TCNCYH 22 (2) - 2003 Sử dụng multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori Nguyễn Thị Thanh Lợi và Nguyễn Thị Hồng Hạnh Viện Công nghệ Sinh học - Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia ở Việt Nam, vi khuẩn Helicobacter pylori có thể mang các kiểu gien khác nhau do gien có thể bị đột biến hoặc khiếm khuyết. Vì thế, việc phát hiện chúng bằng nhân bản một gien (PCR đơn) có thể cho các kết quả âm tính giả. Multiplex PCR nhằm khuyếch đại ba gien mã hoá cho các protein độc tính CagA, Urease B và HP1125 của vi khuẩn Helicobacter pylori đã đợc nghiên cứu và có thể sử dụng trong thực tế lâm sàng ở Việt Nam. I. Đặt vấn đề Cho đến nay, các nhà nghiên cứu đều thống nhất cho rằng, gần một nửa dân số trên thế giới bị nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori [7,2]. Loại vi khuẩn Gram-âm này đã gây ra rất nhiều rối loạn nghiêm trọng về tiêu hoá, bao gồm viêm loét dạ dày và hành tá tràng với biểu hiện nặng nhất là ung th dạ dày [4]. Cũng nh nhiều năm trớc đây, ngày nay, việc phát hiện và chẩn đoán các bệnh do nhiễm khuẩn Helicobacter pylori vẫn còn là mối quan tâm của các nhà khoa học, vì vi khuẩn hết sức đa dạng về mặt sinh học [3,5]. Một vài nghiên cứu cho thấy, nếu các cặp primers thiết kế cho phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn H. pylori ở các nớc phơng Tây không hiệu lực khi phát hiện các chủng châu á [8]. ở Việt Nam, vi khuẩn Helicobacter pylori, theo nghiên cứu đợc phân lập từ các bệnh nhân có thể khiếm khuyết gien cagA hoặc gien Urease B [6]. Do thế, nếu chỉ tiến hành PCR đơn để nhằm phát hiện một gien thì các kết quả âm tính giả có thể xảy ra. Để khắc phục nhợc điểm này chúng tôi đề nghị sử dụng Multiplex PCR để khuyếch đại đồng thời nhiều gien trong một ống nghiệm. Phơng pháp này có u điểm là nhanh, rẻ tiền và cho nhiều thông tin về vi khuẩn hơn là PCR đơn, ba gien mã hóa cho ba protein bệnh lý: UreaseB, CagA và HP1125 - một protein màng ngoài của vi khuẩn - đợc lựa chọn cho thử nghiệm. Mục tiêu nghiên cứu là đánh giá khả năng sử dụng Multipex PCR trong chẩn đoán vi khuẩn Helicobacter pylori trong các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân. II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng Sinh thiết của ngời bệnh bị loét dạ dày cha qua điều trị kháng sinh đợc lấy bằng máy nội soi ống mềm 2T-10 (Olympus-Nhật bản) và đợc giữ trong môi trờng vận chuyển (theo Seelinger H.P.J và Schroter G.,1990) và đợc bảo quản ở -80 0 C. 2. Phơng pháp 2.1. Phân lập vi khuẩn Helicobacter pylori từ sinh thiết bệnh nhân. Sinh thiết của bệnh nhân đợc nghiền kỹ, sau đó dịch nghiền đợc cấy lên môi trờng thạch đặc trng cho vi khuẩn H.pylori có chứa 7% máu ngựa và một số chất khác nh kháng sinh [2]. Đĩa có vi khuẩn đợc đặt trong bình vi hiếu khí của hãng BBL (Becton Dickinson Microbiology System, Cockeysville) ở 37 0 C. Sau 48-72 ngày, thu thập vi khuẩn (chủng VNH-85) cho các nghiên cứu tiếp theo. Công trình nghiên cứu này đợc thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học- Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia. 1 TCNCYH 22 (2) - 2003 2.2. Tách chiết ADN từ vi khuẩn và sinh thiết bệnh nhân. *) Từ vi khuẩn: Vi khuẩn H. pylori đợc thu thập từ đĩa nuôi cấy và rửa 2 lần bằng 1xPBS. Tách ADN của vi khuẩn bằng chế phẩm sinh học QIAmp Tissue Kit. *) Từ sinh thiết bệnh nhân: Bệnh phẩm đợc nghiền trong dung dịch 1 x PBS, sau đó đợc ủ với Proteinase K 20mg/ml ở 37 0 C trong 2 giờ. Sau khi đợc phenol hoá để loại protein, ADN đợc tủa bằng cồn tuyệt đối có bổ sung Natri axetate đến nồng độ cuối cùng 0,3M. Độ sạch