NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN LOÀI LAN HÀI ĐỐM (Paphiopedilum concolor Pfitzer) BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM Khuất Hữu Trung 1 , Kiều Thị Dung 1 , Nguyễn Thuý Điệp 1 , Bùi Thị Thu Hương 2 , Trần Duy Dương 1 , Đặng Trọng Lương 1 Summary Studying on genetic diversity of native Paphiopedilum concolor species in Vietnam The native Paphiopedilum concolor Pfitzer species in Vietnam is very various. Sixteen accessions Paphiopedilum concolor collected from many ecological areas have difference morphological characteristics. In molecular DNA level, twenty-four primers were used in the RAPD analysis to distinguish, by comparing differences in DNA banding patterns. A total of 1738 DNA bands were amplified, and 91 of which (62,3%) were polymorphic. The average of the bands that was amplified by 17 primers was 102,2 bands per primer. Genetic similarity coefficients of sixteen accessions Paphiopedilum concolor in each pair were ranging from 0,56- 0,94. According to these results, sixteen accessions of Paphiopedilum concolor were divided into six groups based on their genetic similarity coefficients. The phylogenetic tree derived from the RAPD results were complemented with morphological characteristics useful for studying the genetic relationships between accessions of Paphiopedilum concolor Pfitzer. Keywords: Paphiopedium concolor, native, genetic diversity, RAPD marker. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Lan Hài (Paphiopedilum) là một nhóm rất khác biệt. Chúng có thể dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa khác thường với cánh môi hình túi sâu trông giống một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ bề ngoài rất đặc sắc. Chính vì vậy “Hài” trở thành tên chung của nhóm lan này. Mỗi loài lan Hài khác nhau đều có những đặc điểm đặc trưng riêng về kích thước, màu sắc của lá, hoa và từng cánh hoa [2]. Ở Việt Nam, lan Hài được chứng minh là rất phong phú và có độ đa dạng cao hơn bất cứ nơi nào khác trên thế giới. Nhiều loài của Việt Nam không chỉ rất hiếm mà còn là loài đặc hữu hẹp của Việt Nam và trên thế giới [1], [6]. Để góp phần tạo lập cơ sở dữ liệu về các đặc điểm hình thái và ở mức phân tử ADN, phục vụ công tác phân loại dưới loài, nhận dạng, gọi tên chính xác, khẳng định chủ quyền quốc gia về loài Hài đốm (Paphiopedilum concolor), chúng tôi thực hiện đề tài: “ghiên cứu đa hình di truyền loài lan Hài đốm (Paphiopedilum concolor Pfitzer) bản địa của Việt am”. