BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************* LÂM VỸ NGUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (Rhizophora apiculata BLUME.) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Cơng Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************* NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (Rhizophora apiculata BLUME.)Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS BÙI MINH TRÍ LÂM VỸ NGUYÊN TS VIÊN NGỌC NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY STUDYING GENETIC DIVERSITY OF THE MANGROVE TREE (Rhizophora apiculata Blume.) IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE BY RAPD-PCR Engineer Thesis Major: Biotechnology Research adviser BÙI MINH TRÍ, PhD VIÊN NGỌC NAM, PhD Researcher LÂM VỸ NGUYÊN Term: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn ba mẹ gia đình ni đến ngày khơn lớn cho ăn học thành tài Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy Cô trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học Ban chủ nhiệm Thầy Cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học động viên, giúp đỡ em thời gian thực khóa luận Thầy Bùi Minh Trí, Thầy Viên Ngọc Nam tận tình dẫn em suốt q trình thực khóa luận Chị Phan Đặng Thái Phƣơng hết lòng hƣớng dẫn em q trình thực khóa luận Các anh chị Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh động viên, giúp đỡ em trình thực khóa luận Ban quản lý Rừng phịng hộ Cần Giờ tạo điều kiện thuận lợi cho trình thu thập mẫu Anh Quy anh, chị phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phịng hộ Cần Giờ tận tình giúp đỡ em trình thu thập mẫu Xin cám ơn bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 28 chia sẻ niềm vui, nỗi buồn suốt năm đại học Xin chân thành cảm ơn! LÂM VỸ NGUYÊN iii TÓM TẮT LÂM VỸ NGUYÊN, Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 “NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (Rhizophora apiculatA BLUME.) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” Hội đồng hƣớng dẫn: TS BÙI MINH TRÍ TS VIÊN NGỌC NAM Cây đƣớc đơi (Rhizophora apiculata Blume.) có giá trị kinh tế môi trƣờng cao Tại Thành phố Hồ Chí Minh, rừng đƣớc Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc xem “lá phổi xanh thành phố” với chức điều hồ khơng khí, giảm nhiễm hấp thu CO2 hoạt động công nghiệp thải Tuy nhiên, sau gần 30 năm phát triển rừng đƣớc Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh xuất dấu hiệu lụi tàn (Viên Ngọc Nam cộng sự, 2005) Vì việc xây dựng chiến lƣợc phát triển lâu dài đem lại hiệu kinh tế môi trƣờng cao, vấn đề đánh giá tổng quát quỹ gene mức độ đa dạng quần thể đƣớc Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh đƣợc xem việc làm cấp thiết Song song với trình xác định đa dạng di truyền quần thể để từ có chiến lƣợc cụ thể cho việc bảo vệ nguồn gene đƣớc đơi, tìm thị phân tử (molecular marker) phát triển chúng thành công cụ hữu hiệu cho phép rút ngắn thời gian trình chọn, tạo giống phục vụ cho công tác trồng rừng Những kết đạt đƣợc: - Thu thập đƣợc 45 mẫu đƣớc với đặc điểm hình thái khác - Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu đƣớc - Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ đƣớc - Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho đƣớc Qua thử nghiệm primer 11 (OPN 06) primer (OPA 05) thấy primer 11 cho sản phẩm thể đa dạng di truyền cao iv - Kết chạy RAPD với primer cho band đồng hình kích thƣớc 600 bp Kết dùng để nghiên cứu đa dạng di truyền - Kết chạy RAPD với primer 11 cho trung bình 3,5 band/mẫu Số lƣợng band/mẫu khơng cao nhƣng lại thể rõ đa