TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THÚY NGÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ PHÂN ĐOẠN CẶN DỊCH CHIẾT n-HEXANE CÂY GAI (Boehmeria nivea (L) Gaud.) HỌ GAI (Urticaceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sư phạm Hóa học Phú Thọ, 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THÚY NGÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ PHÂN ĐOẠN CẶN DỊCH CHIẾT n-HEXANE CÂY GAI (Boehmeria nivea (L) Gaud.) HỌ GAI (Urticaceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Sư phạm Hóa học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS Triệu Quý Hùng Trường Đại học Hùng Vương Phú Thọ, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học TS Triệu Quý Hùng Các số liệu, kết nêu Khóa luận trung thực chưa có cơng bố cơng trình nghiên cứu trước Tồn thơng tin trích dẫn Khóa luận rõ nguồn gốc xuất xứ Sinh viên Nguyễn Thúy Ngân LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc Thầy hướng dẫn khoa học: TS Triệu Qúy Hùng-Trường Đại học Hùng Vương hướng nghiên cứu tận tình hướng dẫn em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô, nhà khoa học Trường Đại học Hùng Vương giảng dạy hướng dẫn em thực thực nghiệm hóa học Nhân dịp em xin bày tỏ cảm ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trường Đại học Hùng Vương, Khoa Khoa học Tự nhiên-Trường Đại học Hùng Vương tạo cho em môi trường học tập khoa học, nghiêm túc Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn sinh viên K12 ĐHSP Hóa học- Trường Đại học Hùng Vương hỗ trợ, động viên em suốt trình học tập thực Đề tài Phú Thọ, ngày 02 tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thúy Ngân -i- MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG v MỞ ĐẦU 1 Lý lựa chọn đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi Boehmeria 1.2 Đặc điểm thực vật Gai 10 1.3 Các nghiên cứu hóa thực vật chi Boehmeria 11 2.2.1 Hóa chất 16 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp ngâm chiết 17 2.3.2 Phương pháp sắc ký 17 2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 18 2.3.2.2 Phương pháp sắc ký cột 19 2.3.3 Phương pháp kết tinh 21 2.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 21 2.3.4.1 Phổ cộng hưởng từ nhân proton (1H-NMR) 22 2.3.4.2 Phổ cộng hưởng từ nhân carbon-13 (13C-NMR) 24 3.1 Phân lập cặn dịch chiết n-hexane lá-thân Gai 26 3.1.1 Điều chế cặn chiết n-hexane 26 3.1.2 Quá trình phân lập dịch chiết n-hexane 28 -ii- 3.1.2.1 Khảo sát thành phần định tính lựa chọn dung mơi 28 3.1.2.2 Quá trình phân lập chất 30 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất BNC6 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 Kết luận 38 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 -iii- DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT  Các phương pháp sắc ký TLC Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography: Sắc ký cột  Các phương pháp phổ H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 t: triplet (vạch ba) quint: quintet (vạch năm)  Các chữ viết tắt khác TMS Tetramethyl silan  Tên hợp chất viết theo nguyên Tiếng Anh -iv- DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Boehmeria diffusa Wedd Hình 1.2 Boehmeria macrophylla Hornem Hình 1.3 B nivea (L.) Gaud Hình 1.4 B penduliflora Wedd Hình 1.5 B tonkinensis Gagnep Hình 1.6 Cây Gai 10 Hình 2.1 Minh họa sắc ký lớp mỏng 18 Hình 2.2 Minh họa sắc ký cột 20 Hình 2.3 Minh họa phổ 1H-NMR 23 Hình 2.4 Minh họa phổ 13C-NMR 25 Hình 3.1 Thân Gai