1 Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH Bài tiểu luận: CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Nguyễn Duy Lan MSSV: 06126067 _Tháng 10/200 9 2 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành chăn nuôi được coi là một trong những ngành hàng quan trọng để chuyển đổi cơ cấu và thúc đẩy tăng trưởng nông nghiệp. Tuy nhiên, điều quan trọng hàng đầu là trong quá trình chọn giống và nuôi dưỡng chăm sóc, đàn gia súc phải luôn luôn khỏe mạnh, sức đề kháng cao và thành phần các chất dinh dưỡng tích lũy vào thịt có chất lượng tốt và có giá trị sinh học. Bệnh lở mồm long móng (tiếng Anh: Foot-and-mouth disease, viết tắt FMD; tiếng Latin: Aphtae epizooticae), là một loại bệnh rất nguy hiểm do virus gây ra trên động vật móng guốc chẵn như heo, bò, trâu, hươu, dê Bệnh này rất nguy hiểm vì bệnh lây lan rất nhanh trên diện rộng qua nhiều con đường khác nhau như tiếp xúc trực tiếp giữa động vật với nhau, truyền qua không khí Mặc dù tỷ lệ gây chết chỉ cao trên heo con, bê nghé; còn trên các gia súc lứa và trưởng thành nếu được điều trị tốt thú có thể phục hồi sau 1-2 tuần, song thiệt hại về kinh tế rất lớn, do tính lây lan quá mạnh. (8) Chính vì vậy mà Tổ chức Y tế Thế giới xếp bệnh lở mồm long móng đứng đầu các bệnh truyền nhiễm của động vật trong danh mục kiểm dịch quốc tế. Vì hiện nay những nước đã khống chế được bệnh rất hạn chế nhập khẩu gia súc, hoặc các sản phẩm động vật từ các nước chưa khống chế được bệnh LMLM, đây chính là mối nguy hại cho đầu ra của ngành chăn nuôi, cũng như sự phát triển của nó. 3 2. TỔNG QUAN 2.1 Bệnh lở mồm long móng 2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh Mô tả đầu tiên bằng văn bản về dịch có lẽ vào năm 1514, khi Fracastorius mô tả một căn bệnh tương tự trên gia súc tại Italy. Gần 400 năm sau, vào năm 1897 Friedrich Loeffler và Frosch đã chứng minh được tác nhân gây nên bệnh lở mồm long móng có thể qua lọc. Hình: Friedrich Loeffler Đây là minh chứng đầu tiên cho thấy một bệnh trên động vật do tác nhân qua lọc gọi là virus gây ra, mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành virus học (Virology). 1929: Những trường hợp cuối cùng ở Mỹ 1953: Những trường hợp cuối cùng ở Canada và Mexico 1993: Italy 1997: Đài Loan (Taiwan) 2001: Anh (United Kingdom) Vài đợt dịch khác trong những năm 1967-1968 and 1981. Dịch bệnh lở mồm long móng đã xảy ra ở nhiều châu lục như châu Á, châu Phi, châu Âu và Nam Mỹ. (7) Ở châu Âu, bệnh đã bùng phát tại Anh, Hà Lan và Pháp vào năm 2001. Hàng triệu gia súc bị thiêu hủy gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và nền kinh tế các quốc gia này nói chung. Cùng năm đó, dịch cũng đã xảy ra tạ i Hàn Quốc, Nhật Bản và Đài Loan. 4 Đến cuối năm 2003, dịch xảy ra ở vùng Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Myanma, Philippines và Việt Nam. Một năm sau, dịch lan tới Trung Quốc, Nga, Mông Cổ và tiếp tục ở Myanma. Hình: Các đợt dịch FMD năm 2003 Trong 2 năm 2005 và 2006, dịch tràn tới Nam Mỹ ở các quốc gia như Brasil, Argentina và Paraquay cũng như ở châu Phi (Nam Phi). (1) Việt Nam Năm 2006 là năm bệnh dịch lở mồm long móng xảy ra rất mạnh ở hầu hết các tỉnh thành của Vi ệt Nam với hàng