trường nuôi cấy tiệt trùng - Mật độ lúc cấp 104- 105 tế bào tb/ml - Sau 3 – 4 ngày đạt 106 tế bào hoặc 105 tế bào/ cm2/bề mặt cứng - Sự sinh trưởng ngừng lại do giới hạn chất dinh dưỡng, tích tụ sản phẩm độc, thiếu bề mặt tăng trưởng Lúc này ta cần thay thế môi trường hoàn toàn hay một phần sau 2 ngày để đạt mật độ tối đa cao hơn 17 Chẩn đoán bệnh Newcastle. .. bớt tỉ lệ tử vong trong giai đoạn cuối ổ dịch 25 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào V TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Nguyễn Ngọc Hải Công nghệ sinh học trong thú y 2.Trần Thị Bích Liên Nuôi cấy mô tế bào động vật 3 Dương Quốc Nghĩa Nghiên cuuws bệnh Newcastle trên gà thả vườn ở tỉnh Đồng Tháp và xây dựng quy trình tiêm chủng vaccine phòng bệnh phù hợp 4 http://www.anova.com.vn/contents/article.asp?id=284&detail=16&ucat=44... chỉ có gà con chết nhưng tỉ lệ ít 1%-10% * Bệnh tích: Chủ yếu ở đường hô hấp, khí quản viêm nhẹ d Dạng mang trùng ( không có triệu chứng ) - Không gây chết nhưng nguy hiểm là tồn trữ mầm bệnh làm lây lan cho đàn gà mới nhập 2 Phương pháp nuôi cấy tế bào 2.1 Khái niệm Nuôi cấy tế bào là kỷ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống, các tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm vẫn tự... phần sau 2 ngày để đạt mật độ tối đa cao hơn 17 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2.6 Thu hoạch tế bào 2.7 Bảo quản tế bào - Nhiệt độ: -700C: hàng tuần, hàng tháng - Nhiệt độ: -1960C: lâu hơn 2.8 Nguyên nhân gây nhiễm trùng trong nuôi cấy tế bào - Là do vi sinh vật từ rất nhiều nguồn khác nhau: không khí, tủ cấy, vật dụng, người thao tác, và chất bổ sung vào môi trường - Cách nhận... Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Dung dịch Glycerin 50% có thể giữ virus trong bệnh phẩm 7 ngày ở 370C nhưng không còn khả năng gây nhiễm Ở pH < 2 hoặc pH > 10, virus mất khả năng gây nhiễm, virus cũng dễ bị diệt bởi các tia tử ngoại ( Nguyễn Lương, 1994) [21] 1.3 Đặc điểm dịch tễ học của bệnh Newcastle 1.3.1 Phân bố và diễn biến của bệnh Việc sử dụng rộng rãi phòng bệnh Newcastle. .. phần môi trường 16 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào - Carbohydrate: Glucose cung cấp nguồn năng lượng - Aminoacid nồng độ 0,1- 0,2 mol tiền chất tổng hợp protein - Muối đẳng trương: Giữ cân bằng trong và ngoài tế bào - Bicarbonate: Hệ thống đệm trong sẽ kết hợp 5-10% CO2 ( tủ ủ ) - Vitamin, hormon: Nồng độ sử dụng khác nhau tùy theo nhu cầu các loại tế bào - Phenol red: Chất chỉ . nhiễm trùng trong nuôi cấy tế bào 18 2.9. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào 18 3. Chẩn đoán bệnh Newcastle bằng phương pháp nuôi cấy tế bào 19 1. Thu. Kiểm soát việc nuôi cấp tế bào 17 2.6. Thu hoạch tế bào 18 2.7. Bảo quản tế bào. 18 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3 2.8.