Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC HÀNH ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN SINH HÓA HỌC KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngày 01 tháng 04 năm 2022 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD I THÔNG TIN SINH VIÊN Ca 2 Nhóm 18 Họ tên sinh viên Nguyễn Thị Huỳnh Như MSSV 20180341 Họ tên sinh viên Nguyễn Việt Kiều Oanh MSSV 20180346 Họ tên sinh viên Trần Xuân Phú MSSV 20180350 II CÂU HỎI LÝ THUYẾT Hãy nêu ưu và nhược điểm của phương pháp Bradford trong định lượng protein ? Ưu điểm Độ nhạy cao, c.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC HÀNH ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN SINH HÓA HỌC KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngày 01 tháng 04 năm 2022 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD I THƠNG TIN SINH VIÊN: Ca: Nhóm: 18 Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Huỳnh Như MSSV: 20180341 Họ tên sinh viên: Nguyễn Việt Kiều Oanh MSSV: 20180346 Họ tên sinh viên: Trần Xuân Phú MSSV: 20180350 II CÂU HỎI LÝ THUYẾT: Hãy nêu ưu nhược điểm phương pháp Bradford định lượng protein ? Ưu điểm: - Độ nhạy cao, xác định từ µg đến 20 μg protein - Hợp chất đơn giản - Ít tốn thời gian Tổng thời gian cần thiết để thiết lập hoàn thành xét nghiệm 30 phút - Ít bị cản trở hợp chất sử dụng nghiên cứu protein, ammonium sulfate - Thuốc nhuộm Coomassie Blue G250 tạo mối liên kết không lưu trú mạnh mẽ với protein, thông qua tương tác tĩnh điện với nhóm amino carboxyl, tương tác Van der Waals Từ đó, loại bỏ khả phân tử không liên kết thuốc nhuộm đóng góp vào q trình thực nghiệm - Ít tốn kém, dễ sử dụng có độ nhạy cao thuốc nhuộm cho protein - Toàn thí nghiệm thực nhiệt độ phịng - Biểu đồ tuyến tính có từ xét nghiệm (độ hấp thụ so với nồng độ protein μg/ml) dễ dàng xác định nồng độ protein cách sử dụng độ dốc dòng Nhược điểm: - Phương pháp Bradford tuyến tính phạm vi ngắn, thường từ µg/mL đến 2000 µg/mL nên thường phải pha lỗng trước phân tích mẫu - Các lỗi q trình pha lỗng dẫn đến mối quan hệ tuyến tính số liệu khơng xác - Phụ thuộc vào chuỗi protein Nếu protein không chứa phần dư amino acid thơm thuốc nhuộm khơng thể liên kết với protein cách hiệu - Phụ thuộc vào việc so sánh độ hấp thụ protein với protein tiêu chuẩn Nếu protein không phản ứng với thuốc nhuộm theo cách tương tự protein tiêu chuẩn, nồng độ đo khơng xác - Thuốc thử có xu hướng nhuộm ống nghiệm, vết bẩn ảnh hưởng đến việc đọc độ hấp thụ - Nhạy cảm với thời gian nên cần đảm bảo mẫu ủ lượng thời gian để so sánh xác - Bị ức chế diện chất tẩy rửa - Thuốc nhuộm Coomassie Blue G250 ban đầu dễ dàng liên kết với nhóm protein arginine lysine Sự ưu tiên thuốc nhuộm với axit amin dẫn đến phản ứng khác xét nghiệm protein khác III KẾT QUẢ THỰC HÀNH: Đo giá trị hấp thu (OD) bước sóng 595 nm: Dung mơi tủa protein (NH4)2SO4 OD595nm đối chứng 0,440 OD595nm mẫu tủa protein 0,555 OD595nm mẫu thô 0,728 ΔOD595nm mẫu tủa protein 0,115 ΔOD595nm mẫu thơ 0,288 Đường chuẩn: Protein chuẩn (µg) 10 20 30 40 50 ΔOD595nm 0.033 0.069 0.107 0.142 0.176 Sử dụng phần mềm excel để xây dựng đường chuẩn: Trình bày0.2 cách tính nồng độ protein mẫu: 0.18 ΔOD595nm 0.16 mẫu tủa protein = OD595nm mẫu tủa protein - OD595nm đối chứng = 0,555 – 0,440 = 0,115 0.14 ΔOD595nm ΔOD595nm 0.12 mẫu thô = OD595nm mẫu thô - OD595nm đối chứng = 0,728 – 0,440 = 0,288 y = 0,0036x – 0,0011 0.1 Dựa vào đường chuẩn tuyến tính y = 0,0036x – 0,0011 dựng, ta suy x = Với 0.08 x: 0.06 giá trị 0.04 y: 0.02 giá trị 0 nồng độ µg/ml protein mẫu OD595nm đo từ thực nghiệm R2 = 0,9997 10 30 40 Vì ban đầu thể tích dung dịch20mẫu tủa protein lấy 0,550ml mà 60 dung dịch mẫu thô lấy ml nên nồng độ mẫu Protein chuẩn (µg) tủa protein phải nhân Đồ thị đường chuẩn Kết nồng độ protein Nồng độ protein (µg/mL) Mẫu tủa protein Mẫu thơ x = ×2 = 64,5 x = = 80,3 Hiệu suất tách chiết protein: H (%) = x100% = x100% = 80,3% Nhận xét: Lượng protein mẫu thô thu : 80,3 Lượng protein mẫu tủa protein thu được: 64,5 Lượng protein mẫu thô cao gấp 1,2 lần lượng protein mẫu tủa protein Hiệu xuất kết tủa đạt thấp 100% Giải thích: + Sau lấy mẫu khỏi máy ly tâm khơng gạn bỏ phần dung dịch phía ngay, làm cho lượng protein kết tủa bị hoà tan phần + Q trình hồ tan mẫu protein ống nghiệm diễn khơng hồn tồn, lượng tủa protein nằm đáy ống + Bấm canh thời gian bước thực hành thí nghiệm chưa xác nên thuốc thử khơng liên kết tốt với protein, làm cho protein có mẫu khơng hấp thụ tốt bước sóng từ ánh sáng + Ống cuvette đo máy OD chưa rửa sạch, bị dính dấu vân tay + Các thao tác dùng máy OD chưa xác - HẾT - ... xét: Lượng protein mẫu thô thu : 80,3 Lượng protein mẫu tủa protein thu được: 64,5 Lượng protein mẫu thô cao gấp 1 ,2 lần lượng protein mẫu tủa protein Hiệu xuất kết tủa đạt thấp 100% Giải... độ protein Nồng độ protein (µg/mL) Mẫu tủa protein Mẫu thơ x = ? ?2 = 64,5 x = = 80,3 Hiệu suất tách chiết protein: H (%) = x100% = x100% = 80,3% Nhận xét: Lượng protein mẫu thô thu : 80,3 Lượng. .. ngay, làm cho lượng protein kết tủa bị hoà tan phần + Quá trình hồ tan mẫu protein ống nghiệm diễn khơng hồn tồn, lượng tủa protein cịn nằm đáy ống + Bấm canh thời gian bước thực hành thí nghiệm