TCNCYH 27 (1) - 2004 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của củ tam thất (Radix Notoginseng) trên chuột cống trắng gây viêm gan thực nghiệm Dơng Thị Ly Hơng 1 , Nguyễn Trần Giáng Hơng 2 , Phạm Xuân Sinh 1 1 Đại học Dợc Hà Nội, 2 Đại học Y Hà Nội Để đánh giá tác dụng bảo vệ gan của củ tam thất, chúng tôi sử dụng hai mô hình gây viêm gan bằng đờng carbon tetrachlorid (CCl 4 ) và paracetamol (PAR) liều cao trên chuột cống trắng thực nghiệm. Kết quả cho thấy: CCl 4 (50% trong dầu oliu) với liều 1,4 ml/kg, tiêm màng bụng hai lần cách nhau 48 giờ đã làm tăng nồng độ enzym lên 173,2% và SGPT lên 234,6% một cách rõ rệt so với lô chứng (p < 0,001). Chỉ số De Ritis bằng 3,6 - ít thay đổi so với bình thờng. PAR với liều 2 g/kg, đờng uống đã làm tăng một cách rõ rệt nồng độ enzym SGOT lên 6458,5% và SGPT lên 837,5% so với lô chứng (p < 0,001). Chỉ số DE Ritis tăng rất cao bằng 30,7 - trong khi bình thờng là 4,4. Tam thất với liều 5g/kg thân trọng đã làm giảm rõ rệt sự tăng nồng độ enzym SGOT và SPGT trong huyết thanh chuột xuống 29,1% và 43,1% tơng ứng so với lô gây độc bằng CCl 4 (p < 0,05). So với lô gây độc bằng PAR liều cao, tam thất cũng làm giảm đáng kể nồng độ enzym SGOT và SGPT xuống 97,0% và 75,5% tơng ứng (p < 0,001). Tác dụng của tam thất và Silimarin ở cả hai mô hình là tơng đơng nhau (p > 0,05). Hình ảnh vi thể mô bệnh học trên cả hai mô hình cho thấy tam thất có tác dụng bảo vệ gan rõ. I. Đặt vấn đề Bệnh lý gan mật là một trong những bệnh khá phổ biến, chiếm 29,9% tổng số bệnh lý lâm sàng. Trong số đó viêm gan do virus lại là bệnh hay gặp nhất, chiếm 16,7% các bệnh lý về gan mật [3]. Viêm gan do virus là vấn đề y tế mang tính toàn cầu và là mối quan tâm hàng đầu của nhiều quốc gia trên thế giới. Điều trị bệnh viêm gan hiện nay vẫn còn nhiều nan giải và chủ yếu là điều trị triệu chứng. Do tiếp tục nghiên cứu các thuốc có tác dụng bảo vệ gan là một vấn đề cấp thiết. Tam thất (Radix Notoginseng) là một vị thuốc quý đã đợc dùng nhiều trong các trờng hợp té ngã, ứ huyết sng đau và đợc dùng để điều trị các khối u, ung th . ở Trung Quốc, tam thất đợc dùng để điều trị viêm gan và viêm gan mạn thể huyết ứ thấy có kết quả tốt [2]. Để góp phần khẳng định tác dụng của vị thuốc và làm tiền đề cho những ứng dụng trên lâm sàng, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với mục tiêu: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của củ tam thất (Radix Notoginseng) thông qua sự thay đổi nồng độ enzym SGOT, SGPT trong huyết thanh chuột và sự thay đổi hình ảnh mô bệnh học gan chuột trên hai mô hình gây viêm gan bằng CCl 4 và PAR liều cao ở chuột cống trắng thực nghiệm. 