hình mẫu Chúng thu đƣợc band đa hình chiếm tỷ lệ 88,9% band đồng hình chiếm tỷ lệ 11,1% Kết phân tích phần mềm NTSYS (Numercial Taxonomy System) phiên 2.1, mẫu đƣớc đƣợc khảo sát đƣợc chia làm nhóm với khoảng cách phân nhóm 0,41 Nhóm gồm mẫu: 78RA01, 78RA02, 79RA01, 80RA01, 80RA02, 91RA01 Đây mẫu đƣớc đƣợc lấy từ trồng từ nguồn giống Cà Mau Các có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,66 – 0,89 Các trồng năm có hệ số đồng dạng di truyền 0,89 Nhóm có mẫu 96RA01 đƣợc trồng từ nguồn giống Cần - Phân tích kết RAPD với primer 11 cho thấy có phân ly lai chéo đƣớc đôi quần thể Điều làm phong phú thêm đa dạng di truyền quần thể đƣớc đôi rừng Cần Giờ v MỤC LỤC CHUƠNG TRANG Trang tựa ii Trang tựa tiếng Anh iii Lời cảm tạ iv Tóm tắt v Mục lục vii Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình x Danh sách bảng sơ đồ xi PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu 1.4 Giới hạn đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.1 Vai trò khu dự trữ sinh 2.1.2 Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.3 Cấu trúc Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.4 Công tác quản lý Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2 Cây đƣớc 11 2.2.1 Hình thái học 12 2.2.2 Nơi sống sinh thái 13 2.2.3 Phân bố 13 2.2.4 Giá trị kinh tế 13 2.2.5 Tình trạng 13 2.3 Quy trình ly trích DNA thực vật 14 2.3.1 Định lƣợng DNA ly trích phƣơng pháp quang phổ 15 2.3.2 Định tính DNA ly trích phƣơng pháp điện di 16 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) 17 2.4.1 Khái niệm 17 2.4.2 Thành phần vai trò chất phản ứng PCR 17 2.4.3 Nguyên tắc phản ứng PCR 18 2.4.4 Ứng dụng kỹ thuật PCR 19 2.4.5 Ƣu nhƣợc điểm kỹ thuật PCR 19 2.4.5.1 Ƣu điểm kỹ thuật PCR 19 2.4.5.2 Nhƣợc điểm kỹ thuật PCR 19 2.5 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền 19 2.5.1 Phân loại 19 2.5.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) 20 2.5.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP ) 21 2.5.4 Microsatellite 21 2.5.5 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) 22 2.5.5.1 Giới thiệu 22 2.5.5.2 Ứng dụng kỹ thuật RAPD 24 vi 2.5.6 Một số nghiên cứu DNA marker đƣớc 25 2.6 Khái niệm đa dạng sinh học 27 2.7 Khái niệm đa dạng di truyền 28 PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 30 3.1 Thời gian địa điểm thực 30 3.1.1 Thời gian thực 30 3.1.2 Địa điểm thực 30 3.2 Vật liệu thí nghiệm 30 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 31 3.3.1 Quy trình ly trích DNA 31 3.3.1.1 Vật liệu dùng ly trích DNA 31 3.3.1.2 Quy trình ly trích DNA 34 3.3.1.3 Kiểm tra kết ly trích DNA 35 3.3.2 Thực kỹ thuật RAPD 36 3.3.2.1 Dụng cụ hóa chất dung kỹ thuật RAPD 36 3.3.2.1 Bố trí thí nghiệm 37 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 4.1 Kết thu thập mẫu đƣớc Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 41 4.2 Bảo quản mẫu hồn thiện quy trình ly trích DNA 42 4.2.1 Bảo quản mẫu 42 4.2.2 Hồn thiện quy trình ly trích 43 4.3 Kết chạy RAPD 47 4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer 11 với chu kỳ nhiệt 47 4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer với chu kỳ nhiệt 48 4.3.3 Thí nghiệm 3: Sử dụng primer 11 với chu kỳ nhiệt 49 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 55 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxynucleotide triphosphate EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid EtBt: Ethidium bromide OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature UV: Ultra Violet TE: Tris EDTA TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA RAPD: Random Amplified Polymorphism of DNA UNESCO: United Nations Educational Scientific, and Cultural Organization viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Bản đồ Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Hình 2.2: Cấu trúc thân, rễ, lá, trái hoa đƣớc 11 Hình 2.3: Cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) 11 Hình 2.4:Sản phẩm RAPD 10 loài thuộc họ đƣớc (Rhizophoreae) rừng ngập mặn Ấn Độ với primer: (A) OPD 18; (B) OPD 20; (C) OPA 04; (D) OPA 01 .26 Hình 2.5: Cây di truyền 10 lồi thuộc họ đƣớc (Rhizophoreae) rừng ngập mặn Ấn Độ 27 Hình 4.1: Hoa đƣớc 41 Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu đồ Cần Giờ 41 Hình 4.3: Cây đƣớc đơi có trái màu xanh trái màu đỏ 42 Hình 4.4: Phần non dùng để ly trích DNA 44 Hình 4.5: Sự khác biệt DNA mẫu ly trích theo quy trình Doyle (quy trình 1) mẫu ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2) 45 Hình 4.6: Các mẫu DNA ly trích đƣợc theo hai quy trình ly trích 45 Hình 4.7: Sản phẩm PCR thí nghiệm 47 Hình 4.8: Sản phẩm PCR thí nghiệm 48 Hình 4.9: Sản phẩm PCR thí nghiệm 49 Hình 4.10: Cây phân lồi số đƣớc đơi Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 50 ix 46 Bƣớc Nghiền 0,2 g mẫu non nitơ lỏng Mẫu phải đƣợc nghiền mịn nhƣ bột Bƣớc Thêm 1,2 ml dịch trích EB, vortex kỹ, ủ 55oC qua đêm Bƣớc Bƣớc Thêm 0,2 V Sodium acetate 3M 0,6 V Isopropanol lạnh Đảo trộn kỹ Ủ -20oC 90 phút Bƣớc Bƣớc Thu đƣợc dung dịch đồng màu xanh Thu đƣợc dung dịch suốt, vàng Lập lại bƣớc 4, thu đƣợc V l dịch Thu đƣợc dịch huyền phù màu trắng Ly tâm 10000 vòng 10 phút 4oC Đổ bỏ dịch trong, thu tủa Ly tâm 12.000 vòng/15phút/4oC, hút dịch Bƣớc Thu đƣợc dung dịch màu vàng nhạt Thu đƣợc dung dịch màu xanh Thêm 500 l Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ Ly tâm 12000vòng/15ph/4oC, hút dịch Bƣớc Thu đƣợc kết tủa màu trắng, suốt Rửa tủa cách thêm lần lƣợc 400 l ethanol 70%, ethanol 100% ly tâm 10.000 vòng 1phút 4oC Đổ bỏ dịch Phơi Bƣớc nhiệt khơ tủa độ phịng hịa tan tủa 100 l TE 1X Bảo quản mẫu -20oC Sơ đồ 4.1 Quy trình cải tiến ly trích DNA từ đƣớc Quy trình ly trích sử dụng -mercaptoethanol có tác dụng phá hủy mạnh thành tế bào giúp cho việc giải phóng DNA hiệu hơn, muối sodium acetate làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA cho chloroform isoamyl acohol lần với việc ly tâm tốc độ cao giúp loại bỏ đƣợc tạp chất nhƣ protein, polysaccharide qua chất lƣợng DNA thu đƣợc tốt Nhìn trình ly trích ổn định hiệu quả, vấn đề tìm cách hạn chế đứt gãy DNA, điều phụ thuộc nhiều vào tác nhân học nhƣ nghiền mẫu, vortex mẫu Chúng tiến hành ly trích 45 mẫu, kết thu đƣợc DNA 30 mẫu Những mẫu ly trích khơng thành công mẫu trƣởng thành Điều trƣởng thành chứa nhiều chất thứ cấp nhƣ phenol, polysaccharide … làm ảnh hƣởng đến hoạt tính hóa chất ly trích làm lƣợng lớn DNA trình loại bỏ tạp chất Ngồi ra, việc bảo quản mẫu khơng tốt nguyên nhân làm cho lƣợng DNA mẫu bị 47 4.3 Kết chạy RAPD 4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer 11 với chu kỳ nhiệt Qua thí nghiệm 1, chúng tơi thu đƣợc kết đƣợc thể hình 4.7 Sản phẩm PCR Hình 4.7 Sản phẩm PCR thí nghiệm Kết điện di cho thấy chu kỳ nhiệt thành phần hóa chất phản ứng RAPD thí nghiệm không phù hợp cho đƣớc Chúng không thu đƣợc sản phẩm PCR hầu hết mẫu Chỉ có hai mẫu có đoạn DNA đƣợc khuếch đại nhƣng mờ Do phân biệt đƣợc band nên kết chƣa thể có ý nghĩa việc nghiên cứu đa dạng di truyền Điều số nguyên nhân nhƣ: - Chất lƣợng mẫu chƣa tốt, lẫn nhiều tạp chất làm ảnh hƣởng đến phản ứng PCR - Lƣợng DNA mẫu chƣa đủ - Lƣợng Taq polymerase sử dụng chƣa đủ hoạt