thái nhỏ, phơi bóng mát 26 Hình 3.2 Quá trình ngâm chiết Gai điều chế cặn chiết n-hexane 27 Hình 3.3 Kết khảo sát TLC cặn chiết n-Hexan Gai 29 Hình 3.4 Cột tổng silica gel cặn n-hexane 31 Hình 3.5 Kết khảo sát TLC bình hứng dung dịch rửa giải 32 Hình 3.6 Hình ảnh TLC phân đoạn F1÷F11 34 Hình 3.7 Hình ảnh TLC chất BNC6 34 Hình 3.8 Sơ đồ phân lập cặn n-hexane lá-thân Gai 35 Hình 3.9 Cấu trúc hợp chất BNC6 36 Hình 3.10 Phổ 1H-NMR BNC6 36 -v- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Giá trị Rf màu sắc vệt chất mỏng 30 Bảng 3.2 Kết phân đoạn thu từ cột tổng n-hexane 33 -1- MỞ ĐẦU Lý lựa chọn đề tài Từ xưa đến nay, thuốc dân gian đóng vai trị quan trọng việc chăm sóc sức khoẻ cho người Ngày hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học phân lập từ cỏ ứng dụng nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp chăm sóc sức khoẻ người Chúng dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm…Mặc dù cơng nghệ tổng hợp hố dược ngày phát triển mạnh mẽ, tạo biệt dược khác sử dụng cơng tác phịng, chữa bệnh, nhờ giảm tỷ lệ tử vong nhiều, song đóng góp thảo dược khơng mà chỗ đứng Y học Nước ta có khí hậu thảm thực vật phong phú đa dạng Dân tộc Việt Nam có truyền thống sử dụng loài thảo mộc làm thuốc chữa bệnh Những năm gần xu hướng tìm kiếm số hoạt chất loài thảo mộc có tác dụng chữa bệnh ngày tăng, thu hút nhà khoa học nghiên cứu Theo số liệu thống kê thảm thực vật Việt Nam có 12000 lồi, số có 3200 lồi thực vật sử dụng làm thuốc Y học dân gian [3] Tên chi Boehmeria đặt theo tên nhà thực vật học người Đức, Georg Rudolf Boehmer Theo tác giả Võ Văn Chi, chi Boehmeria có khoảng 50 loài nhiệt đới Bắc cận nhiệt đới Ở nước ta có lồi mà lồi biết công dụng sử dụng y học cổ truyền mở tiềm nghiên cứu hóa thực vật lồi này[3] Cây Gai thuộc chi Boehmeria có vị ngọt, hàn, khơng độc có tác dụng tả nhiệt, tán ứ, chữa đơn độc, thông tiểu tiện dân gian sử dụng làm thuốc an thai nhiều loại thuốc khác trị hiệu số bệnh -27- (I) (II) (III) (IV) Hình 3.2 Quá trình ngâm chiết Gai điều chế cặn chiết n-hexane -28- 3.1.2 Quá trình phân lập dịch chiết n-hexane 3.1.2.1 Khảo sát thành phần định tính lựa chọn dung mơi + Triển khai sắc ký lớp mỏng: Lấy lượng nhỏ cặn chiết n-hexane Gai hòa tan CH2Cl2 Pha hệ dung mơi (2 mL) đổ vào bình triển khai sắc ký Sử dụng mỏng với kích thước 15 mm x 40 mm Đưa chất lên lớp mỏng ống mao quản, cách đáy mỏng mm cách hai bên mép bản, để dung mơi bay hết đưa vào bình triển khai Khi dung môi chạy lên cách mép khoảng mm lấy mỏng ra, sấy để dung môi bay hết + Lập sắc ký đồ: Tiến hành lập sắc ký đồ điều kiện sau: Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng = 254 nm 366 nm Nhúng thuốc thử Ce(SO4)2, sấy mỏng, quan sát ánh sáng thường Mỗi vết tách mỏng có giá trị Rf khác Dựa sắc ký đồ, phân tích sơ thành phần chiết để biết: Số lượng chất có cặn chiết, đánh giá sơ khả phân tách chất dung môi silica gel + Kết sắc ký đồ: Hệ dung môi triển khai gồm: (I): CH2Cl2/n-Hexane 10% (II): CH2Cl2/n-Hexane 30% (III): CH2Cl2/n-Hexane 50% (IV): CH2Cl2/n-Hexane 75% (V): EtOAc/n-Hexane 5% (VI): Acetone/n-Hexane 5% Các mỏng sau triển khai sắc ký, màu đèn tử ngoại sau phun thuốc thử Ce(SO4)2 thu kết tương ứng sau: -29- (I) (II) (III) (IV) (V) (VI) Hình 3.3 Kết khảo sát TLC cặn chiết n-Hexan Gai Kết so sánh cho thấy chất khai triển tốt hệ dung môi CH2Cl2/n-hexane -30- Các giá trị Rr vệt chất với hệ dung mơi CH2Cl2/n-Hexane (50%) trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1 