chục nghìn gia sục bị nhiễm bệnh. Tuy nhiên, do điều kiện cũng như ý thức của người dân, trình độ và sự thiếu trách nhiệm của cán bộ thú y và chính quyền địa phương mà dịch bệnh không thể khống chế dễ dàng. Một số nơi, còn sử dụng các con vật đã chết làm thức ăn. 2.1.2 Phân bố bệnh trên thế giới Các type huyết thanh có sự phân bố khác nhau trên thế giới. Type huyết thanh O, A được nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới. Trái lại các type huyết thanh SAT1, SAT2, SAT3 được giới hạn ở một số nước thuộc châu Phi. Typ huyết thanh Asia 1 được tìm thấy ở nhiều nước thuộc châu Á. Riêng type huyết thanh C chỉ còn tồn tại một vài nước như Philippines. 5 Theo tài liệu của Cục Thú y, dòng virus gây bệnh LMLM trên gia súc ở Việt Nam thuộc type O, gần đây có xuất hiện virus type A ở miền Trung và virus type Asia 1 ở các tỉnh miền núi phía bắc. (5) 6 Hình: FMD type O virus từ phía Bắc Việt Nam Tính tới ngày 1/11/2009: Ở Tuyên Quang: Ngày 25/10/2009, dịch Lở mồm đã xảy ra trên địa bàn xã Công Đa của huyện Yên Sơn làm 17 con trâu mắc bệnh. Kết quả xét nghiệm bệnh phẩm dương tính với chủng vi rút Lở mồm long móng type O. Hiện tại, địa phương đang tiến hành các biện pháp phòng, chống dịch theo quy định. Hiện nay, cả nước còn 10 tỉnh là: Quảng Nam, Đăk Lăk, Yên Bái, Sơn La, Hà Giang, Quảng Ninh, Gia Lai, Hòa Bình, Lai Châu và Tuyên Quang có dịch LMLM chưa qua 21 ngày. 2.2 Giới thiệu về virus lở mồm long móng 2.2.1 Đặc điểm cấu trúc, hình thái Virus lở mồm long móng ( Foot and Mouth Desease Virus) được phát hiện bao gồm một sợi đơn RNA, kích thước khoảng 8500 base, được bao bọc bởi bốn protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3, VP4) tạo thành lớp vỏ capsid có 20 mặt (icosahedral). (1) VP1, VP2, VP3 tạo nên một bề mặt của khối 20 mặt đối xứng (phân tử 12S) còn VP4 là protein bên trong capside, kết dính ARN virus với mặt trong của capside. 7 Hình: Cấu trúc FMD Virus FMD Virus thuộc họ Picorna Viridae có 7 type (O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1, mỗi type còn có nhiều phụ type, thí dụ như các tiểu type O1, O2, O3 …, A1, A2, A3, C1, C2, C3 … căn cứ vào sự khác biệt về gen và cấu trúc kháng nguyên). Các type virus phân bố không đều nhau trên thế giới, type O là type phổ biến trên thế giới hơn cả. Các type khi giám định huyết thanh đều không có miễn dịch chéo, và trong các ổ dịch, động vật có thể mắc bệnh do một hoặc cùng một lúc nhiều type huyết thanh. Vì thế, nếu có sự biến đổi về mặt di truyền dẩn đến biến đổi về mặt kháng nguyên virus ở các ổ dịch thì việc kiểm soát bệnh bằng vaccine cũ sẽ không có hiệu quả. Virus type A là nhóm có tính đa dạng kháng nguyên cao nhất. Type A có đến 32 type phụ. Và hiện nay người ta vẫn chưa thống nhất được với nhau về số lượng kiểu di truyền của virus type A khi giải trình tự gen VP1. Với virus type C việc giải trình tự gen VP1 cho phép phân chúng thành 8 nhóm di truyền. Virus type Asia 1 có sự đa dạng di truyền ít nhất, chỉ có 1 nhóm di truyền. Giải trình tự gen VP1, type SAT1 có 3 nhóm, SAT2 có 2 nhóm và SAT3 có 3 nhóm di truyền phân bố theo khu vực địa lý rõ ràng. Sự biến đổi của các type huyết thanh cũng khá phức tạp, đôi khi còn những điều chưa được hiểu biết rõ. Do đó ngành thú y phải chọn vaccine đúng với type đang gây bệnh để tiêm phòng. 