của ADN đợc kiểm tra bằng phơng pháp điện di trên gel agaroza 0,8%., dung dịch đệm 1xTAE. 2.3. PCR đơn và Multiplex PCR *) PCR đơn 5-10ng ADN đợc dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng khuyếch đại gien cagA + , Urease B và Hp1125. Phản ứng đợc thực hiện trên máy PTC-100 TM Programmable Thermal controller. +) Gien cagA + : Cặp mồi F 1 , F 2 đợc dùng để khuyếch đại đầu 5 gien cagA + kích thớc 460 bp có trình tự sau: F 1 :5-ACC-ATT-GAT-CAA-ACA-ACA- ACA-CC-3 F 2 :5-AGG-GGG-TTG-TAT-GAT-ATT- TTC-CAT-3 Chu trình nhiệt của phản ứng: 94 0 C 1phút 58 0 C 1 phút 72 0 C 1 phút Lặp lại 35-40 chu kỳ. +) Gien ureaseB Cặp mồi F 3 , F 4 đợc dùng để khuyếch đại toàn bộ gien ureaseB kích thớc 1700 bp có trình tự là: F 3 :5-CAG-CAT-ATG-AAA-AAG-ATT- AGC-AG-3 F 4 :5-AAT-GCT-AAA-GAG-TTG-CGC- CAA-G-3 Chu trình nhiệt của phản ứng: 94 0 C 1 phút., 58 0 C 1 phút., 72 0 C 1 phút Lặp lại 35 40 chu kỳ. +) Gien Hp1125 Cặp mồi đợc sử dụng để khuyếch đại 540 bp của đầu 5 của gien có trình tự là: L:5-ATG-AAG-AGA-TCT-TCT-GTA- TTT-AGT-T-3 R:5-TTA-CTT-CAC-TAA-TTT-GAT- CCA-CT-3 Chu trình nhiệt của phản ứng: 94 0 C 1 phút 55 0 C 1 phút 72 0 C 1 phút Lặp lại 35-40 chu kỳ. Sản phẩm PCR của từng gen trên đợc kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. Đệm điện di 1xTAE *) Multiplex PCR Phản ứng đợc thực hiện với sự có mặt cả 3 cặp mồi của 3 gien: cagA + , Urease B, Hp1125. Phản ứng PCR đợc tối u hoá trong thể tích 25àl: 5ng ADN tổng số đợc dùng làm khuôn cho phản ứng, 1àM của mỗi cặp mồi, 2,5àl của 10 x dịch đệm, 200àM của mỗi dNTP, 2,5 đơn vị AmpliTaq DNA polymerase, thêm H 2 O (khử ion và đã khử trùng) đến 25àl. Chu trình nhiệt của phản ứng: 94 0 C 1 phút 50 0 C 1 phút 30 giây 72 0 C 2 phút Lặp lại 35 40 chu kỳ. Sản phẩm của phản ứng Multiplex PCR đợc kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. Đệm điện di 1xTAE. 2 TCNCYH 22 (2) - 2003 III. Kết quả 1. Sử dụng phơng pháp PCR đơn để phát hiện các gien ureaseB, cagA và HP1125 của chủng vi khuẩn Helicobacter pylori VNH - 85 (chủng Việt Nam). Các kết quả phân tích các sản phẩm PCR đơn của ba gien cagA., Hp1125 và UreaseB đợc trình bày ở hình 1. Trong nghiên cứu này, các gien đợc khuyếch đại có phân tử lợng khoảng 460 bp (cagA)., 540bp (Hp1125) và 1700 kb (UreaseB) là những kích thớc chờ đợi. ảnh điện di đồ 1 cũng cho thấy, không có một băng ADN nào đợc khuyếch đại thêm, ngoài những băng của cagA, Hp1125 và UreaseB, chứng tỏ các cặp mồi thiết kế đặc trng cho phân tích. 2. Sử dụng Multiplex PCR để phát hiện cùng một lúc ba gien cagA, UreaseB và Hp1125 trong vi khuẩn H. pylori chủng VNH - 85 (chủng Việt Nam). Sau hàng loạt các thử nghiệm để tối u hoá phản ứng Multiplex PCR, chúng tôi đã khuyếch đại đợc cả ba gien trong một ống nghiệm. Hình 2 là kết quả điện di đồ của các sản phẩm PCR. Nh đã thấy, ba gien cagA., Hp1125 và Urease B đã đợc khuyếch đại và cho các sản phẩm có phân tử lợng nh đã chờ đợi: 1700 bp cho gien UreaseB., 540 bp cho gien HP1125 và 460 bp cho gien cagA. M 1 IV. Bàn luận Vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng Việt Nam đa dạng về mặt sinh học. Chúng có thể khiếm khuyết một trong hai gien cagA và urease B [1]. Nguyên nhân do các quá trình siêu đột biến xảy ra trong hệ gien của vi khuẩn. Trong một nghiên cứu trên hơn một trăm bệnh nhân, Hạnh và cs cũng nhận thấy, tỷ lệ các chủng Helicobacter pylori mang gien urease B khiếm khuyết là khoảng 20%. Tơng tự nh vậy, số các chủng Helicobacter pylori không tổng hợp protein cagA chiếm một tỷ lệ đáng kể [Hạnh. Kết quả cha công bố]. Với những lý do nh trên, để phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori bằng phơng pháp PCR, không thể khuyếch đại một gien riêng rẽ, vì các kết quả âm tính giả có thể xảy ra. Chúng tôi đã tối u hoá các điều kiện của phản ứng Hình 2- Phát hiện ba gen Urease B (1)., Hp1125 (2) và cagA (3) bằng phơng pháp Multiplex PCR Kb 2 1.5 0.5 1 2 3 M 1 2 3 Kb 1.5 1 0.5 Hình 1- Phát hiện các gien cagA (1), HP1125 (2) và UreaseB (3) bằng phơng pháp PCR đơn. 3 TCNCYH 22 (2) - 2003 PCR đơn hoặc Multiplex PCR cho ba gien ureaseB., cagA và Hp1125. Chúng tôi đề nghị sử dụng phơng pháp Multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori trong sinh thiết dạ dày, trong phân và vi khuẩn phân lập từ ngời bệnh Việt Nam. Phơng pháp có giá trị trong các trờng hợp, các sàng lọc vi khuẩn Helicobacter pylori bằng test Urease cho kết quả âm tính. V. Kết luận 1. Chúng tôi đã khuyếch đại nhiều gien trong một ống nghiệm bằng phơng pháp Multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori. 2. Multiplex PCR là phơng pháp phát hiện Helicobacter pylori cho kết quả nhanh và đầy đủ thông tin về sự có mặt của vi khuẩn trong các sinh thiết bệnh nhân. Phơng pháp có thể đợc áp dụng trong thực tế lâm sàng của Việt Nam. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị Thanh Lợi : Sự tồn tại của các chủng Helicobacter pylori khiếm khuyết gien urease B ở các bệnh nhân viêm loét và ung th dạ dày Việt Nam. Đại hội lần thứ hai hội nghị khoa học hoá sinh y dợc năm 2001-Các báo cáo khoa học.Tr. 106-113. 2. Trần Công Tớc, Trần Quỳnh Hoa, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Bùi Phơng Thuận và Lê Văn Phủng. Sự có mặt cuả vi khuẩn Helicobacter pylori mang cagA+status trong các sinh thiết dạ dày cuả ngời Việt Nam. Sinh học. 23 (2): 51-54 3. Atherton, J. C., Cao, P., Peek, R. M. J., Tummuru, M. K., Blaser, M. J., Cover, T. L : Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration. J. Biol. Chem. 1995, 270: 17771 - 17777. 4. Correa, P : Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. Amm J Surg Patho. 1995, 19 Suppl. 1: S37 - S43. 5. Cristina, N et al: Helicobacter pylori genotype may determine gastric histopathology. Amer. J . Pathology. 2001, 158 : 647 - 654. 6. Hazell, S. L. The role of Helicobacter pylori Urease: a contentious issue . Eur. J. Gastroenterol. Hepato. 4. 1992, (Suppl. 1) : 55 - 59. 7. Hopkins, R. J. and Morris, Jr. J. G.: Helicobacter pylori: the missing link in perspective. Am. J. Med. 1984, 97: 265 - 277. 8. Van de Ende, A., Pan, Z, J., Bart, R. W., van de Hurst., Feller, M., Xio, S.D., Tytgat, G and Dankert, J (1998). cagA- postive Helicobacter pylori population in China and the Netherland are distinct. Infect. 2001, Immun. 66 : 1822 - 1826. Summary Multiplex PCR and detection of three genes of Helicobacter pylori Bacterium Helicobacter pylori is the causative agent of many gastric disorders. That is why, its correct detection is necessary. However, monitoring the bacteria by amplifying only one gene has used to give false-negative results due to the biodiversity of the bacteria. The conditions for Multiplex PCR amplifying three virulent genes of the bacteria such as cagA., ureaseB and Hp1125 were optimized. It is recommended to detect Helicobacter pylori in clinical setting in Viet nam. 4 . nghiệm bằng phơng pháp Multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori. 2. Multiplex PCR là phơng pháp phát hiện Helicobacter pylori cho kết quả. sử dụng phơng pháp Multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori trong sinh thiết dạ dày, trong phân và vi khuẩn phân lập từ ngời bệnh Vi t