39 TCNCYH 27 (1) - 2004 II. Chất liệu, đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Chất liệu: Tam thất do công ty cổ phần Traphaco cung cấp, loại 6 củ/100 gram. Sắc theo phơng pháp sắc đông y đợc dịch chiết toàn phần trong nớc tỷ lệ 1: 2 (100 gram dợc liệu tơng ứng với 200 ml dịch chiết). 2. Đối tợng: Chuột cống trắng khoẻ mạnh cả hai giống, trọng lợng trung bình từ 120 - 150 gram, và từ 160 - 180 gram, đợc nuôi tại bộ môn Dợc lý trờng Đại học Y Hà Nội trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nớc uống. 3. Hoá chất xét nghiệm: - NaCl 0,9%, CCl 4 , dầu oliu, Paracetamol, Silymarin, Carboxyl methyl cullulose (CMC) do bộ môn Dợc lý trờng Đại học Y Hà Nội cung cấp. - Các hoá chất định lợng enzym SGOT, SGPT do hãng Hospitex - Italy cung cấp. 4. Dụng cụ, máy móc: - Bộ dụng cụ cho chuột uống thuốc, pha thuốc, dụng cụ mổ. - Máy xét nghiệm sinh hoá máu của hãng Hospitex - Italy 5. Phơng pháp xét nghiệm: Định lợng enzym Transaminase huyết thanh theo phơng pháp của Bergmeyer 1986: đo độ giảm hấp thụ quang của NAD ở bớc sóng = 340nm trên máy quang phổ Screem master của hãng Hospitex Diagnostic [5]. 6. Phơng pháp nghiên cứu: 1. Mô hình gây viêm gan thực nghiệm bằng CCl 4 : Chuột cống trắng 160- 180g, đợc chia thành 4 lô, mỗi lô 10 con. Lô 1 (chứng): uống NaCl 0,9% - 1 ml/100g Lô 2: uống NaCl 0,9% - 1 ml/100g. Lô 3: uống Silymarin 25 mg/kg pha trong CMC 1% - 1 ml/100 g Lô 4: uống tam thất với liều 5g/kg - 1ml/100g. Chuột đợc uống thuốc 5 ngày trớc khi gây độc. Ngày thứ 6, tiêm màng bụng dung dịch CCl 4 (50% trong dầu oliu) 1,4 ml/kg cho tất cả chuột ở các lô 2, 3, 4 tiêm 2 lần cách nhau 48 giờ. 24 giờ sau lần gây độc cuối, giết chuột lấy máu định lợng enzym SGOT và SGPT, lấy gan làm tiêu bản mô bệnh học. uống thuốc hoặc uống NaCl 0,9% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ngày tiêm CCl 4 tiêm CCl 4 giết chuột lấy máu Sơ đồ nghiên cứu 2. Mô hình gây viêm gan thực nghiệm bằng PAR liều cao. Chuột cống trắng 120 - 150g, đợc chia thành 4 lô, mỗi Lô 1 (chứng): uống NaCl 0,9% - 1 ml/100g Lô 2: uống NaCl 0,9% - 1 ml/100g. Lô 3: uống Silymarin 25 mg/kg pha trong CMC 1% - 1 ml/100 g Lô 4: uống tam thất với liều 5g/kg - 1ml/100g. 40 TCNCYH 27 (1) - 2004 Chuột đợc uống thuốc 5 ngày trớc khi gây độc. Ngày thứ 6, cho tất cả chuột ở các lô 2, 3, 4 uống PAR 2 g/kg pha trong CMC 2%. 48 giờ sau khi gây độc, giết chuột lấy máu định lợng enzym SGOT và SGPT, lấy gan làm tiêu bản mô bệnh học. uống thuốc hoặc uống NaCl 0,9% 1 2 3 4 5 6 7 8 ngày uống PAR giết chuột lấy máu Sơ đồ nghiên cứu Kết quả đợc xử lý bằng phơng pháp thống kê y học, sử dụng 2t test Studen. III. Kết quả 1. Tác dụng bảo vệ gan của tam thất trên mô hình gây viêm gan bằng CCl 4 . Kết quả đợc thể hiện ở bảng 1. Bảng 1: ảnh hởng của tam thất trên sự thay đổi nồng