Giá trị Rf màu sắc vệt chất mỏng STT Rf Ce(SO4)2 0,05 Xanh đen 0,21 Xanh đen 0,39 Xanh đen 0,63 Xanh đen 0,74 Xanh đen 0,89 Xanh đen 0,95 Xanh đen Do đó, lựa chọn hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane với độ phân cực tăng dần làm dung môi rửa giải cho cột tổng cặn CH2Cl2 Gai 3.1.2.2 Quá trình phân lập chất Giai đoạn 1: Chuẩn bị cột Cột có đường kính cm, chiều dài 50 cm rửa sạch, tráng cột acetone, sấy khơ, lót đáy bơng Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt: Cân 250 gam silica gel, ngâm trương nở ngập n-hexane khoảng 1h dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí Rót từ từ hỗn hợp silica gel trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định thời gian Giai đoạn 2: Đưa chất lên cột 28 gam cặn chiết n-hexane lá-thân Gai (kí hiệu BNLH) hịa với CH2Cl2 vừa đủ cho tan hết, đem trộn với 20 gam silica gel, làm bay hết dung môi máy quay cất chân không đến thu hỗn hợp bột tơi Cho từ từ silica gel đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố vào cột -31- Hình 3.4 Cột tổng silica gel cặn n-hexane Giai đoạn 3: Chạy cột tổng Tiến hành rửa giải hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane gradient (20100%) Hứng dung dịch rửa giải khoảng 60 mL vào bình nón -32- Kiểm tra sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp bình có vết chất tương đương mỏng Dội cột dung môi MeOH Kết thu 11 phân đoạn có kí hiệu từ F1÷F11 Hình 3.5 Kết khảo sát TLC bình hứng dung dịch rửa giải -33- Bảng 3.2 Kết phân đoạn thu từ cột tổng n-hexane STT Bình gộp Phân đoạn Khối lượng (gam) 1÷4 F1 0,85 5÷8 F2 1,5 9÷18 F3 3,4 19÷46 F4 2,2 47÷54 F5 1,2 55÷70 F6 1,3 71÷81 F7 0,34 82÷114 F8 4,1 115÷165 F9 1,1 10 166÷195 F10 1,5 F11 6,2 196÷199, 11 dội cột Các phân đoạn F1÷F11 khảo sát lại TLC -34- Hình 3.6 Hình ảnh TLC phân đoạn F1÷F11 Giai đoạn 4: Phân lập chất từ phân đoạn nhỏ Tiến hành kết tinh phân đoạn F9 hệ dung môi CH2Cl2/n-hexane 3/1 thu 135 mg hợp chất BNC6 dạng chất bột rắn màu trắng Hợp chất BNC6 không màu đèn UV hai bước sóng 254 nm 366 nm Rf = 0,50 (EtOAc/n-hexane 80/20) Hình 3.7 Hình ảnh TLC chất BNC6 -35- Sơ đồ phân lập dịch chiết n-hexane lá-thân Gai trình bày Hình 3.8 Hình 3.8 Sơ đồ phân lập cặn n-hexane lá-thân Gai -36- 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất BNC6 Hình 3.9 Cấu trúc hợp chất BNC6 Hình 3.10 Phổ 1H-NMR BNC6 -37- Hợp chất BNC6 đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Từ kết liệu phổ cho phép xác định cấu trúc BNC6 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 2,35 (2H, t, J=7,5 Hz, CH2-2); 1,64 (2H, quint, J=7,3 Hz, CH2-3); 1,26 (24H, m, 12 x CH2); 0,89 (3H, t, J=7,0 Hz, CH3-16) Hợp chất BNC6 tách dạng chất rắn vơ định hình màu trắng Phổ 1H-NMR BNC6 đặc trưng cho cấu trúc acid mạch dài qua tín hiệu nhóm methylen liên kết với carbonyl H 2,35 (2H, t, J=7,5 Hz) với nhóm methylen liền kề H 1,64 (2H, quint, J=7,3 Hz, CH2-3), tín hiệu 12 nhóm CH2 H 1,26 (24H, m) tín hiệu nhóm CH3 H 0,89 (3H, t, J=7,0 Hz) Kết hợp liệu phổ cho phép xác định hợp chất acid palmitic [8] -38- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết đề tài khóa luận phù hợp với mục tiêu đề tài đặt Lần phận lá-thân Gai địa bàn tỉnh Phú Thọ nghiên cứu thành phần hóa học: - Đã phân lập hợp chất BNC6 acid béo palmitic acid từ phân đoạn nhỏ cặn n-hexane lá-thân Gai phương pháp sắc ký kết tinh - Cấu trúc hợp chất BNC6 xác định phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR Kiến nghị - Tiếp tục tinh chế phân