BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BÙI THỊ THANH TỊNH HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN BÙI THỊ THANH TỊNH NIÊN KHÓA: 2002-2006 Thành phố Hồ Chí Minh 2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY,HCHC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY  COMPLETING PROTOCOL OF TRANSFORMATION DNA FRAGMENTS INTO E.coli DH5α BACTERIAL CELLS GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. LE ĐINH ĐON BUI THI THANH TINH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM ƠN Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ, anh chị và ngƣời thân luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con. Em vô cùng biết ơn thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập vừa qua. Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Hóa Sinh - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cũng nhƣ tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài Các anh, chị và các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105, 118 - khu Phƣợng Vỹ Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi. Và cuối cùng là các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã luôn đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Bùi Thị Thanh Tịnh ii TÓM TẮT BÙI THỊ THANH TỊNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, “Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α”, đƣợc thƣc hiện tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Giáo viên hƣớng dẫn: thầy Lê Đình Đôn. Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006 với các nội dung: Hoàn thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp theo phƣơng pháp sử dụng hoá chất. Hoàn thiện quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α Hoàn thiện quy trình chiết tách plasmid, phản ứng cắt plasmid để kiểm tra. Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ phản ứng PCR và plasmid sau khi cắt. Thiết lập phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Thiết lập đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hoá chất, tế bào khả nạp có thể giữ ở -70 o C với glycerol trong thời gian 2 tháng. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli DH5α. Chiết tách plasmid không lẫn tạp theo quy trình của Sambrook và cộng sự có sửa đổi. iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các hình vii Danh sách các bảng ix PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 2 1.3 Nội dung thực hiện 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Hiện tƣơng biến nạp ở vi khuẩn 3 2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp 3 2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp 3 2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp 5 2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp 5 2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp 5 2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp 6 2.2.1 Khái niệm chung các vector 6 2.2.2 Plasmid 7 2.2.2.1 Cấu trúc 7 2.2.2.2 Tính chất của plasmid 8 2.2.2.3 Phân loại plasmid 8 2.2.3 Phage 9 2.2.4 Chủng chủ E.coli 9 2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp 10 2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) 11 iv 2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn 11 2.3.1.2 Tên gọi các RE 11 2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn 12 2.3.1.4 Các RE loại II 12 2.3.2 Các enzym thông dụng khác 15 2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) 15 2.3.2.2 Taq polymerase 15 2.3.2.3 Terminal transferase 15 2.3.2.4 Các DNase 15 2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa 16 2.3.3 Các enzym nối DNA 16 2.3.3.1 E.coli DNA ligase 16 2.3.3.2 T4 DNA ligase 16 2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp 17 2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp 17 2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp 17 2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp 18 2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp 18 2.4.3 Chiết tách DNA plasmid 19 2. 5 Điện di (Electrophoresis) 19 2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc 20 2.6.1 Ngoài nƣớc 20 2.6.2 Trong nƣớc 21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu 22 3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α 22 3.2.2 pBluescript II SK(+/-) 22 3.2.3 Đoạn DNA 23 3.3 Dụng cụ và hóa chất 23 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm 23 v 3.3.2 Các thiết bị máy móc 23 3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 23 3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm 24 3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm 24 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 25 3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coli DH5α và kiểm tra 26 3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trƣờng LB 27 3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp 27 3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) 27 3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra 29 3.4.6.1 Chiết tách plasmid 29 3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) 32 3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose 32 3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR 33 3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA 33 3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel 33 3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX 34 3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR 35 3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) 36 3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) 37 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 38 4.2 Tách chiết DNA plasmid 40 4.2.1 Tách chiết DNA plasmid 40 vi 4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng Aurum TM Plasmid Mini Kit 42 4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV 42 4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII 44 4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA 44 4.4.2 Tinh sạch plasmid 45 4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp 46 4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp 46 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 49 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair CFU Colony Form Unit DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside MCS Multiple cloning Site OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RE Restriction Enzyme RNA Ribonucleic acid RFLP Restriction fragment length polymorphism SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Kb kilobase dATP deoxyadenosine triphosphate dGTP deoxyguanosine triphosphate dCTP deoxycytidine triphosphate dTTP deoxythymidine triphosphate Tris- HCL (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride UV Ultraviolet (light) X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- glactopyranoside [...]... các trình tự DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành 2 thực hiện đề tài “ Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α phát triển từ đề tài: “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào. .. DNA chèn - Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào - Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillin, X-gal, IPTG 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn 2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp Biến nạp là phƣơng pháp đơn giản nhất hiện có để đƣa DNA tái tổ hợp vào trong tế bào Trong trƣờng hợp các tế bào E coli thì biến nạp có nghĩa là đƣa DNA plasmid vào trong tế bào. .. bào vi khuẩn E coli DH5α do Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM thực hiện 1.2 Mục tiêu của đề tài Hoàn thiện quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescript và chuyển plasmid tái tổ hợp này vào tế bào kí chủ E coli DH5α 1.3 Nội dung thực hiện - Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E coli DH5α - Thiết lập qui trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất - Thiết lập phƣơng pháp biến. .. tế bào khả nạp ở -20oC là 7 ngày, ở -70oC là 15 ngày 2.6.2 Trong nƣớc Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng Đại Học Nông Lâm TPHCM, đã thực hiện thành công đề tài : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp, quy trình tách chiết plasmid, tiến hành phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ sản phẩm PCR, thiết lập phản ứng nối cho đoạn. .. môi trƣờng các đoạn DNA, (2) Khả năng dung nạp DNA của vi khuẩn nhận Không phải tất cả các vi khuẩn đều nhận DNA vào nhƣ nhau, mà cần phải sử dụng một số chất để tạo lỗ trên vách tế bào, giúp sự xâm nhập dễ dàng của DNA nhƣ: CaCl2 50mmol, LiCl Quá trình biến nạp gồm 5 giai đoạn: - Sự tiếp xúc của DNA lạ với tế bào nhận - Sự xâm nhập của DNA vào tế bào nhận - Sự liên kết của DNA lạ với đoạn tƣơng đồng... nhiễm sắc thể tế bào nhận - Sự đồng hóa phân tử DNA lạ vào DNA của tế bào nhận nhờ tái tổ hợp - Sự nhân lên của nhiễm sắc thể có DNA biến nạp 2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích nghi với môi trƣờng sống Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật 2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp Biến nạp DNA vào vi khuẩn là bƣớc... tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ Trƣớc hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh Các quy trình tách chiết đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là tủa DNA Tuỳ theo từng phƣơng... 55 Hình 2 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) 56 viii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-) 23 Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E Coli 25 Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E coli DH5α và kiểm tra 26 ix 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay với sự phát triển nhƣ vũ bão của khoa... nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc 2.6.1 Ngoài nƣớc Cohen và cộng sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E coli bằng phƣơng pháp Calcium chloride Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E coli khả nạp, biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đƣa ra công thức tính hệ số biến nạp N = A x10n... 2.1 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp 6 Hình 2.2 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning 8 Hình 2.3 Hình thái của Escherichia coli 10 Hình 2.4 Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn 13 Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA 35 Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5 38 Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5 . Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 25 3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra 26 3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E. coli. pBluescript II SK (+/-) 23 Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. Coli 25 Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli