TCNCYH 26 (6) - 2003 ảnh hởng của thổ phục linh (Smilax glabra Roxb) trên nồng độ glucose và insulin máu ở chuột cống đái tháo đờng di truyền chủng GK và trên đảo tụy cô lập Nguyễn Ngọc Xuân 1 , Đào Văn Phan 2 , Ostenson C G. 3 , Nguyễn Khánh Hòa 2 1 Trờng Đại học Tây nguyên 2 Bộ môn Dợc lý trờng Đại học Y Hà Nội 3 Khoa Y học phân tử viện Karolinska Thụy Điển Dạng bột đông khô chiết ethanol của thổ phục linh (SG) liều 100mg/kg- tiêm màng bụng có tác dụng hạ đờng huyết (HĐH) trên chuột cống đái tháo đờng di truyền chủng GK. Tác dụng HĐH mạnh nhất vào giờ thứ 4 sau tiêm (-27,46%; p<0,01) và kéo dài trên 6 giờ. Cùng với tác dụng HĐH, mức insulin máu cũng giảm mạnh ở giờ thứ 2 và giờ thứ 4 (- 42,74%) sau tiêm. SG với nồng độ 2mg và 4mg/1ml không làm ảnh hởng đến sự bài tiết insulin của đảo tụy cô lập. Tác dụng HĐH của SG là làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin. I. Đặt vấn đề Trong các nghiên cứu trớc [1, 2] chúng tôi đã phát hiện tác dụng hạ đờng huyết của thổ phục linh (Smilax glabra Roxb - SG) trên chuột nhắt và đã thăm dò cơ chế hạ đờng huyết trên chuột gây tăng đờng huyết bằng streptozôtcin, trên khả năng dung nạp glucose. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu tiếp tục tìm hiểu sâu thêm về cơ chế tác dụng HĐH của SG, thông qua mô hình chuột đái tháo đờng (ĐTĐ) di truyền GK và trên đảo tụy cô lập. II. Chất liệu và phơng pháp nghiên cứu 1. Chất liệu nghiên cứu. Thân rễ của SG đợc phơi khô và chiết trong ethanol thu đợc dạng bột đông khô; 100g dợc liệu khô tơng đơng 3,5 g bột đông khô (chi tiết xin xem [1,2]). Chuột cống ĐTĐ di truyền chủng GK có đặc điểm: Tăng đờng huyết vừa phải, rối loạn bài tiết insulin ở cả 2 pha sớm và muộn, kháng insulin mức độ nhẹ và không cần bồi phụ insulin để duy trì sự sống [3,4]. Chuột cống chủng Wistar cả 2 giống khỏe mạnh. Chuột cống cả 2 giống (chủng GK và chủng Wistar) cân nặng 180-220g, do phòng chăn nuôi viện Karolinska cung cấp. Thí nghiệm đợc tiến hành tại khoa Y học phân tử, viện Karolinska, Thuỵ Điển. 2. Phơng pháp nghiên cứu. 2.1. Đánh giá tác dụng của SG trên nồng độ glucose và insulin máu ở chuột cống ĐTĐ di truyền chủng GK và chuột cống bình thờng chủng Wistar. Với mỗi chủng chuột, dùng 2 lô, lô 1 tmb NaCl 0,9% (dùng làm lô chứng), lô 2 tmb SG 100mg/kg. Xác định đồng thời nồng độ glucose và insulin máu vào thời điểm trớc lúc tiêm thuốc (0 giờ), 2, 4 (và 6 giờ chỉ riêng với glucose) sau tiêm thuốc. 17 TCNCYH 26 (6) - 2003 2.2. So sánh mức insulin máu giữa chuột cống ĐTĐ GK và chuột cống chủng Wistar. Các chuột Wistar và chuột ĐTĐ chủng GK đợc lấy máu ở 3 thời điểm khác nhau để xác định nồng độ insulin máu. 2.3. Đánh giá ảnh hởng của SG trên bài tiết insulin của đảo tụy cô lập. Chuột cống chủng Wistar khỏe mạnh, cân nặng 180-200g, Sau khi giết(bằng cách cho thở khí CO 2 10 phút), bóc tách tuyến tụy, tách các đảo tụy và nuôi cấy theo phơng pháp Langerhans [6]. Các đảo tụy đã cô lập đợc chia thành 4 nhóm. Nhóm 1 (chứng) đợc ủ trong dung dịch KRB (Kreb-Ringer Buffer) với 