TIỂU LUẬN CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT CÁC TYPE VIRUS CÙNG HỌ VỚI VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN GIỚI THIỆU CHUNG Virus viêm náo nhật bản là một virus thuộc giống flavivirus nằm trong họ Flaviviridae. 1. Giới thiệu về Flaviviridae Arboviruses (arthropod-borne virus) là virus được truyền qua các vết cắn của một tác nhân truyền bệnh là động vật chân khớp . Các loại vi-rút có xu hướng nhân trong các cơ quan của động vật chân khớp . Alphaviruses và Flaviviruses là hai loại phổ biến của Arboviruses. Alphaviruses thuộc về một gia đình, được đặt tên Togaviridae, và Flaviviruses thuộc về một gia đình, được đặt tên Flavivridae. Flaviviridae là một tên họ và tên của nó đến từ một loại vi rút Flaviviridae, được gọi là vi rút Sốt vàng. Họ Flaviviridae có 3 giống (genus, genera): Pestivirus (ví dụ, virus gây bệnh ỉa chảy ở bò), Flavivirus (ví dụ, virus gây viêm não Nhật Bản, virus gây bệnh sốt xuất huyết), và Hepacivirus (ví dụ, virus gây viêm gan C). Rất nhiều loại vi-rút gây bệnh ở người được tìm thấy trong Flaviviridae. Tổng cộng có 69 tác nhân gây bệnh có thể được tìm thấy trong Flaviviridae. Các chi của các Flavivirus bao gồm nhiều loài sinh vật nguy hiểm, và điều này bao gồm các vi-rút sốt vàng da, virus sốt xuất huyết ,virus West Nile Cấu trúc của bộ gen Flaviviridae Các bộ gen của Flaviviridae bao gồm một sợi RNA đơn dương, và bộ gen không phân đoạn. Gen này có 5'-end mang một cặp nucleotide methyl hóa hoặc gene-protein được liên kết. Nó cũng có một cái đuôi polyadenyl cuối 3', polyprotein từ gen RNA tách ra thành 3 protein có cấu trúc và một số protein không cấu trúc. Bộ gen phải trải qua quá trình nhân bản tế bào chất. Cấu trúc virions của Flaviviridae: Các virions của Flaviviridae là hình cầu, đa hình và được bao bọc. Các hạt virions có đường kính từ 40nm đến 50nm . Vỏ bọc là một nucleosapsid hiện diện trong virions của Flaviviridae. Vỏ capsid được cấu tạo từ polymer glycoprotein. Bề mặt của vỏ capsid được tạo thành từ các gai nhỏ bao quanh bởi viền nhấp nhô. Vỏ capsid là môt khối đa diện đối xứng có chứa một lõi protein bên trong, lõi này có đường kính từ 20nm đến 30nm và chúng cùng kích cỡ. 2. Các virus thuộc họ Flaviviridae • Flavivirus: Dengue fever virus Figure 1 “Structure of Dengue Virus” Figure 2 “Arrangement Dengue (Flavivirus) Viral Genome sequence and gene products” (Rice, 1996) giống như tất cả flavivirus, dengue fever virus( DFV) có cấu trúc là sợi RNA đơn dương ,lớp vỏ là một phức hệ của 3 cấu trúc protein: protein lõi(C),protein màng tế bào(M) và protein vỏ(E). Cấu trúc protein virus bộ gen của dengue virus tồn tại như một RNA đa gen , dịch mã tạo ra 10 protein hoạt động. Khoảng ¼ của bộ gen mã hóa cho protein có cấu trúc, trong khi phần còn lại mã hóa cho protein ko cấu trúc. Protein c: 11 kD. Protein này đóng vai trò rắp láp virion. Nó chứa một vùng C-terminal tác động như một chuỗi tín hiệu cho sự chuyển đoạn của protein M vào khoang của ER Protein M: N-terminal của prM khoảng 26 k D và được tạo ra bởi peptidase tín hiệu từ máy chủ trong suốt quá trình giải phóng virus từ tế bào chủ thông qua con đường phân tiết. E protein: thường là glycosylate. E protein là protein cần thiết cho độc tính. Đột biến từ các vùng khác nhau của protein này đã tạo nên các chủng nhỏ của virus. Vỏ glycoprotein có thể tham gia vào quá trình của tế bào chủ. NS1 protein: nó tồn tại trên bề mặt tế bào , hoặc ở hình thức non-virion ngoại bào. Nó góp một phần trách nhiệm trong việc sao chép RNA NS2A protein: là mộtt proteoin kỵ nước chức năng chưa rõ. Một số tài liệu cho thấy nó có chức năng trong việc lôi kéo RNA lam khuôn mẫu cho việc sao chép màng NS2B protein: cũng là