độ SGOT, SGPT trong huyết thanh chuột gây viêm gan bằng CCl 4 (n= 10) Lô Thuốc dùng SGOT (UI/l) % thay đổi SGPT (UI/l) % thay đổi De Ritis 1 NaCl 0,9% 118,210,5 26,9 2,5 4,4 2 NaCl 0,9% + CCl 4 321,853,4 *** 172,3 () 90,0 10,2 *** 234,6 () 3,6 3 Silymarin + CCl 4 230,381,8 a* 28,4 () 46,5 15,6 a* 48,3 () 4,95 4 Tam thất + CCl 4 228,185,3 a*,b 29,1 () 51,115,4 a*,b 43,1 () 4,5 ( ) Tăng so với lô 1 (lô chứng) ( ): giảm so với lô 2 (lô gây độc) ***: p, 0,001 so với lô 1 (lô chứng) a* : p < 0,05 so với lô 2 (lô gây độc) b ; p > 0,05 so với lô uống Silymarin. 2. Tác dụng bảo vệ gan của tam thất trên mô hình gây viêm gan bằng CCl 4 . Kết quả đợc thể hiện ở bảng 2. Bảng 2: ảnh hởng của tam thất trên sự thay đổi nồng độ SGOT, SGPT trong huyết thanh chuột gây viêm gan bằng PAR (n= 10) Lô Thuốc dùng SGOT (UI/l) % thay đổi SGPT (UI/l) % thay đổi De Ritis 1 NaCl 0,9% 118,210,5 26,9 2,5 4,4 2 NaCl 0,9% + CCl 4 7752,1448,5 *** 6458,5 () 252,2 34,6 *** 837,5 () 30,7 3 Silymarin + CCl 4 228,783,9 a*** 97,1 () 48,0 16,2 a*** 80,97 () 4,8 4 Tam thất + CCl 4 232,3 86,9 a***,b 97,0 () 61,812,4 a***,b 75,5 () 3,8 41 TCNCYH 27 (1) - 2004 ( ) Tăng so với lô 1 (lô chứng) ( ): giảm so với lô 2 (lô gây độc) ***: p, 0,001 so với lô 1 (lô chứng) a*** : p < 0,001 so với lô 2 (lô gây độc) b ; p > 0,05 so với lô uống Silymarin. 3. ảnh hởng của tam thất lên hình ảnh mô bệnh học của gan chuột cống trắng gây nhiễm độ bằng CCl 4 . Kiểm tra hình ảnh mô bệnh học gan chuột tại bộ môn Giải phẫu trờng Đại học Y Hà Nội, kết quả nh sau: Hình 1 (x 200) - Lô uống NaCl 0,9%: Cấu trúc các tiểu thuỳ gan rõ. Tĩnh mạch trung tâm và các xoang tĩnh mạch không giãn, không xung huyết, khoảng cửa không có xâm nhập viêm. Hình 2 (x 200) - Lô uống NaCl 0,9% + CCl 4 : Hầu hết các tiểu thuỳ gan có thoái hoá thũng đục và thoái hoá hạt diện rộng quanh tĩnh mạch trung tâm tiểu thuỳ. Khoảng cửa có xâm nhập tế bào viêm. Hình 3 (x 200) - Lô uống Silymarin + CCl 4 : Hầu hết các tế bào gan có các hốc mỡ nhỏ, không gây biến dạng tế bào. Không có hoại tử tế bào gan cũng nh hoại tử mối gặm. Khoảng cửa có xâm nhập viêm nhẹ. Hình 4 (x 200) - Lô uống tam thất + CCl 4 : Các tế bào gan có tổn thơng thoái hoá nhẹ, không gây biến dạng tế bào. Khoảng cửa có xâm nhập tế bào viêm nhẹ. Không có ổ hoại tử tế bào gan. 4. ảnh hởng của tam thất lên hình ảnh mô bệnh học của gan chuột cống trắng gây nhiễm độc bằng PAR Kiểm tra hình ảnh mô bệnh học gan chuột tại bộ môn Giải phẫu bệnh trờng Đại học Y Hà Nội, kết quả nh sau: 42 TCNCYH 27 (1) - 2004 Hình 5 (x 200) - Lô uống NaCl 0,9%: Cấu trúc các tiểu thuỳ gan rõ. Tĩnh mạch trung tâm và các xoang tĩnh mạch không rãn, không xung huyết, khoảng cửa không có xâm nhập viêm. Hình 6 (x 200) - Lô uống NaCl 0,9% + PAR: Mô gan có hoại tử ổ nặng, chủ yếu ở quanh các tiểu thuỳ, hoại tử bắc cầu. Một số tiểu thuỳ có hoại tử ở trung tâm tiểu thuỳ. Các xoang tĩnh mạch giãn và xung huyết. Vùng hoại tử có chảy máu và thâm nhiễm BCĐN. Hình 7 (x 200) - Lô uống Silymarin + PAR: Nhu mô gan tơng đối bình thờng. Không thấy có các hình ảnh tổn thơng. Hình 8 (x 200) - Lô uống tam thất + PAR: Các tế bào gan có thoái hoá thũng đục và thoái hoá hạt nhẹ. Các xoang mạch trung tâm không giãn, tế bào quanh tĩnh mạch trung tâm không bị tổn thơng. Rải rác có ổ hoại tử nhỏ và xâm nhập tế bào viêm. Có tăng sinh, tái tạo tế bào gan. IV. Bàn luận CCl 4 là một chất hữu cơ cơ bản chất không gây độc. Khi vào cơ thể CCl 4 sẽ đợc chuyển hoá tại Cyt P 450 ở mạng nội bào tơng gan để tạo thành CCl 3 . Chính gốc tự do CCl 3 có hoạt tính cao là tác nhân gây tổn thơng tế bào gan thông qua sự peroxy hoá các acid béo cha bão hoà [9] CCl 4 đã đợc dùng nhiều trong các mô hình gây tổn thơng gan để nghiên cứu các thuốc có tác dụng bảo vệ gan [6, 8]. Trong kết quả nghiên cứu chúng tôi, CCl 4 đã làm tăng nồng độ SGOT và SGPT lên 172,3% và 234,6% tơng ứng một cách rõ rệt so với lô chứng (p < 0,01) cho thấy tác dụng độc của CCl 4 trên gan. Silymarin ức chế 28,4% sự tăng SGOT và 48,3% sự tăng SGPT so với lô gây độc bằng CCl 4 (p<0,05), điều này chứng tỏ Silymarin có tác dụng bảo vệ gan rõ rệt. Tam thất với liều 5g/kg cũng ức chế rõ sự tăng SGOT 29,1% và SGPT 43,1% (p <0,05%) so với lô gây độc, tác dụng này là tơng đơng 43 TCNCYH 27 (1) - 2004 với Silymarin liều 25 mg/kg (p >0,05). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng trùng với nghiên cứu của Lại Thị Vân về tác dụng gây độc của CCl 4 trên gan và tác dụng bảo vệ gan của Silymarin [3] PAR là một thuốc hạ sốt, giảm đau đang đợc sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Trong cơ thể, PAR đợc chuyển hoá qua hệ thống Cyt P 450 ở gan để tạo thành Nacetyl P - benzoquioneimine (NAPQI). NAPQI là một chất độc đối với tế bào. Tuy nhiên nếu sử dụng PAR ở liều điều trị thì lợng NAPQI sinh ra thấp sẽ đợc trung hoà ngay bởi GSH của gan và do đó không gây độc cho gan. Khi dùng PAR liều cao, lợng NAPQI đợc sinh ra nhiều, lợng GSH trong gan không đủ để trung hoà hết chất độc, khi ấy tế bào gan sẽ bị tổn thơng [9]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, PAR với liều 2g/kg đã làm tăng nồng độ SGOT và SGPT lên 6458,5% và 837,5% tơng ứng một cách rõ rệt so với lô chứng (p < 0,001) cho thấy tác dụng độc của PAR liều cao trên gan. Chỉ số De Ritis tăng rất cao, tới 30,7% (trong khi bình thờng chỉ là 4,4), điều này chứng tỏ PAR đã làm tổn thơng tế bào gan ở mức ty thể. So sánh với tác dụng gây độc của CCl 4 trên gan thì PAR liều cao đã gây