8 (15) Sức đề kháng của virus: Virus có sức đề kháng mạnh (8) + Ở 600C tồn tại 5-15 phút. + Ở 1000C virus chết ngay lập tức. + Từ 0-40C tồn tại 425 ngày. + Trong đất ẩm virus sống hàng năm, gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển và gây bệnh. + Trong thịt ướp lạnh virus tồn tại khá lâu. 9 + Trong phân ủ thành đống virus tồn tại 7 ngày. + Nước tiểu virus tồn tại 39 ngày. + Virus FMDV không có vỏ bọc, nên chúng có sức đề kháng cao đối với các dung môi hữu cơ ( cồn, ete…). + Mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol, … + Virus bền vững trong khoảng pH = 7 – 7,7. Nhanh chóng bị vô hoạt ở độ pH cao hoặc thấp (pH <2 và pH>11). Ở pH = 6, virus mất khả năng gây nhiễm. 2.2.2 Yếu tố độc tính (1) Function Viral factors Host factors Adsorption and penetration Capsid proteins (VP1 to 3) Integrins, other receptors (?), entry factors (?) Translation Lpro, IRES elements eIFs, PTBP, ITAF45 RNA replication S region, poly(C), cre, 2B, 2C, 3A, 3B, 3Cpro, 3Dpol Cellular membranes, PCBP, PABP Assembly and maturation Capsid proteins (VP0, VP1, and VP3), 3Cpro, 2A, viral RNA Cellular membranes (?) Bảng: Các yếu tố của virus và tế bào chủ có thể quyết định độc lực. Các nghiên cứu cho thấy virus có trình tự RGD của VP1 G-H loop thì hoặc sẽ đột biến hoặc không thể nhân lên trong nuôi cấy hoặc không thể gây bệnh ở gia súc được. (11) Các biến thể virus type O rất thích hợp với các thụ thể HS in vitro, cho thấy tầm quan trọng của sự tương tác virus-intergrin in vivo (Integrin là họ các protein xuyên màng có trong màng của tế bào động vật. Chức năng chính của nó là tạo liên kết với extracellular matrix (ECM) và truyền tín hiệu giữa ECM với tế bào). L pro được cho thấy là một yếu tố quyết định độc lực virus, dựa trên cơ sở thí nghiệm trên động vật với các kỹ thuật di truyền, virus type A 12 được xoá bỏ L pro . Độc lực của virus yếu hơn so với virus hoang dại (wild virus) vì thiếu L pro dẫn đến mất khả năng ngừng tổng hợp protein tế bào (cellular protein). Vai trò của protein 3A trong độc lực virus được chứng minh qua các nghiên cứu phân lập virus FMDV đáp ứng với dịch ở Đài Loan năm 1997 (designated O/Taw/97). Đó là đợt dịch chỉ có heo bị bệnh, gây nên tỷ lệ chết cao, ngoài ra các gia súc khác không bị ảnh hưởng. Nghiên cứu ở mức độ phân tử đã phát hiện được virus chứa codon 10 delection (10- codon deletion) ở nửa cuối đầu C của protein 3A. Vị trí đó tương tự với codon 19-20 delection (19- to 20-codon deletion) tìm thấy trên FMDV chuyển trong phôi gà (FMDV passaged in chicken embryos). Virus này cũng làm giảm độc tính trên bò (12). 