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu Vật liệu được sử dụng trong các thí nghiệm bao gồm 16 mẫu lan Hài thuộc loài 1 Viện Di truyền Nông nghiệp; 2 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Hài đốm (Paphiopedilum concorlor Pfitzer) được thu thập từ nhiều vùng sinh thái ở Việt Nam (Lạng Sơn, Hòa Bình, Thanh Hóa, Đắk Lắk ) hiện đang được trồng lưu giữ tại vườn lan Tam Đảo và vườn lan Văn Giang của Viện Di truyền Nông nghiệp (bảng 2). 24 mồi khác nhau sử dụng trong các phản ứng RAPD-PCR có độ dài từ 9-10 nucleotit thuộc nhóm OPA, OPC, UBC, BIO và nhóm S của hãng Bioneer (bảng 1). - Phương pháp mô tả hình thái (theo phương pháp mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái của Pellegrino và cộng sự, 2005) [5]: Sử dụng mắt thường quan sát, từ đó mô tả hình thái, màu sắc của lá, hoa; dùng thước đo chiều dài, chiều rộng của lá, chiều dài và đường kính hoa; thống kê, so sánh số lượng hoa trên một ngồng hoa. - Tách chiết AD tổng số: Lá bánh tẻ của các mẫu được thu thập, xử lí và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp của Obara-Okeyo & Kako (1998) có cải tiến; ADN tổng số được xác định nồng độ bằng phương pháp đo quang phổ và kiểm tra trên gel agarose 0,8% [3], [4]. - Chạy PCR: Các phản ứng PCR được thực hiện theo chương trình: 94 0 C (5 phút), 40-45 chu kì [94 0 C (1 phút); 33 0 C - 36 0 C (30s), 72 0 C (2 phút)] và kết thúc ở 72 0 C (5 phút); sn phNm PCR ưc in di trên gel agarose 1-1,2%. - Phân tích s liu: Kt qu ưc thng kê da vào s xut hin hay không xut hin ca các băng ADN . S liu ưc x lí, phân tích bng chương trình EXCEL version 5.0 và phn mm N TSYSpc 2.1. Bảng 1. Trình tự nucleotit của các primer được sử dụng trong các phản ứng RAPD-PCR STT Primer Trình tự nucleotit STT Primer Trình tự nucleotit 1 OPC2 GTGAGGCGTC 13 BIO27 TGACGCGCTC 2 OPC4 CCGCATCTAC 14 UBC701 CCCACAACCC 3 OPC5 GATGACCGCC 15 UBC709 CCTCCTCCCT 4 OPC10 TGTCTGGGTG 16 UBC728 GTGGGTGGTG 5 OPC11 AAAGTCGCGG 17 S201 GGGCCACTCA 6 OPC14 TGCGTGCTTG 18 S202 GGAGAGACTC 7 OPC15 GACGGATCAG 19 S208 AACGCCGACA 8 OPA2 TGCCGAGCTG 20 S239 GGGTGTGCAG 9 OPA18 AGGTGACCGT 21 S256 CTGCGCTGGA 10 OPA5 AGGGGTCTTG 22 S279 CAAAGCGCTC 11 BIO12 CAATCGCCGT 23 S285 GGCTGCAATG 12 BIO24 CTGGCGGCTG 24 S300 AGCCGTGGAA III. KT QU VÀ THẢO LUẬN 1. Một số đặc điểm hình thái của 16 mẫu Hài đốm Kt qu o m, thng kê mt s c im hình thái ca các mu Hài m nghiên cu ch ra  bng 2. Bảng 2. Đặc điểm hình thái của các mẫu lan Hài đốm Ký hiệu mẫu Số lá /cây Chiều dài lá (cm) Chiều rộng lá (cm) Chiều dài ngồng (cm) Đường kính ngồng (cm) Chiều dài cánh môi (cm) Đường kính cánh môi (cm) Chiều dài cánh bên (cm) Chiều rộng cánh bên (cm) Chiều dài cánh trên (cm) Chiều rộng cánh trên (cm) Đường kính hoa (cm) GL2 5 14,7 3,6 10 0,3 4 2,5 4 3,5 4 4,5 8 HTD5 4 13,8 3,5 8 0,4 2,5 1,6 4 3,5 4 4,5 7 HTD7 5 10,1 3,9 9 0,4 3 1,8 3 3 3,5 3,5 9 HTD13 5 14 2,2 7 0,3 2,2 1,6 2,9 2 2,4 2,3 6 TD33 6 10,6 3,5 10 0,4 3 2,2 5 2,5 