tổn thơng gan nghiêm trọng hơn. Hình ảnh mô bệnh học (hình 6) cũng cho thấy PAR liều cao gây tổn thơng gan rất nặng nề. Silymarin với liều 25 mg/kg đã ức chế 97,1% sự tăng SGOT và 80,9% sự tăng SGPT so với lô dùng PAR đơn độc (p < 0,001). Tam thất với liều 5g/kg cũng ức chế rõ sự tăng SGOT và SGPT (97,0% và 75,5% tơng ứng) so với lô gây độc bằng PAR (p < 0,001). So với Silymarin, tác dụng của tam thất là tơng đơng. Cả Silymarin và tam thất đều làm giảm chỉ số De Ritis, đa chỉ số này về gần bình thờng, điều này chứng tỏ Silymarin và tam thất đã bảo vệ đợc tế bào gan ở mức ty thể. Trên hình ảnh mô bệnh học, ở cả hai mô hình, Silymarin và tam thất đều có tác dụng bảo vệ gan rõ rệt. Silymarin có nguồn gốc từ thực vật, là hoạt chất chiết xuất từ quả của cây cúc gai (Silybum marianum L. Asteraceae) đã đợc nghiên cứu nhiều chứng minh là có tác dụng bảo vệ gan tốt và đợc sử dụng rộng rãi trên lâm sàng [2]. Vì thế chúng tôi chọn làm thuốc chuẩn để nghiên cứu so sánh với tam thất. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy Tam thất với liều 5g/kg có tác dụng bảo vệ gan rõ rệt trên cả hai mô hình gây viêm gan bằng CCl 4 và bằng PAR liều cao, tác dụng này tơng đơng với Silymarin liều 25 mg/kg. Điều này cho phép mở ra một hớng điều trị mới đối với tam thất: điều trị các bệnh gan. Tuy nhiên để khẳng định kết quả cần có những nghiên cứu sâu hơn. V. Kết luận Qua nghiên cứu nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. CCl 4 50% trong dầu oliu với liều 1,4 ml/kg, tiêm màng bụng hai lần - cách nhau 48 h đã làm tăng nồng độ enzym SGOT và SGPT trong huyết thanh chuột cống trắng lên 172,3% và 234,6% một cách rõ rệt so với lô chứng (p<0,001). 2. Paracetamol với liều 2g/kg thể trọng đã làm tăng đáng kể nồng độ enzym SGOT và SGPT trong huyết thanh chuột cống trắng lên 6458,5% và 837,5% so với lô chứng (p < 0,001). Chỉ số De Ritis tăng rất cao, bằng 30,7 (trong khi bình thờng là 4,4). 3. Silymarin với liều 25 mg/kg đã làm giảm đáng kể sự tăng SGOT và SGPT xuống 28,4% và 48,3% tơng ứng so với lô gây độc bằng CCl 4 (p<0,05) và xuống 44 TCNCYH 27 (1) - 2004 97,1% và 80,97% tơng ứng so với lô gây độc bằng PAR liều cao (p < 0,001). 4. Tam thất với liều 5g/kg đã làm giảm nồng độ enzym SGOT 29,1% và SGPT 43,1% so với lô gây độc bằng CCl 4 (p<0,05). So với lô gây độc bằng PAR liều cao, tam thất đã làm giảm một cách rõ rệt nồng độ enzym SGOT xuống 97,0% và SGPT xuống 75,5% (p<0,001). Cả Silymarin và tam thất đều đa chỉ số De Ritis trở về bình thờng trong mô hình gây độc bằng PAR liều cao. Trên cả hai mô hình, tác dụng của tam thất với liều 5g/kg đều tơng đơng với tác dụng của Silymarin liều 25 mg/kg (p > 0,05). Tài liệu tham khảo 1. Trần Văn Kỳ (1993) "Sâm tam thất " - Thuốc bổ đông y, nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng. Hội Y học cổ truyền thành phố Hồ Chí Minh, 32-42. 2. Đào Văn Phan (2000) "Silymarin (Legalon) - Đặc điểm dợc lý và các ứng dụng trong lâm sàng" - Hội thảo khoa học Legalon và ứng dụng Hà Nội, 12-15. 3. Lại Thị Vân (2003) "Nghiên cứu ứng dụng bảo vệ gan và một số tác dụng dợc lý có liên quan của cây nhó đông (Psychotria morindoidess hutch - Rubiaceae)" - Luận văn thạc sĩ y học, trờng Đại học Y Hà Nội. 4. Vũ Đình Vinh (2001) "Hớng dẫn sử dụng các xét nghiệm sinh hoá". Nhà xuất bản Y học, 251-252. 5. Bermeyer H V (1986). J Clin Chem Biochem 24, 497. 6. Chun-Ching Lin et al (2000) "Antioxidant and hepatoprotectve effects of Anoectochilus formosanus and Gynostemma pentaphyllum" - Am. J. Chin. Med. 28 (1), 87-96. 7. Dhawan B N (1997) "Hepatoprotective activity of natural products experimental evaluation" - International workshop medicinal plants their bioactivity. Screening and evaluation lucknow, L15. 8. Jung-Chou Chen et al (2000) "Therapeutic effect of Gypenoside on chronic liver injury and fibrosis induced by CCl 4 , in rats" - Am.J. Chin. Med, 28 (2), 175-185. 9. Lester M. Haddad et al (1998) "Clinical management of posoning and drug overdose", 664-674; 934-938. Summary Study the hepatoprotective effect of Panax Notoginseng on CCl 4 and PAR - intoxicated rat liver To evaluate the hepatoprotective effect of Panax Notoginseng, two rat hepatic intoxication models by high dose CCl 4 and PAR were utilised. The experimental results showed that the oral administration of Panax Notoginseng (aqueous extract) with the dose of 5g/kg body weight has significantly reduced the serum concentrations of SGOT and SGPT with 29,1% and 43,1% respectively in comparison with that of CCl 4 -treated control (p < 0,05). In PAR - intoxicated group, Panax Notoginseng with the dose of 5g/kg body weight resulted in a marked decrease of SGOT and SGPT serum concentrations 97,0% and 75,5%, respectively, which were significantly diffenrent from that of group without Panax Notoginseng. The hepatoprotective effect of Panax Notoginseng with the dose of 5g/kg and Silymarin with the dose of 25mg/kg on both CCl 4 and PAR hepatic-intoxication modesl is the same (p>0,05). In histopathological examinations, Panax Notoginseng has improved CCl 4 - and PAR induced hepatic infuries. 45 . Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng trùng với nghiên cứu của Lại Thị Vân về tác dụng gây độc của CCl 4 trên gan và tác dụng bảo vệ gan của Silymarin. TCNCYH 27 (1) - 2004 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ của củ tam thất (Radix Notoginseng) trên chuột cống trắng gây viêm gan thực nghiệm Dơng Thị Ly Hơng 1 ,