một protein màng kỵ nước, là một loại phức hợp với NS3 như là một nhu cầu co-factor cho chức năng serine của NS3. NS3 protein: 1 protein lớn (97kDa), có một vài hoạt đông của 1 enzym liên quan đến quá trình hình thành protein và sao chép màng NS4A và NS4B protein cũng là những protein nhỏ liên quan tới màng . NS4A có chức năng trong việc sao chép RNA và NS4B cũng vậy mặc dù cơ chế chưa xác định. NS5 protein : là protin lớn nhất( 103kDa) ,có hầu như ở các flavirus. Nó cùng với enzym methyl transferase tham gia vào việc hình thành RNA, chịu trách nhiệm về tính ổn định của RNA bằng việc tạo ra cấu trúc 5’ RNA. Hepacivirus: Protein lõi của virus gây viêm gan C, NS3, NS4B và NS5A là những kháng nguyên chính trong miễn dịch dịch thể chống lại HCV Mô hình virus HCV H epatitis C virus (HCV) được phân loại vào giống Hepacivirus thuộc họ Flaviviridae. Bộ gen của HCV là một RNA chuỗi đơn chứa 9.6 kb gồm những vùng không mã hóa 5’-3’ và một khung đọc mở dài mã hóa cho một chuỗi nhiều protein khoảng 3000 axit amin. Chuỗi p rotein này được các protease của tế bào và virus cắt ra thành 11 protein virus khác nhau. Các p rotein cấu trúc của HCV bao gồm protein lõi và các glycoprotein xuyên màng, E1 và E2. Vùng lõi cũng mã hóa cho protein F với chức năng chưa được rõ. Vùng nằm giữa các gen cấu trúc và vùng không mã hóa cho protein cấu trúc thì mã hóa cho protein kênh màng cation p7, quan trọng cho sự sinh sản của virus. Ngoài ra, HCV có 6 protein khác không phải là protein cấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B). NS2 là một cystein protease. NS3 là một protein đa chức năng (serine protease và RNA helicase). NS4A là một đồng yếu tố (cofactor) quan trong cho NS3 protease. Hiện nay có rất ít thông tin về chức năng của protein NS4B ngoài việc chúng tham gia vào sự hình thành mạng lưới màng nơi mà RNA của HCV tiến hành sao chép. NS5A là một phosphoprotein tham gia vào việc hình thành hạt virus và kháng lại các interferon. N S5B mã hóa cho RNA polymerase phụ thuộc vào RNA (RdRp). nhóm nghiên cứu của Maarit Sillanpää đã xác định được các kháng nguyên chính của HCV gồm protein lõi, protein NS4B, NS3, NS5A. Để có được kết quả này, nhóm đã tổng hợp 3 p rotein cấu trúc (protein lõi, E1 và E2) và 6 protein NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B trong tế bào côn trùng Sf9 bằng hệ thống biểu hiện baculovirus. Các protein này đã được tinh sạch và xác định khả năng nhận biết của 68 mẫu huyết thanh bệnh nhân có chứa kháng thể chống lại HCV. Pestivirus: bovine viral diarrhoea virus (BVDV) Cấu trúc gen BVDV Pestivirus có hệ gen RNA đơn dương bao bọc bởi 1 capsid bao gồm protein capsid. Vỏ capsid bao gồm các glycoprotein E1 E2. Bộ gen RNA xấp xỉ 12300 nucleotit và chứa 1 khung đọc mở mã hóa 1 polyprotein khoảng 4000 aminoacid. Khung đọc mở ở hai đầu 5’ và 3’. Nhửng khu vực này chứa các chuỗi tín hiệu quan trọng cho việc sao chép và dịch mả các ORF dịch mã 1 polyprotein, trong tế bào bị nhiễm bệnh và tạo thành các cấu trúc siêu vi C, ERNS, E1, E2 và protein phi cấu trúc P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B. Tác nhân gây bệnh pestivirus sản xuất nhiều NS3, E2 là chất sinh miễn dịch chủ yếu của pestivirus. Sau khi lây nhiễm pestivirus kháng thể chống lại ERNS, E2 và NS3 được sản xuất. Nhưng chỉ có E2 có kháng thể trung hòa. NS3 và NS4A rất quan trọng đối với sự miễn dịch tế bào. I. Chẩn đoán phân biệt Chẩn đoán phân biệt dựa vào biểu hiện bệnh lâm sàng • Hepatitis C virus (HCV): là virus gây bệnh viêm gan C trên người. Thông thường từ 7 đến 8 tuần sau khi bị bệnh , người bệnh thường thấy khó chịu như những cơn cảm cúm, nhức đầu, mệt mỏi, buồn nôn ,đau bụng,tiêu chảy,xuống cân , da mắt trở nên vàng. Các