3,5 2,7 5,3 TD34 6 10,4 3,6 9 0,4 4 2 5 3,5 3,5 3 7 TD36 6 14,1 3,5 8 0,4 3 1,2 6 2,5 3 4 10 TD37 5 6,4 2,4 6 0,4 4 1,6 4 3 4,5 3,5 6 TD39 6 7,8 3,9 4,7 0,3 3,5 1,8 4 3,5 4,5 4 5,3 TD40 5 10,3 4,1 7,5 0,4 2,5 1,7 5,5 3,4 5,0 4 9 TD41 3 10 3,6 6 0,5 2,2 1,6 3 2,7 2,6 2,7 4,6 TD42 5 7,2 3,4 6 0,4 4 1,5 4 3 4,4 3,5 6 TD45 3 11 3,8 8 0,5 2,2 1,7 3 2,8 2,7 2,6 4,7 TD46 6 7,1 3,2 4 0,4 2,2 1,5 5 3,8 4,5 4 6 TD47 5 8,3 3,4 7 0,3 1,8 1,5 4,5 3,5 4,5 4 6,2 TD49 7 15,2 3,7 9 0,4 2,2 1,4 3,7 2,9 2,8 2,4 4,1 Qua bng 2 cho thy: Các mu Hài m có s lá dao ng t 3 lá/cây (TD45, TD41) n 7 lá/cây (TD49). Chiu dài lá rt khác nhau, dao ng t 6,4 cm (TD37) n 15,2 cm (TD49). Chiu rng lá dao ng t 2,2 cm (HTD13) n 4,1 cm (TD40). c im lá ca các mu thuc loài này thưng ngn, xanh m hoc xanh nht, mt trên lá có nhiu m trng như da báo, mt dưi lá  tía, mt s mu mép lá màu tím  và có răng cưa. Các mu Hài m có chiu dài ngng hoa dao ng t 4 cm (TD46) n 10 cm (GL2, TD33). ưng kính ngng hoa dao ng t 0,3 cm (GL2, HTD13, TD39, TD47) n 0,5 cm (TD41, TD45). Chiu dài cánh môi dao ng t 1,8 cm (TD47) n 4 cm (GL2, TD34, TD37, TD42). ưng kính cánh môi dao ng t 1,2 cm (TD36) n 2,5 cm (GL2). Chiu dài cánh bên dao ng khá ln t 2,9 cm (HTD13) n 6 cm (TD36). Chiu rng cánh bên dao ng t 2 cm (HTD23) n 3,8 cm (TD46). Chiu dài cánh trên dao ng t 2,4 cm (HTD13) n 5 cm (TD40). Chiu rng cánh trên dao ng t 2,3 cm (HTD13) n 4,5 cm (GL2, HTD5). ưng kính hoa dao ng rt ln t 4,1 cm (TD49) n 10 cm (TD36). Cánh hoa thon, tròn  u. Cánh môi hình bu dc hoc hình trng hp, cánh môi rt dày và có mép un cong. Hoa Hài m màu vàng nht, vàng n vàng m, có các m  tía hoc nâu trên khp b mt cánh, hoa có mùi thơm ngt c trưng. Hình 1. Ảnh các mẫu lan Hài đốm 2. Kết quả phản ứng RAPD-PCR ADN tổng số của 16 mẫu lan Hài tách chiết theo phương pháp Okeyo & Kako (1998) có chất lượng khá tốt. Kết quả kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% cho thấy các mẫu ADN có nồng độ tương đối cao, không bị đứt gãy hay lẫn tạp (hình 2). Hình 2. Ảnh điện di AD tổng số của 16 mẫu Hài đốm Kết quả phân tích RAPD-PCR của 16 mẫu lan Hài với tổng số 24 mồi thuộc các nhóm OPA, OPC, BIO, UBC và nhóm S. Trong đó, có 17 mồi cho đa hình rõ rệt là: OPC4, OPC5, OPC10, OPC11, OPC15, S201, S202, S208, S239, S256, S279, S285, S300, UBC709, UBC728, OPA18 và BIO24. Các mồi còn lại cho kết quả đơn hình hoặc đa hình không rõ ràng. Thống kê kết quả phân tích với 17 mồi được trình bày ở bảng 3. Các số liệu thu được ở bảng 3 cho thấy: Với 272 phản ứng PCR nhân lên được tổng số 1738 băng thuộc 146 loại băng có kích cỡ khác nhau. Trong đó có 91 băng cho đa hình (chiếm 62,3%) và 55 băng đơn hình (chiếm 37,7%). Kích thước băng nhỏ nhất khoảng 250 bp và kích thước băng lớn nhất khoảng 2500 bp. Xuất hiện 6 băng cá biệt (chỉ xuất hiện duy nhất ở một mẫu) và khuyết 6 băng ở một mẫu duy nhất còn xuất hiện ở 15 mẫu còn lại. Mồi OPC5 nhân lên được số băng nhiều nhất (218 băng) và ở mẫu HTD7 khuyết 2 băng ở vị trí có kích thước khoảng 500 bp và 300 bp. Mồi OPC10 nhân lên được 114 băng trong đó ở mẫu HTD7 khuyết băng ở vị trí có kích thước khoảng 2500 bp; mẫu TD36 khuyết băng ở vị trí có kích thước khoảng 1200 bp; mẫu HTD13 xuất hiện một băng cá biệt ở vị trí có kích thước khoảng 350 bp. Mồi UBC709 nhân được 101 băng và ở mẫu HTD13 khuyết 1 băng ở vị trí có kích thước khoảng 500 bp. Mồi UBC728 nhân được 152 băng và ở mẫu TD45 khuyết băng ở vị trí có kích thước khoảng 750 bp. Mồi BIO24 nhân lên được 93 băng trong đó mẫu HTD13 có 1 băng cá biệt ở vị trí có kích thước khoảng 1500 bp. Mồi S201 nhân lên được 159 băng và ở mẫu HTD13 khuyết băng ở vị trí có kích thước khoảng 100 bp. Mồi S285 nhân lên được 88 băng và ở mẫu HTD13 xuất hiện băng cá biệt có kích thước khoảng 800 bp. Mồi S239 nhân lên được số băng ít nhất (31 băng) và ở mẫu TD41 xuất hiện 2 băng cá biệt có kích thước khoảng 1000 bp và 1500 bp. Số băng nhân lên trung bình cho cả 17 mồi là 102,2 băng/mồi. Bảng 3. Số băng AD thu được của các mẫu lan Hài nghiên cứu với 17 mồi RAPD Mồi Mẫu OPC 4 OPC 5 OPC 10 OPC 11 OPC 15 S 201 S 202 S 208 S 239 S 256 S 279 S 285 S 300 UBC 709 UBC 728 BIO 24 OPA 18 Tổng GL2 4 13 7 4 5 13 9 5 1 5 7 5 6 5 12 6 5 112 HTD5 4 13 6 6 3 13 9 5 2 5 7 4 5 7 12 4 5 110 HTD7 4 11 5 4 4 10 9 4 0 5 3 4 3 6 4 2 4 82 HTD13 4 14 6 5 3 8 4 5 1 5 7 7 5 5 13 7 3 102 TD33 4 14 8 3 4 0 1 0 0 9 3 6 6 8 12 6 6 90 TD34 4 13 8 6 4 11 9 5 2 7 7 6 5 8 11 6 6 118 TD36 4 14 5 3 5 12 10 5 2 7 6 5 5 8 11 7 6 115 TD37 4 14 10 6 6 10 9 5 2 10 9 6 5 8 12 7 6 129 TD39 4 14 8 4 5 10 9 5 1 8 8 4 5 5 3 7 6 106 TD40 4 14 7 3 6 10 10 5 2 8 5 6 4 6 10 7 3 110 TD41 4 14 7 3 6 8 10 5 6 10 7 6 4 6 10 7 5 118 TD42 4 14 6 7 5 13 8 5 4 10 6 6 4 7 10 7 5 121 TD45 4 14 8 7 4 10 7 5 4 6 6 7 2 6 2 5 4 101 TD46 4 14 8 7 4 9 6 5 1 7 7 6 4 6 10 5 6 109 TD47 4 14 8 6 4 9 8 5 1 6 6 6 4 6 10 5 3 105 TD49 4 14 7 6 4 13 10 5 2 5 6 4 5 4 10 5 6 110 Tổng 64 218 114 80 72 159 128 74 31 113 100 88 72 101 152 93 79 1738 (a) (b) Hình 3. Kết quả điện di sản phm RAPD-PCR (a) Mi OPC10; (b) Mi S279 (M: Marker 1kb). 3. Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu Hài đốm Da trên kt qu thng kê các băng ADN thu được, kết quả thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây quan hệ di truyền của 16 mẫu Hài đốm chỉ ra ở bảng 4 và hình 4. Qua kết quả bảng 4 cho thấy hệ số tương đồng di truyền của 16 mẫu Hài đốm dao động từ 0,56 đến 0,94. Hai cặp mẫu (HTD7 - TD33) và (HTD7 - TD42) có mức sai khác di truyền lớn nhất (hệ số tương đồng di truyền nhỏ nhất là 0,56). Ở mức hình thái, hai cặp mẫu này có nhiều đặc điểm hình thái khác nhau: Mẫu HTD7 có lá màu xanh đậm, mặt dưới có đốm đỏ nâu, mẫu TD33 có lá màu xanh nhạt, mặt dưới màu đỏ tía đậm, còn mẫu TD42 lá bóng, to bản, mặt dưới có nhiều đốm đỏ nâu dày đặc; màu sắc hoa cũng khác nhau: Mẫu HTD7 hoa có màu vàng nhạt, còn 2 mẫu TD33 và TD42 hoa màu vàng đậm. Cặp mẫu (TD46 - TD47) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,94. Mẫu TD46 và TD47 có hình thái lá và hoa khá giống nhau, ở cánh trên và 2 cánh bên hoa đều màu vàng, có nhiều đốm đỏ nhỏ li ti trên khắp cánh hoa. Hai mẫu này chỉ khác nhau ở màu sắc của hoa: Mẫu TD46 hoa có màu vàng nhạt, còn mẫu TD47 hoa có màu vàng đậm hơn. Bảng 4. Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu Hài đốm GL2 HTD5 HTD7 HTD13 TD33 TD34 TD36 TD37 TD39 TD40 TD41 TD42 TD45 TD46 TD47 TD49 GL2 1,00 HTD5 0,88 1,00 HTD7 0,63 0,65 1,00 HTD13 0,76 0,75 0,58 1,00 TD33 0,71 0,68 0,56 0,65 1,00 TD34 0,84 0,84 0,63 0,72 0,78 1,00 TD36 0,86 0,84 0,61 0,72 0,74 0,86 1,00 TD37 0,81 0,80 0,60 0,71 0,77 0,89 0,85 1,00 TD39 0,76 0,71 0,70 0,65 0,68 0,78 0,77 0,81 1,00 TD40 0,82 0,77 0,63 0,74 0,71 0,81 0,88 0,84 0,82 1,00 TD41 0,79 0,75 0,57 0,66 0,72 0,78 0,83 0,82 0,77 0,88 1,00 TD42 0,81 0,80 0,56 0,70 0,70 0,80 0,84 0,82 0,75 0,85 0,88 1,00 TD45 0,69 0,72 0,69 0,63 0,64 0,74 0,69 0,73 0,77 0,76 0,69 0,76 1,00 TD46 0,79 0,80 0,63 0,70 0,75 0,84 0,79 0,84 0,80 0,83 0,79 0,83 0,83 1,00 TD47 0,79 0,78 0,63 0,74 0,70 0,81 0,77 0,80 0,76 0,87 0,79 0,82 0,82 0,94 1,00 TD49 0,85 0,88 0,65 0,74 0,68 0,84 0,84 0,80 0,74 0,80 0,76 0,82 0,76 0,85 0,84 1,00 Hình 4. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 16 mẫu Hài đốm T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 8 Da vào sơ  hình cây v mi quan h di truyn gia các mu Hài m (hình 4) cho thy mc tương ng 80% có th chia 16 mu Hài m thành 6 nhóm: Nhóm I: Bao gồm 9 mẫu GL2, HTD5, TD49, TD34, TD37, TD36, TD40, TD41 và TD42, được chia làm 2 nhóm phụ: Nhóm 1.1: Gồm 6 mẫu GL2, HTD5, TD49, TD34, TD37 và TD36. Hệ số tương đồng dao động từ 0,80 (TD37 - TD49) và (TD37 - HTD5) đến 0,89 (TD34 và TD37). Nhóm 1.2: Gồm 3 mẫu TD40, TD41 và TD42. Hệ số tương đồng giữa 2 cặp mẫu (TD41 - TD40) và (TD41 - TD42) đều là 0,88; giữa TD40 và TD42 là 0,85. Nhóm II: Gồm 3 mẫu TD45, TD46 và TD47, hệ số tương đồng giữa TD45 và TD46 là 0,83; giữa TD45 và TD47 là 0,82; giữa TD46 và TD47 là 0,94. Nhóm III: Gồm duy nhất mẫu TD39 có hệ số tương đồng với 15 mẫu còn lại dao động từ 0,65 (TD39 và HTD13) đến 0,82 (TD39 và TD40). Nhóm IV: Gồm duy nhất mẫu TD33 có hệ số tương đồng với các mẫu còn lại dao động từ 0,56 (TD33 và HTD7) đến 0,78 (TD33 và TD34). Nhóm V: Gồm 1 mẫu HTD13 có hệ số tương đồng với các mẫu còn lại dao động từ 0,58 (HTD7 và HTD13) đến 0,76 (HTD13 và GL2). Nhóm VI: Gồm duy nhất mẫu HTD7 có hệ số tương đồng di truyền với 15 mẫu còn lại dao động từ 0,56 (HTD7 - TD42) và (HTD7-TD33) đến 0,70 (HTD7 - TD39). IV. KẾT LUẬN 1. Kết luận - Loài lan Hài đốm (Paphiopedium concolor Pfitzer) bản địa của Việt Nam rất đa dạng và phong phú. Các mẫu giống thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau đều có các đặc điểm đặc trưng riêng về hình thái. - Ở mức phân tử ADN, kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD-PCR chỉ ra hệ số tương đồng di truyền của các mẫu Hài đốm dao động từ 0,56 đến 0,94; 16 mẫu Hài đốm nghiên cứu được phân thành 6 nhóm khác nhau. - Phương pháp mô tả các đặc điểm hình thái và phương pháp đánh giá đa hình di truyền ở mức độ ADN có thể bổ sung và hỗ trợ lẫn nhau để công việc phân loại dưới loài trở nên chính xác hơn, phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng một cách có hiệu quả các nguồn gen lan Hài bản địa của Việt Nam. 2. Đề nghị Tiếp tục điều tra, thu thập thêm các giống lan Hài phục vụ cho công tác phân loại, bảo tồn và chọn tạo giống mới. Nghiên cứu sâu hơn ở mức phân tử để xác định các marker/chỉ thị nhận dạng chính xác các nguồn gen lan Hài của Việt Nam. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 9 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Hợp, 1998. Phong lan Việt am, Nhà xuất bản Nông nghiệp, 703 trang. 2. Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, guyễn Tiến Hiệp, 2004. Lan Hài Việt Nam, Nhà xuất bản Giao thông vận tải, 308 trang. 3. Li D. M., Sheng Y. Q, and Zhu G. F., 2007. “Analysis of the Germ plasm Resources and Genetic Relationships Among Hybrid Cymbidium Cultivars and Native Species with RAPD Markers”, Agricultural Sciences in China, 6 (8), pp. 922-929. 4. Obara-Okeyo P. and S. Kako, 1998. “Genetic diversity and identification of cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers”, Euphytica, 99, pp. 95-1001. 5. Pellegrino G., Musacchio A., oce M. E., Palermo A. M. and Widmer A., 2005. “Reproductive Versus Floral Isolation Among Morphologically Similar Serapias L. species (Orchidaceae)”, Journal of Heredity, 96 (1), pp. 15-23. 6. Trần Duy Quý, 2005. Sổ tay người Hà Nội chơi lan, Nhà xuất bản Nông nghiệp, tr. 105-107. gười phản biện: Trần Duy Qúy . về loài Hài đốm (Paphiopedilum concolor) , chúng tôi thực hiện đề tài: “ghiên cứu đa hình di truyền loài lan Hài đốm (Paphiopedilum concolor Pfitzer). NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN LOÀI LAN HÀI ĐỐM (Paphiopedilum concolor Pfitzer) BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM Khuất Hữu Trung 1 , Kiều