tính - Lƣợng primer chƣa đủ - Chu kỳ nhiệt chƣa tốt, thời gian kéo dài chƣa đủ dẫn đến sản phẩm PCR khơng hồn thiện Với nhận định trên, chúng tơi có thay đổi thành phần hóa chất nhƣ chu kỳ nhiệt để tối ƣu hóa phản ứng PCR thí nghiệm sau 48 4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer với chu kỳ nhiệt bảng 3.4 96RA01 91RA01 80RA01 79RA01 78RA01 L Qua thí nghiệm 2, thu đƣợc kết đƣợc thể hình 4.8 1750bp 1750bp 1500bp 600bp 600bp 100bp Hình 4.8: Sản phẩm PCR thí nghiệm Kết điện di cho thấy sản phẩm PCR tốt nhƣng cho band đồng hình kích thƣớc 600 bp Mặc dù có vệt smear nhƣ có thêm band nhƣng qua phân tích cơng cụ “Detected band” phần mềm Quality One cho kết sản phẩm PCR với primer có band Do có band đồng hình nên kết thí nghiệm khơng có ý nghĩa việc nghiên cứu đa dạng di truyền đƣớc đôi Tuy nhiên band 600 bp band đặc trƣng cho đƣớc đơi (Rhizophora apiculata Blume) marker để phân biệt loài đƣớc với loài khác họ Rhizophorceae Do nên tách band để giải trình tự nhằm phục vụ cho cơng tác nghiên cứu đặc thù đƣớc rừng Cần Giờ 49 4.3.3 Thí nghiệm 3: Sử dụng primer 11 với chu kỳ nhiệt bảng 3.6 96RA01 91RA01 80RA01 79RA01 78RA01 78RA02 80RA02 L Qua thí nghiệm 3, chúng tơi thu đƣợc kết đƣợc thể hình 4.9 Hình 4.9: Sản phẩm PCR thí nghiệm Kết điện di cho thấy sản phẩm PCR tốt, cho độ đa hình cao Chúng tơi thực chạy RAPD với primer 11 mẫu kết thu đƣợc trung bình 3,5 band/mẫu Số lƣợng band/mẫu khơng cao nhƣng lại thể rõ đa hình mẫu Chúng tơi thu đƣợc band đa hình chiếm tỷ lệ 88,9% band đồng hình chiếm tỷ lệ 11,1% (kích thƣớc khoảng 500 bp), kích cỡ band khoảng từ 200 bp – 1700 bp (hình 4.9) Band đồng hình có mặt tất mẫu cịn band đa hình có mẫu nhƣng khơng có mẫu Các band đa hình sở phân biệt mẫu có tính trạng khác từ làm tảng để phân chia xác định giống Có band đa hình xuất vài mẫu nhƣ band có kích thƣớc khoảng 200 bp (mẫu 80RA01, 78RA01, 78RA02), 400 bp (mẫu 80RA01, 78RA01, 78RA02, 91RA01, 96RA01), 700 bp (mẫu 80RA01, 78RA02, 91RA01, 96RA01) Tuy lƣợng mẫu nghiên cứu không lớn nhƣng tất mẫu nghiên cứu, band đồng hình 500 bp ln xuất Band band đặc biệt dùng để phân biệt loài đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) với loài khác thuộc họ Rhizophorceae Do nên tách band để giải trình tự nhằm giải đáp cho chênh lệch phục vụ cho công tác phân biệt chọn giống 50 Từ kết thu đƣợc gel điện di mã hóa thành dạng nhị phân để phân tích mối tƣơng quan di truyền mẫu nghiên cứu phần mềm NTSYS phiên 2.1 (I) (II) Nguồn giống từ Cà Mau Nguồn giống chỗ Hình 4.10: Cây phân lồi số đƣớc đơi Khu Dự trữ sinh ngập mặn Cần Giờ Việc phân tích kết PCR phần mềm NTSYS cho kết nhƣ sau: - mẫu đƣớc đƣợc khảo sát đƣợc chia làm nhóm với khoảng cách phân nhóm 0,41 Nhóm I gồm mẫu: 78RA01, 78RA02, 79RA01, 80RA01, 80RA02, 91RA01 Đây mẫu đƣớc đƣợc lấy từ trồng từ nguồn giống Cà Mau Các có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,66 – 0,89 Các trồng năm có hệ số đồng dạng di truyền 0,89 Nhóm II có mẫu 96RA01 đƣợc trồng từ nguồn giống Cần Giờ - Những đƣớc đôi năm tuổi (78RA01 78RA02; 80RA01 80RA02) có hệ số đồng dạng di truyền cao vào khoảng 89% Điều hợp lý nguồn để tái tạo rừng ngập mặn Cần Giờ từ năm 1978 đến 1990 lấy từ rừng ngập mặn Cà Mau - Những đƣớc đôi trồng từ nguồn giống chỗ trồng từ nguồn giống từ Cà Mau có hệ số đồng dạng di truyền thấp Đây kết trình lai tạo thụ phấn chéo đƣớc đôi Càng sau hệ số đồng dạng di truyền đƣớc đôi giảm tạo đƣợc đa dạng sinh học cần thiết để tái tạo rừng 51 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu đƣợc, rút số kết luận nhƣ sau:  Quá trình bảo quản mẫu