10 2.3 Đặc điểm dịch tễ học 2.3.1. Động vật cảm nhiễm (5) Trong thiên nhiên: trâu bò mẫn cảm với bệnh nhất, rồi mới đến heo, dê, cừu, các loài dã thú như hươu, nai, heo rừng…Loài ăn thịt và người ít nhạy cảm với bệnh, loài một móng như ngựa, gia cầm, chim không mắc bệnh. Ở người, theo tài liệu của Chung Văn Lẫm, 1997 Học viện kỹ thuật quốc gia Bình Đông Đài Loan, thì người ăn thịt bò mắc bệnh đã nấu chín, công nhân giết mổ gia súc mắc bệnh lở mồm long móng đều không mắc bệnh. Tuy nhiên, theo tài liệu của BS Nguyễn Vĩnh Phước, người chăm sóc gia súc bệnh lở mồm long móng có thể mắc bệnh do virus xâm nhập qua vết thương ở da, đường tiêu hoá, hoặc hô hấp, thời gian nung bệnh khoảng 4-8 ngày, sau đó xuất hiện các triệu chứng: sốt, mụn nước mọc ở đầu ngón tay, bàn chân, cánh tay và các nơi khác. Đặc biệt, mụn gây ngứa, gây triệu chứng gãi nhiều, đôi khi mụn có thể mọc ở lợi răng, gây viêm miệng. Bệnh có thể kéo dài đến 10 ngày, sau đó sẽ hết bệnh. Chất chứa virus: - Mụn nước là nơi tập trung nhiều virus nhất, đặc biệt là mụn nước sơ phát mới hình thành. - Trên cơ thể thú ngoài mụn nước, các chất bài tiết như nước bọt, nước tiểu, phân, sữa, nước mắt, nước mũi cũng chưá nhiều virus. Số lượng virus trong chất thải này có thể thay đổi tuỳ thuộc vào thời gian mắc bệnh, thường rất cao trong ngày đầu và giảm dần. Sau 2 tuần hầu như không còn thấy virus trong các chất bài tiết. Trung bình 1 con heo mắc bệnh sẽ bài thải khoảng 4 tỉ virus mỗi ngày (gấp 3.000 lần trên bò). - Trên thú chết hoặc bị giết mổ, virus tập trung nhiều trong máu, bắp cơ và ở các nội tạng. Lượng virus trong bắp cơ cao hơn trong máu và có mặt đến ngày thứ 7 sau khi mắc bệnh. 2.3.2. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh (5) Đường xâm nhập chính là tiêu hoá, virus có thể vào cơ thể qua niêm mạc miệng, và niêm mạc ống tiêu hoá. Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi virus xâm nhập vào cơ thể. Đường sinh dục và hô hấp được coi là đường xâm nhập phụ. Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau: + Lây trực tiếp qua nước bọt hoặc các chất bài tiết do nhố t chung hoặc chăn thả chung gia súc bệnh với gia súc khoẻ mạnh. [...]... 11 3.3.4 Triệu chứng bệnh 12 3.3.5 Bệnh tích 15 3.4 Chẩn đoán virus lở mồm long móng .15 3.4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 15 • Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy tế bào 15 • Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 19 3.4.2 Các kỹ thuật chẩn đoán khác 20 4 KẾT LUẬN 20 5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 Phần... non ruột già xuất huyết điểm, long móng, thối móng, rụng xương bàn chân Khi khỏi bệnh thì ở các vết loét sẽ để lại sẹo ở miệng 2.4 Chẩn đoán virus lở mồm long móng 2.4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào a Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào là là đơn vị nuôi cấy nhỏ nhất, là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào ngoài cơ thể sống, các tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm... năng chuyên biệt của tế bào Nuôi cấy tế bào Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được tiến hành lần đầu vào năm 1907 bởi Harrison với những tế bào thần kinh ếch Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy tế bào được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thú y, nhân y, sinh học trong mục đích nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào (dược học, độc tố học), chẩn đoán và điều trị ung thư (ung thư học), chẩn đoán các tác nhân gây... đều, hút vào lọ nuôi cấy đã có sẵn 4ml môi trường phát triển - Đưa lọ vào tủ ấm 37oC / 5% CO2 Thu hoạch tế bào - Dùng trypsin ở 37oC - Để bình nuôi cấy