triệu chứng này thường kéo dài từ 6 đến 8 tuần và từ từ thuyên giảm, rồi hoàn toàn biến mất sau một thời gian ngắn. • Dengue fever virus(DFV): là virus gây bệnh sốt xuất huyết thông qua tác nhân là muỗi. Gây bệnh trên người và động vật. Khi virus xâm nhập vào cơ thể gây bệnh, người bệnh có các triệu chứng như: sốt cao đột ngột liên tục từ 2 đến 7 ngày. Xuất huyết ở da:nốt xuất huyết rải rác hoặc chấm xuất huyết thường ở bụng, đùi, lưng Xuất huyế tở niêm mạc: chảy máu mũi, lợi, đôi khi xuất huyết ở niêm mạc, tiểu ra máu • bovine viral diarrhoea virus (BVDV): đây là virus gây nên bệnh tiêu chảy ở bò. súc vật có thời gian ủ bệnh 2-3 ngày, sau dó thể hiện các dấu hiệu lâm sàng đặc trưng: - Chúng uống nước nhiều, ăn ít hoặc bỏ ăn, không nhai lại, thức ăn bị đầy ứ trong dạ dày, lá sách bị cứng. - Sau đó vật ỉa lỏng, đầu tiên có phân sệt, sau đó ỉa chảy nặng, phân chỉ là dịch màu xám xanh, xám vàng và có mùi tanh. Bê ỉa chảy nặng, có thể đi 10-15 lần/ ngày, mất nước nhanh, làm cho con vật trũng mắt, da nhăn nheo và chết trong tình trạng mất nước, rối loạn các chất điện giải trong máu. - Các trường hợp nặng, vật bệnh còn bị xuất huyết ruột, thể hiện phân có lẫn máu và niêm mạc ruột lầy nhầy. Bê non thường bị chết sau 3-4 ngày với tỷ lệ cao 30-40% số vật bệnh nếu không điều trị kịp thời Sử dụng kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán phân biệt: Chẩn đoán phân biệt các chủng virus trên bằng phương pháp RT-PCR Mỗi loại vi sinh vật đều có trình tự bộ gen khác nhau. Mặc dù cả 3 type virus trên đều cùng thuộc một họ nên có cấu trúc phân tử khá giống nhau tuy nhiên chúng vẫn khác nhau về trình tự gene. Nhờ kỹ thuật giải trình tự gene chúng ta có thể biết được các trình tự gen khác nhau giữa các type virus , từ đó xây dưng nên các đoạn mồi đặc hiệu cho từng type virus. Vì vậy để chẩn đoán phân biệt 3 chủng virus trên người ta sử dụng phương pháp RT-PCR sử dụng 3 cặp mồi khác nhau tương ứng với mỗi loại virus. • Đối với Hepatitis C virus : Phản ứng RT-PCR được sử dụng là phản ứng một bước sử dụng cặp mồi do tác giả Caudai đã công bố . Mồi xuôi (CC1F): 5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGG-3’, bao gồm 20 nucleotid, vị trí 69- 88 ở phần đầu của hệ gen HCV. . Mồi ngược (CC2R): 5’-GAGGTTTAGGATTCGTGCTC-3’, bao gồm 20 nucleotid, vị trí 363-344 ở phần đầu của hệ gen HCV Kết quả xét nghiệm RT-PCR phát hiện HCV-RNA được thực hiện với NK HCV-RTPCR kit • Đối với dengue fever virus: Được khuếch đại với một cặp mồi cụ thể cho các khu vực NS5, cFD2 là (GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC) và MA (CATGATGGGRAARAGRGARRAG) Kết quả xét nghiệm RT-PCR phát hiện và định type virút Dengue gây sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue. • Đối với bovine viral diarrhoea virus: Các mồi thiết lập được sử dụng trong PCR Primer-1 (mồi xuôi: 5'-GCA GAT TTT GAA GAA AGA CAC TA-3’ Primer-2 (Reverse) 5'-TTG TGT GTG GTA AGC CCA-3’ Nhờ các đoạn mồi đặc trưng ta có thể chẩn đoán và phân biệt được các type virus với nhau. II. Kết luận: Các giống virus thuộc họ Flaviviridae có cấu trúc phân tử khá giống nhau nên việc sử dụng kỹ thuật RT-PCR là hiệu quả nhất trong việc chẩn đoán phân biệt giữa các loài virus này Hiện nay, phương pháp này đang được ứng dụng rộng rãi thay thế cho việc nuôi cấy phân lập. Tài liệu tham khảo: Google.com.vn Giáo trình “virus học”- Phạm Văn Ty Journal of microbiology.vn . TIỂU LUẬN CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT CÁC TYPE VIRUS CÙNG HỌ VỚI VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN . AGC CCA-3’ Nhờ các đoạn mồi đặc trưng ta có thể chẩn đoán và phân biệt được các type virus với nhau. II. Kết luận: Các giống virus thuộc họ Flaviviridae