3,3mM glucose, nhóm 2, 3 và nhóm 4 đợc ủ trong điều kiện tơng tự nhóm chứng nhng cho thêm SG 2mg/ml, 4mg/ml và tolbutmid 100àM/l lần lợt cho các lô 2, 3 và 4. Sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ 37 0 C, nhặt hết các đảo tụy và định lợng insulin có trong dịch ủ. Định lợng glucose trên máy YSI 2300 STAT theo nguyên lý đếm số electron sinh ra khi glucose bị oxy hóa bởi enzyme glucose oxidase. Định lợng insulin máu bằng phơng pháp miễn dịch phóng xạ [5]. Nghiên cứu đợc tiến hành tại Labô trung tâm Y học phân tử Viện Karolinska Thụy Điển. III. Kết quả 1. Tác dụng của SG trên nồng độ glucose máu ở chuột cống ĐTĐ GK. Bảng 1. ảnh hởng của SG trên nồng độ glucose máu ở chuột GK (n=6/lô). Nồng độ glucose máu sau tiêm thuốc (mg/dl) 0 giờ 2 giờ 4 giờ 6 giờ Chứng 192,6 9,9 183,78 20,7 164,52 23,94 238,68 21,06 SG100mg 199,26 37,98 145,44 21,42 (-20,86%) (1) * (-27,00%) (2) 119,34 23,4 (-27,46%) (1) ** (-40,10%) (-2) 190,62 42,3 (-20,13%) (1) (-4,33%) (2) * P< 0,05, **P<0,01 (giá trị p so với chứng cùng thời điểm); (1) % hạ đờng huyết so với chứng ở cùng thời điểm, (2) % HĐH so với lúc cha tiêm thuốc (0 giờ). Nhận xét: SG 100mg-tmb tác dụng HĐH xuất hiện ở giờ thứ 2 mạnh nhất giờ thứ 4 và kéo dài trên 6 giờ. 2. ảnh hởng của SG trên nồng độ insulin máu ở chuột cống ĐTĐ GK. Cùng với định lợng glucose máu, các chuột ở thực nghiệm 1 cũng đợc xác định insulin máu vào các thời điểm 0 giờ (cha tiêm thuốc), 2 và 4 giờ sau tiêm thuốc. Kết quả đợc trình bày ở bảng2. 18 TCNCYH 26 (6) - 2003 Bảng 2. ảnh hởng của SG trên nồng độ insulin máu ở chuột GK (n=6). Nồng độ insulin máu sau tiêm thuốc (mic UI/ml) 0 giờ 2 giờ 4 giờ Chứng 29,44 3,54 28,55 5,58 22,246 2,08 SG 100mg-tmb 26,79 6,78 16,79 5,39 (41,17%) ** (1) (-37,32%) (2) 12,73 4,51 (42,74%)** (1) (-52,48%) (2) **P<0,01(giá trị p so với chứng ở cùng thời điểm), (1) % mức insulin giảm so với chứng, (2) mức insulin giảm so với lúc cha tiêm thuốc (0 giờ). Nhận xét: SG 100mg/kg-tmb, làm hạ thấp mức insulin máu, mức insulin hạ mạnh ở giờ thứ 2 và giờ thứ 4. 3. ảnh hởng của SG trên nồng độ glucose máu ở chuột Wistar. Bảng 3. ảnh hởng của SG trên nồng độ glucose máu ở chuột Wistar (n=5/lô). Nồng độ glucose máu sau tiêm thuốc (mg/dl) 0 giờ 2 giờ 4 giờ 6 giờ Chứng 94,84 1,98 102,96 5,14 102,6 4,86 92,52 3,49 SG 100mg- tmb 95,04 2,66 84,24 6,66 (- 18,18%) (1) * (-11,36%) (2) 79,2 6,3 (- 22,80%) (1) ** (-16,66%) (2) 80,64 8,64 (- 12,84%) (1) (-15,15%) (1) phần trăm HĐH so với chứng cùng thời điểm, (2) % HĐH so với lúc cha tiêm thuốc (0 giờ) * p< 0,0, **p<0,01 Nhận xét: SG1 100mg-tmb có tác dụng HĐH, mức HĐH xuất hiện ở giờ thứ 2, mạnh nhất ở giờ thứ 4 và kéo dài trên 6 giờ. 4. ảnh hởng của SG trên nồng độ insulin máu ở chuột cống wistar. Cùng với định lợng glucose máu, các chuột ở thực nghiệm 3 cũng đợc xác định insulin máu vào các thời điểm 0 giờ (cha tiêm thuốc), 2 và 4 giờ sau tiêm thuốc. Kết quả đợc trình bày ở bảng 4. Bảng 4. ảnh hởng của SG trên nồng độ insulin máu ở chuột cống Wistar (n=5/lô). Nồng độ insulin máu sau tiêm thuốc (micUI/ml) 0 giờ 2 giờ 4 giờ Chứng 13,93 2,71 13,74 4,57 14,47 5,0 SG 100mg/kg 13,63 3,47 17,81 3,98 14,62 5,45 p> 0,05 (giá trị p so với chứng ở cùng thời điểm) Nhận xét: SG 100mg-tmb không làm thay đổi mức insulin máu so với chứng. 