vào tủ lạnh - Cho trypsin ở 37oC vào, tế bào co tròn, bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy b Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Chọn mẫu Lấy mẫu ở đường hô hấp, dịch họng, hay đường tiêu hoá, biểu mô nghi ngờ nhiễm virus Thời gian... không hạn định Những tế bào này sẽ được giữ lại làm những dòng tế bào giống phục vụ cho các nghiên cứu trên tế bào Các loại tế bào nuôi cấy - Tế bào biểu mô (Epithelial cells) - Nguyên sợi bào (Firoblast cells) - Tế bào cơ (Muscle cells) - Tế bào thần kinh (Nerve cells) - Tế bào lympho bào Tế bào động vật có thể được bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196oC, ở nhiệt độ này, tế bào có thể giữ được... xanh 2.4.2 Các kỹ thuật chẩn đoán khác - Chẩn đoán bằng kỹ thuật gen - Chẩn đoán bằng kỹ thuật Elisa - Phương pháp xét nghiệm miễn dịch - Phương pháp xét nghiệm trung hoà huyết thanh - Chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR, RT-PCR, … 3 KẾT LUẬN Bệnh lở mồm long móng là một bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm, lây lan nhanh trên gia súc thuộc bộ guốc chẵn Bệnh là mối nguy hại lớn đối với ngành chăn nuôi gia súc trong... lại trên môi trường nuôi cấy tế bào khi được rã đông (3) Các loại tế bào khác nhau có khả năng phát triển khác nhau Dòng tế bào Nguồn gốc Loại tế bào nuôi cấy BHK Thận chuột Hamster nhỏ Nguyên sợi bào MDCK Thận chó Tế bào biểu mô Vero Thận khỉ Nguyên sợi bào CHO Buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc Tế bào biểu mô (Dòng tế bào: quần thể tế bào giống hệt nhau, bắt nguồn từ một tế bào ban đầu) Một số... học, virus học, vi khuẩn học), chẩn đoán biến đổi gen và sản xuất các sản phẩm sinh học như hormone, enzyme trị liệu (công nghệ gen, công nghệ sinh học) Việc nuôi cấy tế bào động vật đòi hỏi các điều kiện tiệt trùng nghiêm ngặt và môi trường nuôi cấy phức tạp, giàu chất dinh dưỡng Các loại tế bào nuôi cấy 15 Trong nuôi cấy tế bào động vật, người ta phân biệt hai trường hợp: tế bào bậc một hay tế bào. .. trường nuôi cấy tế bào Khi tế bào một lớp được tạo thành (phủ khoảng 70% là có thể nuôi cấy) , đưa mẫu bệnh phẩm vào từ từ, tránh làm bong lớp tế bào ra Thu hoạch tế bào Kết quả 19 • Để xác định virus có gây bệnh tích tế bào hay không, dùng phương pháp nhuộm tế bào (dùng kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang) thực hiện trực tiếp trên môi trường tế bào • Nếu có virus, khi quan sát trên kính hiển vi, do virus. .. phân biệt hai trường hợp: tế bào bậc một hay tế bào sơ cấp và tế bào bậc hai hay tế bào thứ cấp - Tế bào bậc một (Primary cells) là những tế bào thu được trực tiếp từ các cơ quan hay mô động vật - Khi nuôi cấy chuyển tiếp các tế bào này trong điều kiện phòng thí nghiệm sẽ thu được tế bào bậc hai (Secondary cells), những tế bào này có thể được nuôi chuyển tiếp nhiều lần, một số trong đó có khả năng duy . 2.4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào a. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào là là đơn vị nuôi cấy nhỏ nhất, là kỹ thuật duy. trypsin ở 37 o C vào, tế bào co tròn, bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy. b. Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào Chọn mẫu Lấy mẫu