lâu dài -20oC, -80oC có ảnh hƣởng đến chất lƣợng DNA mẫu thu đƣợc ly trích  Sử dụng đƣớc non để ly trích thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt  Mẫu vừa nghiền xong nên ủ với dịch trích EB  Quy trình ly trích DNA đƣớc ổn định Ly trích đƣợc 35 mẫu (trên tổng số 45 mẫu) đạt DNA tiêu chuẩn dùng kỹ thuật sinh học phân tử  Quá trình bảo quản DNA mẫu quan trọng Một số mẫu DNA đƣớc ly trích bị dần lƣợng DNA bảo quản 4oC  Quy trình RAPD chƣa hồn thiện Có thể sử dụng mẫu DNA đƣớc ly trích lâu quy trình nhiệt chƣa ổn định Chúng tơi khơng thành cơng việc chạy RAPD mẫu đƣớc có trái màu đỏ mẫu đƣớc Rhizophora x lamarckii (đƣớc bông)  Primer 11 dùng kỹ thuật RAPD cho band mẫu thí nghiệm, có band đồng hình band đa hình Primer 11 có tính đa hình quần thể đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Độ đa hình dạng mẫu thấp ngoại trừ mẫu 96RA01  Primer dùng kỹ thuật RAPD cho band đồng hình Primer có độ đa hình thấp quần thể đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ  Với việc phân tích RAPD sử dụng primer 11 quần thể đƣớc Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ có hệ số đồng dạng di truyền phát sinh chủng loại dao động khoảng 0,41 – 0,89 52 5.2 Đề nghị  Tối ƣu hóa quy trình RAPD đƣớc đôi  Tiếp tục sử dụng primer 11 để đánh giá tính đa dạng di truyền với lƣợng mẫu lớn quần thể đƣớc  Khảo sát thêm primer khác nhằm có đƣợc kết đa dạng di truyền xác  Tách riêng band 600 bp chạy RAPD với primer band 500 bp chạy RAPD với primer 11 để giải trình tự nhằm phục vụ cho việc phân biệt loài đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) với loài khác thuộc họ Rhizophorceae rừng ngập mặn  Phải có sách làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng bảo đảm phát triển bền vững Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ nói chung quần thể đƣớc đơi (Rhizophora apiculata Blume) nói riêng  Nghiên cứu thêm đƣớc đơi có hình thái khác lạ Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Tại Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ cịn có lồi có tên địa phƣơng đƣớc râu với đặc điểm hình thái khác so với giống đƣớc (Rhizophora apiculata Blume.) Do vị trí phân bố đƣớc râu xa (thuộc tiểu khu 14) nên chúng tơi chƣa có điều kiện lấy mẫu nghiên cứu Hiện chƣa xác định đƣợc tên khoa học xác lồi Vì đề nghị nghiên cứu đƣớc râu để có khả phát đƣợc lồi Việt Nam 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: Bùi Trang Việt, 2002 Bài giảng Sinh học phân tử Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Nguyễn Đức Thành, 2004 Một số kỹ thuật thị phân tử Nhà xuất viện khoa hoc công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội Nguyễn Ngọc Bình, 2004 Cẩm nang ngành Lâm nghiệp Nhà xuất Giao thông vận tải Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005 Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nông Nghiệp Phạm Văn Bình, 2005 Đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Acanardium occidentale L.) trồng tỉnh Ninh Thuận kỹ thuật RAPD AFLP Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Phạm Thành Hổ, 1998 Di truyền học Nhà xuất giáo dục TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI: Akira Komiyamaa, 1998 Mortality and growth of cut pieces of viviparous mangrove (Rhizophora apiculata and R mucronata) seedlings in the field condition Forest Ecology and Management, 112 (1998) p 227 – 231 Bo Christensen, 1978 Biomass and primary production of Rhizophora apiculata Bl In a mangrove in Southern Thailand Aquatic Botany, (1978) p 43 – 52 F Blasco, 1996 Mangroves as indicators of coastal