5. So sánh mức insulin máu ở chuột cống GK và chuột Wistar. Xác định insulin máu của nhóm chuột GK và chuột Wistar ở các thời điểm 0 giờ bắt đầu lấy máu, 2 và 4 giờ sau lấy máu. Kết quả đợc trình bày ở bảng 5. 19 TCNCYH 26 (6) - 2003 Bảng 5. So sánh mức insulin máu ở chuột cống GK và chuột Wistar (n=5/lô). Nồng độ insulin máu (mic UI/ml) 0 giờ 2 giờ 4 giờ Chuột Wistar 12,19 4,58 16,14 4,28 11,42 3,25 Chuột GK 26,8111,34 * 30,5911,09 * 26,15 7,75 * * p<0,05 (giá trị p so giữa chuột GK và chuột Wistar) Nhận xét. Chuột GK có nồng độ insulin máu cao xấp xỉ gấp 2 lần chuột Wistar. 6. Đánh giá ảnh hởng của SG trên bài tiết insulin của đảo tụy cô lập. Các đảo tụy đã cô lập đợc ủ với SG (2 hoặc 4mg/ml) hoặc tolbutamid 100àM/l. Sau 1 giờ ủ, xác định nồng độ insulin có trong dịch ủ. Kết quả đợc trình bày ở bảng 6. Bảng 6. ảnh hởng của SG trên bài tiết insulin ở đảo tụy cô lập. Nồng độ insulin máu (mic UI/đảo tụy/giờ) Chứng (n=10) 15,47 4,34 SG 2mg (n=10) 12,96 4,44 SG 4mg n=10 13,64 5,98 Tolbutamid 100àM/l (n=10) 24,6 11,49* P>0,05; (giá trị p so với chứng),* p<0,05 Nhận xét: SG 2mg, 4mg/ml không làm thay đổi bài tiết insulin ở đảo tụy cô lập. IV. Bàn luận Trên chuột ĐTĐ GK, SG 100-tmb có tác dụng HĐH, mức HĐH bắt đầu ở giờ thứ 2 (20,86%) và mạnh nhất ở giờ thứ 4 (27,46%); Cùng với tác dụng HĐH, mức insulin máu cũng giảm, sau 2, 4 giờ tiêm SG, mức insulin máu giảm lần lợt 41,17% và 42,74% so với chứng (p<0,01). Trên chuột Wistar, với cùng liều SG 100mg-tmb, mặc dù đờng huyết giảm (22,8%) nhng mức insulin máu thì lại không thay đổi (p>0,05). Nguyên nhân nào dẫn đến sự khác biệt về ảnh hởng của SG đối với insulin trên 2 giống chuột trên ? Về lý thuyết, để có tác dụng HĐH, SG có thể kích thích tế bào tụy bài tiết insulin hoặc/và tăng nhậy cảm của mô đích với insulin, 2 khả năng này đều có thể xẩy ra. Khả năng kích thích bài tiết insulin đã đợc loại trừ vì cả trên chuột ĐTĐ GK và chuột Wistar mức insulin máu sau tiêm SG đều không tăng; mặt khác kết quả nuôi cấy đảo tụy cho thấy không có sự khác biệt mức bài tiết insulin giữa lô trị và lô chứng (bảng 6). Nh vậy chỉ còn khả năng là SG đã làm tăng nhậy cảm của mô đích với insulin, hay nói cách khác, SG giúp insulin gắn vào receptor nhiều hơn và phát huy tác dụng sinh học mạnh hơn. Chính khả năng này giúp lý giải sự khác biệt tác dụng của SG trên mức insulin máu giữa chuột ĐTĐ GK và chuột Wistar. Chuột ĐTĐ GK với đặc điểm rối loạn bài tiết insulin và kháng insulin [3, 4], còn chuột Wistar không có biểu hiện kháng insulin. Với cơ chế tăng nhậy cảm của insulin với mô đích, SG đã giúp insulin gắn vào receptor nhiều hơn và kết quả là mức insulin ở chuột GK hạ thấp (giảm 42,74% so với chứng); còn ở chuột Wistar thì mức insulin máu không đổi (bảng 