đoạn lại dịch chiết n-Hexane láthân Gai nghiên cứu phận khác Gai nhằm tìm kiếm hợp chất thiên nhiên có lồi - Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất phân lập -39- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng-Tập 2, NXB Khoa học kĩ thuật, Hà Nội [2] Trần Thị Thu Hà (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học số phân đoạn dịch chiết CH2Cl2 CÂY GAI (Boehmeria nivea (L) Gaud.) HỌ GAI (Urticaceae), Khóa luận tốt nghiệp ngành sư phạm hóa học, Trường Đại học Hùng Vương, Phú Thọ [3] Đỗ Tất Lợi (2011), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Thời đại [4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [5] Đặng Như Tại, Ngơ Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ-Tập 1, NXB Giáo dục Việt Nam [6] Đặng Như Tại, Ngơ Thị Thuận (2012), Hóa học hữu cơ-Tập 2, NxXBGiáo dục Việt Nam [7] Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng hóa học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh [8] E.S.H.E Ashry, A Rahman, M.I Choudhary, S.H Kandil, A.E Nemr, T Gulzar, and A.H Shobier (2011), “Studies on the constituents of the green alga Ulva lactuca” Chemistry of Natural Compounds, 47(3), 235238 [9] Cai XF, Jin X, Lee D, Yang YT, Lee K, Hong YS, Lee JH, Lee JJ (2006), “Phenanthroquinolizidine alkaloids from the roots of Boehmeria pannosa potently inhibit hypoxia-inducible factor-1 in AGS human gastric cancer cells”, J Nat Prod, 69, pp 1095-1097 -40- [10] Chen GQ, Liu YL, Xie Q, Li XR, Xu QM, Yang SL (2009), “Chemical constituents in roots of Boehmeria nivea”, Chin Tradit Herb Drugs, 40, pp 683-686 [11] Sunghun Cho, Dong Gu Lee, Yong-Su Jung, Ho Bang Kim, Eun Ju Cho, and Sanghyun Lee (2016), “Phytochemical Identification from Boehmeria nivea Leaves and Analysis of (–)-Loliolide by HPLC”, Natural Product Sciences, 22(2), pp 134-139 [12] Luo YG, Li BG, Zhang GL (2001), “A new quinolizidine alkaloid from Boehmeria siamensis”, Chin Chem Lett, 12, pp 337-338 [13] Luo YG, Liu Y, Luo DX, Gao XP, Li BG, Zhang GL (2003), “Cytotoxic alkaloids from Boehmeria siamensis”, Planta Med, 69, pp 842-845 [14] Luo YG, Liu Y, Qi HY, Zhang GL (2004), “A new glucoceramide from the watermelon begonia, Pellionia repens”, Lipids, 39, pp 1037-1042 [15] Semwal DK, Rawat U, Semwal R, Singh R, Krishan P, Singh M, Singh GJP (2009), “Chemical constituents from the leaves of Boehmeria rugulosa with antidiabetic and antimicrobial activities”, J Asian Nat Prod Res, 11, pp 1045-1055 [16] WANG Jian, YANG Hong-xing, TENG Yong-zhen, YUAN Pei, TIAN Rui, LIAO Chun-bi (2011), “An Overview on the Progress of Chemical Constituents and Bioactivities of Plants in Urticaceae during 2000－ 2010”, Chinese Herbal Medicines, 3(1), pp 9-16 -41- GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS Triệu Quý Hùng Nguyễn Thúy Ngân ...TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHI? ?N NGUY? ?N THÚY NG? ?N NGHI? ?N CỨU THÀNH PH? ?N HÓA HỌC MỘT SỐ PH? ?N ĐO? ?N C? ?N DỊCH CHIẾT n- HEXANE CÂY GAI (Boehmeria nivea (L) Gaud. ) HỌ GAI (Urticaceae) KHÓA... chất thi? ?n nhi? ?n từ Gai (Boehmeria nivea (L) Gaud) lựa ch? ?n đề tài ? ?Nghi? ?n cứu thành ph? ?n hóa học số ph? ?n đo? ?n c? ?n dịch chiết n- hexane Gai (Boehmeria nivea (L) Gaud. ) họ Gai (Urticaceae)? ?? Mục tiêu... (201 7), Nghi? ?n cứu thành ph? ?n hóa học số ph? ?n đo? ?n dịch chiết CH2Cl2 CÂY GAI (Boehmeria nivea (L) Gaud. ) HỌ GAI (Urticaceae), Khóa lu? ?n tốt nghiệp ngành sư phạm hóa học, Trường Đại học Hùng Vương,