change Catena, 27 (1996) p 167 – 178 IIka C Feller and Marsha Sitnik, 1996 Mangrove ecology workshop manual Smithsonian Institution,Washington DC J Terrados, 1997 The Effect of Increased Sediment Accretion on the Survival and Growth of Rhizophora apiculata Seedlings Estuarine, Coastal and Shelf Science (1997) 45, p 697 – 701 54 Kazutoshi Okuno and Shuichi Fukuoka, 1998 Manual for DNA extraction in plants Japan international cooperation agency Madasamy Parani, 1997 Molecular Phylogeny of mangroves III Parentage analysis of a Rhizophora hybrid using Random Amplified Polymorphic DNA and Restriction Fragment Length Polymorphism markers Aquatic Botany 58 (1997) p 165-172 Mukkamala Lakshmi, 2002 Molecular phylogeny of mangroves IX Molecular marker assisted intra-specific variation and species relationships in the Indian mangrove tribe Rhizophoreae Aquatic Botany, 74 (2002) p 201 – 217 TRANG WEB: http://www.nea.gov.vn/nIndex.asp?ID=22275 http://www.weihenstephan.de/pbpz/bambara/html/rapd.html 55 PHỤ LỤC Bảng thống kê mẫu đước đôi thu thập Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ STT TÊN MẪU 80RA01 VỊ TRÍ LẤY MẪU Tiểu khu 11 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI Cây to, mọc tốt, chia làm thân 80RA02 Tiểu khu 11 Cây ốm yếu, bị mối ăn 80RA03 Tiểu khu 11 Cây mọc tốt 80RA04 Tiểu khu 11 Cây mọc tốt 80RA05 Tiểu khu 11 Lá có màu xanh đậm 80RA06 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu ớt 80RA07 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở 80RA08 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở 80RA09 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở 10 80RA10 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở 11 80RA11 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, bị dây leo quấn 12 80RA12 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, bị dây leo quấn 13 80RA13 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, thân bị u 14 80RA14 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, thân bị u 15 80RA15 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, bị mối ăn 16 79RA01 Tiểu khu 11 Cây mọc tốt 17 79RA02 Tiểu khu 11 Cây mọc tốt 18 79RA03 Tiểu khu 11 Cây mọc tốt 19 79RA04 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở 20 79RA05 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở 21 78RA01 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở 22 78RA02 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở 56 23 78RA03 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở 24 78RA04 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở 25 78RA05 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở 26 92RA01 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt 27 92RA02 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt, có thân 28 91RA01 Tiểu khu 6b Cây nhỏ, phát triển 29 91RA02 Tiểu khu 6b Cây nhỏ, phát triển 30 91RA03 Tiểu khu 6b Cây nhỏ, phát triển 31 91RA04 Tiểu khu 6b Cây nhỏ, phát triển 32 96RA01 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt 33 96RA02 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt 34 96RA03 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt 35 96RA04 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt 36 96RA05 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt 37 96RA06 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt 38 74RA01 Tiểu khu 4b Cây cao, mọc yếu ớt 39 74RA02 Tiểu khu 4b Cây cao, mọc yếu ớt 40 74RA03 Tiểu khu 4b Cây cao, mọc yếu ớt 41 74RA04 Tiểu khu 4b Cây cao, mọc yếu ớt 42 74RA05 Tiểu khu 4b Cây cao, mọc yếu ớt 