4). Để khẳng định đặc điểm kháng insulin ở chuột GK chúng tôi cũng đã so sánh mức insulin máu ở cả 3 thời điểm khác nhau giữa chuột GK và chuột Wistar. Kết quả cho thấy ở cả 3 thời điểm, mức insulin máu ở chuột GK cao xấp xỉ gấp 2 lần chuột Wistar (bảng 5). Nh vậy chính 20 TCNCYH 26 (6) - 2003 sự khác biệt đặc điểm kháng insulin giữa chuột GK và chuột Wistar đã lý giải sự khác biệt tác dụng của SG trên mức insulin máu và khẳng định cơ chế tác dụng của SG chính là làm tăng nhậy cảm của mô đích với insulin. V. Kết luận Trên chuột cống ĐTĐ di truyền chủng GK, SG liều 100mg/kg tmb có tác dụng HĐH, mức HĐH bắt đầu ở giờ thứ 2, mạnh nhất ở giờ thứ 4 và kéo dài trên 6 giờ. Cùng với tác dụng HĐH, mức insulin máu cũng giảm đáng kể so với chứng. Tác dụng HĐH của SG là do cơ chế: - Không kích thích tế bào tuyến tụy bài tiết insulin. - Làm tăng nhậy cảm của mô đích với insulin. Nh vậy SG có thể sử dụng cho điều trị ĐTĐ typ 2. Tài liệu tham khảo 1. Đào Văn Phan, Nguyễn Ngọc Xuân, Nguyễn Duy Thuần (2000), Bớc đầu tìm hiểu cơ chế tác dụng hạ đờng huyết của thổ phục linh (Smilax glabra Roxb-Liliaceae). Tạp chí nghiên cứu Y học, Vol 11, N 0 1, Bộ Y tế, Đại học Y Hà Nội, Tr. 37-42. 2. Nguyễn Ngọc Xuân, Đào Văn Phan, Nguyễn Duy Thuần (2000), Bớc đầu nghiên cứu tác dụng hạ đờng huyết của thổ phục linh (Smilax glabra Roxb) trên chuột nhắt. Tạp chí Dợc lý học, số 4, Tr. 12-13. 3. Amel Guenifi (1999), Mechanisms of impaired insulin release in type-2 diabetes: Studies in the GK rat model, Stockholm. 4. Goto Y, Kakizaki M, Masaki N. (1975), Spontaneous diabetes produced by repeated selective breeding of normal Wistar rats. Proc. Japan Acad, Pp. 80-85. 5. Herbert V., Lau K S, Gottlier CW, Bleicher S J. (1965), Coated charcoal immunoassay of insulin. j. Clin. Endocrinol. Metab. Pp. 1375 - 1384. 6. Lacy PE, Kostianovsky M. (1967), Method for the isolation of intac islets of Langerhans from the rat pancrease. Diabetes, 16, Pp. 35-39. Summary Effect of Smilax glabra Roxb on blood glucose of diabetic GK rat and on the isolated pancreas islets of normal rat The hypoglycemic effect of rhizomes of Smilax glabra Roxb (SG) was investigated in GK rat, one of the animal model of non-insulin-dependent diabetes mellitus. The ethanol extract of SG (100mg/kg of body weight) reduced the blood glucose and plasma insulin levels of GK rat 4 h after intraperitoneal administration (p<0.01), while on the normal Wistar rat, it reduced only the glycemia. On the isolated pancreas islets, SG with the concentration of 2mg or 4mg/1ml/h was no effect on insulin secretion. From this finding, we suggest that the hypoglycemic effect of SG is due to increase the sesibility of target tissue to insulin. 21 . ảnh hởng của thổ phục linh (Smilax glabra Roxb) trên nồng độ glucose và insulin máu ở chuột cống đái tháo đờng di truyền chủng GK và trên đảo tụy cô. dụng của SG trên nồng độ glucose máu ở chuột cống ĐTĐ GK. Bảng 1. ảnh hởng của SG trên nồng độ glucose máu ở chuột GK (n=6/lô). Nồng độ glucose máu