43 80TĐ01 Tiểu khu 11 Cây có trái đỏ xanh 44 80TĐ02 Tiểu khu 11 Cây có trái đỏ xanh 45 RL01 Tiểu khu 15 Cây đƣớc lai, có Ghi chú:  80RA01: Cây đƣớc đôi trồng năm 1980, thứ tự lấy mẫu 01  80TĐ01: Cây đƣớc đơi trồng năm 1980, có trái đỏ trái xanh, thứ tự lấy mẫu 01  RL: Cây đƣớc lai Rhizophora x lamarckii (đƣớc bông) 57 Danh mục loài thuộc họ đước Rhizophoraceae TÊN KHOA HỌC TÊN VIỆT NAM Bruguiera cylindrical (L.) Blume Vẹt trụ Bruguiera gymnorrhize (L.) Lamk Vẹt dù Bruguiera parviflora (Roxb.) W & Arn Ex Griff Vẹt tách, Vẹt khang Bruguiera sexangula (Lour.) Poir In Lamk Vẹt đen Ceriops decandra (Griff.) Ding Hou Dà quánh Ceriops tagal (Pers) C.B Rob Dà vôi Kandelia candel (L.) Druce Trang Rhizophora apiculata Bl Đƣớc đôi Rhizophora mucronata Poir in Lamk Đƣng, Đƣớc xanh Rhizophora stylosa Griff Đƣớc vòi (Nguồn : Viên Ngọc Nam (1993)) 58 Danh mục lồi sinh vật q Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Tên khoa học Reptilia Gekko gecko Varanus salvator Python molurus Pythonreticulatus Bugaris fasciculatus Naja naja SĐVN xếp T Ophiophagus hannah Chelonia mydas Eretmochelis imbricata Lepidochelus olivacea Crocodylus porosus Aves Pelecanus philppensis Mycteria leucocephala Mycteria cinerea Leptoptilos Javanicus Tringa guttifer Pica pica Mammalia Lutra lutra Aouyx cinerea Felis viverrina Felis bengulensis Tên địa phƣơng Lớp bò sát Tắc kè Kỳ đà nƣớc Trăn đất Trăn gấm Rắn cạp nong Rắn hổ mang Rắn hổ chúa Vích Đồi mồi Quân đồng Cá sấu hoa cà Lớp chim Bộ nông chân xám Giang sen Cò lạo xám Già đảy nhỏ Choắt lớn mỏ vàng Ác Lớp thú Rái cá thƣờng Rái cá vuốt bé Mèo cá Mèo rừng Nguồn: Bùi Lai cộng 1996, (MAB Vietnam, 1998 Proposed Biosphere Reserve of Can Gio Mangroves HCM City) 59 Thống kê trạng rừng – đất 24 tiểu khu thuộc Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ Tiểu khu Rừng trồng Rừng tự nhiên (ha) (ha) 890,41 1.236,41 355,04 719,09 449,85 1.200,39 369,20 772,17 Đất khác Tổng diện tích (ha) 309,14 Đất trống 29,65 1.229,20 232,16 1.857,64 81,22 1.250,16 34,14 137,50 1.741,23 252,15 21,21 99,42 1.144,95 980,40 397,79 29,45 125,25 1.532,89 624,71 230,83 265,68 1.121,22 960,49 133,17 157,84 268,72 1.520,22 923,34 440,43 86,06 129,97 1.579,80 10 1.236,58 298,89 5,63 62,53 1.603,63 11 667,28 314,47 5,55 249,52 1.236,82 12 775,53 141,59 261,52 1.178,64 13 898,42 243,55 373,61 1.515,58 14 740,17 299,43 486,33 1.525,93 15 1.024,04 539,97 212,09 414,16 2.190,26 16 782,36 325,82 13,80 492,33 1.614,31 17 1.252,85 569,35 172,77 1.994,97 18 746,54 468,82 466,85 1.682,21 19 518,49 354,16 421,15 1.293,80 20 762,90 618,33 80,04 448,73 1.910,00 21 722,62 322,85 5,90 778,16 1.829,53 22 300,83 246,09 2,80 229,93 779,65 23 1.434,00 416,86 1.093,18 2.944,04 24 1.257,42 860,28 57,56 212,04 3.387,30 21.427,44 8.958,06 746,10 7.532,38 38.663,98 Tổng 34,03 (Nguồn: Ban quản lý Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ) ... thiệu Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.1 Vai trò khu dự trữ sinh 2.1.2 Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.3 Cấu trúc Khu Dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ ... CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************* NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (Rhizophora apiculata BLUME.)? ?? KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Luận văn kỹ sƣ Chuyên... Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 “NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (Rhizophora apiculatA BLUME.) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD? ?? Hội đồng hƣớng dẫn: