Kỹ thuật sắc ký cột hở

Thông tin tài liệu

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT Phương pháp sắc ký 2 3 4 1 Dụng cụ hóa chất Kỹ thuật tiến hành Ưu nhược điểm Phương Pháp Sắc Ký Nguyên tắc phương pháp sắc ký Sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định Pha tĩnh đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích Pha động di chuyển qua pha tĩnh bởi áp suất hoặc do trọng.

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT Phương pháp sắc ký Dụng cụ - hóa chất Kỹ thuật tiến hành Ưu - nhược điểm Phương Pháp Sắc Ký Nguyên tắc phương pháp sắc ký Sắc ký là một phương pháp tách đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha chuyển động theo một hướng xác định - Pha tĩnh: đứng yên có khả hấp thụ chất phân tích - Pha động di chuyển qua pha tĩnh bởi áp suất hoặc trọng lực Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống trơ về mặt hóa học đối với các chất quá trình sắc ký có thể là: thủy tinh, kim loại, nhựa thẳng Nguyên tắc phương pháp sắc ký Chất hấp phụ thuường dùng là alumina, silica gel, CaCO3, than hoạt tính, polyamid, các loại có gắn nhóm ion, Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa Dung môi dùng có thể là một hoặc hỡn hợp nhiều loại dung môi có tỉ lệ thích hợp Quy trình rửa giải là sử dụng dung môi có tính chất hướng về một phía hoặc tăng hoăcc̣ giảm về tính chất Với các chất hấp phụ pha thuận cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần Việc tách hai hợp chất đạt kết tốt hay không là tùy thuộc vào hệ số phân chia Bất kỳ một hợp chất nào được đặt vào một hệ thống gồm có pha, lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ cố định, tỉ lệ này thay đổi tùy vào các tính chất động học của các hợp chất và của hai pha Do các cấu tử có ái lực khác với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc độ khác và tách khỏi Phân loại sắc ký Theo pha động: Theo khơng gian: • • • • • • Sắc ký khí: pha động là khí Sắc ký lỏng: pha động là lỏng Sắc ký chất lỏng siêu tới hạn: CO2 lỏng Theo chế: • • • • Sắc ký hấp phụ Sắc ký phân bố Sắc ký ion Sắc ký rây phân tử Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Sắc ký giấy Dụng cụ, hoá chất Dụng cụ, hố chất Cột Cột là những ớng hình trụ bằng thủy tinh dài 30-70 cm, đường kính 1-5 cm, đầu dưới có một vòi thủy tinh và khóa để điều chỉnh tốc độ chảy Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lượng mẫu chất cần phân tách - Trọng lượng chất hấp phụ phải lớn hơn 25- 50 lần trọng lượng mẫu cần sắc ký - Tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp phụ và đường kính của cột vào khoảng 10:1 Dụng cụ, hố chất Pha tĩnh Silica gel • Silica gel pha thường: đường kính trung bình 40 – 200µm, các lỡ rỡng có đường kính trung bình 40 – 300Å, diện tích bề mặt khoảng 100 – 800 m2/g • Vị trí hoạt động: nhóm silanol, hoạt động mạnh tạo nối hydrogen mạnh với những hợp chất được sắc ký, những chất phân cực bị silica giữ chặt lại cột và giải ly chậm hơn và ngược lại • Có thể điều chỉnh hoạt tính bề mặt silica gel cách: - Thêm nước (giảm hoạt tính) hoặc loại bỏ nước (tăng hoạt tính) - Kết hợp với những hợp chất khác (silica gel cơ chế hóa) Dụng cụ, hoá chất Pha tĩnh Alumina Alumina là oxid aluminium Al2O3, qui trình điều chế tương tự silica gel nhưng trên nguyên liệu là hydroxid aluminium, hơn nữa có thể điều chỉnh độ pH của dung dịch phản ứng để sản xuất hạt alumina với bề mặt có tính acid, tính kiềm hay trung tính - Alumina trung tính: pH từ 6,5-7 Alumina axit: pH 4 Alumina base: chứa khoảng 0,1-0,5% NaOH bám trên mặt alumina ở dạng natri aluminat, có pH 10 Muốn có alumina hoạt tính mạnh, cần phải đun nóng alumina ở 400-450 oC 12-16 giờ Muốn giảm hoạt tính alumina, thêm nước vào Dụng cụ, hoá chất Mẫu sắc ký Mẫu thử trước phân tích phải được loại tạp chất bằng phương pháp thích hợp Mẫu thử có thể ở dạng: - Dạng dung dịch khá đậm đặc: hòa tan mẫu dung môi không quá phân cực so với hệ dung môi pha động - Dạng bột khô: hòa tan mẫu dung môi như etyl axetat hoặc methanol, thêm vào silica gel hạt lớn vừa đủ, cô quay hỗn hợp để đuổi hết dung môi thu được mẫu ở dạng bột mịn tơi xốp Dạng dung dịch đậm đặc 12 Dạng bột khô Kỹ Thuật Tiến Hành 1.Nhồi cột Cách 1: 1.Cho dung môi vào cột, cho chạy qua cát và miếng đêm bông vải để loại bọt khí đó (Hình 4, bước B) 2.Đặt phễu khô trên đỉnh cột và đổ từ từ silica hoặc alumina (pha tĩnh) vào dung môi này Để dung môi chảy từ từ tránh bị tràn (hình 4, bước C) 3.Để pha tĩnh lắng xuống và nhẹ nhàng đóng van cột lại để silica/alumina được nhồi chặt cột (Hình 4, bước D) 4.Tháo dung môi đến mức chạm vào bề mặt pha rắn (hình 4, bước E) 13 1.Nhồi cột Cách 2: Thêm silica gel khô vào cột và nối chân không bằng cách nối ống chân không vào đầu của cột (hình 5, bước B) Chân không giúp quá trình nén silica gel và giữ nó ổn định cho bước tiếp theo Khi tạo độ chân không rồi, rót từ từ dung môi vào (Hình 5, bước D) Để dung môi chảy qua cột tới chảy đến đáy cột Tại điểm này, đóng van và tắt chân không (Hình 5, bước E) Để dung môi qua cột với lượng khoảng – lần lượng dung môi đầy cột để đảm bảo hoàn thành quá trình nhồi cột Tháo dung môi cho tới mức dung môi cột chạm vào bề mặt pha tĩnh (hình 5, bước F) 14 1.Nhồi Cột Cách 3: Rót dung môi vào khoảng 1/3 dung tích cột (Hình 6, bước B).Dùng cốc có mỏ, đong lượng silica/alumina vừa đủ Đong lượng dung môi gấp khoảng 1,5 lần lượng silica Thêm silica vào dung môi, một, vừa thêm vừa lắc nhẹ, khuấy lên Rót hoặc dùng pipet để thêm hỗn hợp silica và dung môi vào cột Để dung môi thoát khỏi cột tránh bị tràn (Hình 6, bước C).Gõ nhẹ vào cột để bọt khí thoát và silica lắng x́ng (Hình 6, bước D) Tiếp tục đổ hỗn hợp vào cột đến khi tất lượng silica/alumina hết.Rửa thành cột bằng cách rót dung môi lên thành của cột Mở van tháo dung môi đến mức dung môi cột chạm đến bề mặt của pha tĩnh (Hình 6, bước E) 15 Nạp mẫu Nạp mẫu dạng dung dịch • Mở khóa cho dung môi chảy khỏi cột để hạ mức dung môi cột xuống cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp phụ cột Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột • • • • • 16 Đóng khóa lại, dùng pipette hút dung dịch mẫu chất và nạp vào đầu cột Đặt đầu của pipette gần sát với mặt thoáng của chất hấp phụ cột, vừa bóp vừa rây pipette dọc quanh thành của cột, cho dung dịch chất chảy dọc theo thành của cột chạm xuống bề mặt của chất hấp phụ Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu được thấm hết vào chất hấp phụ trên đầu cột Dùng pipette cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, dùng dung môi này để rửa sạch dung dịch mẫu chất đã dính trên thành cột Tiếp tục mở khóa cho dung môi chảy qua Lặp lại vài lần như thế để dung dịch mẫu thấm sâu vào phần chất hấp phụ ở phần đầu cột và phần dung môi trên đầu cột trở nên suốt Cho một lớp cát (hoặc bông gòn) dầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ mặt cột Sau nạp mẫu xong cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly Nạp mẫu Nạp mẫu dạng bột khô: • Đặt mẫu khô lên đầu cột, dùng dung môi bắt đầu sắc ký cột thấm ướt toàn bộ silica gel • Cho một lớp bông gòn trên bề mặt thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ • Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly 17 Giải ly chất khỏi cột Các phương pháp giải ly • Giải ly nhờ trọng lực: các hạt gel nạp vào cột có kích thước lớn hon 60àm ã Gii ly s dng lc õy: dung máy bơm tạo áp lực để đẩy dung môi qua pha tĩnh, kích thước hạt gel 40-63 µm, cột sắc ký có thành dày với lớp bao lưới che chắn bên ngoài để tránh vỡ cột có áp suất cao • 18 Giải ly sử dụng lực hút: dùng máy bơm hút chân không ở đầu của cột Giải ly chất khỏi cột Dung môi giải ly và kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly • Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ: chỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhưng hỗn hợp tỉ lệ giữa các thành phần không thay đổi để giải ly việc tách chất hoàn tất • Giải ly sử dụng dung môi có nồng độ tăng theo kiểu bậc thang: Việc sử dụng một loại dung môi sẽ chỉ giải ly khỏi cột một số cấu tử nhất định và một số cấu tử khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột Vì muốn đuổi chúng khỏi cột, phải dùng một dung môi có ái lực mạnh hơn • Giải ly sử dụng dung môi với nồng độ tăng dần tuyến tính: Dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần đều 19 Giải ly chất khỏi cột Vận tốc giải ly • Vận tớc chảy của dung môi giải ly không được quá nhanh (sẽ không kịp cân bằng với chất hấp phụ) không được quá chậm hoặc bị cho ngừng lại một thời gian vì lúc đó các dãy chất tan sẽ khuếch tán hoặc trải dài theo mọi hướng làm xấu quá trình tách • Thông thường đa sớ sắc ký cột, vận tốc giải ly khoảng 5-50 giọt/phút hoặc 1-2 cm/phút 20 Giải ly chất khỏi cột Theo dõi quá trình giải ly cột - Với mẫu có màu: quan sát bằng mắt thường ta thấy các dãy lớp có màu sắc khác tách xa Theo dõi các dãy màu và hứng chúng được giải ly khỏi cột - Với các mẫu không màu: hứng dung dịch giải ly những hủ bi có thể tích như và đánh số thứ tự Dung dịch những hủ bi hứng được sẽ được sắc ký lớp mỏng trên cùng một bản mỏng Những lọ nào có sắc ký bản mỏng giống sẽ được gom chung lại với thành một phân đoạn Đuổi dung môi ở áp suất kém các phân đoạn này sẽ cho cao của các phân đoạn đó 21 Giải ly chất khỏi cột Ghi nhận kết sắc ký • Phân đoạn thu được là một chất tương đối sạch có chứa một tạp chất: trên mỏng có một vết chiếm 80%, ngoài còn một sớ vết mờ • Phân đoạn thu được là hỗn hợp nhiều chất: trên mỏng có nhiều vết, các vết có độ đậm như • Để kiểm tra xem một hợp chất có tinh khiết hay không ta sử dụng sắc ký lớp mỏng lần lượt với hệ dung môi giải ly hoàn toàn khác hẳn Nếu chất chỉ cho hiện một vết nhất thì có thể kết luận là chất tinh khiết Nếu chất không tinh khiết thì sẽ cho thấy bên cạnh vết có thêm vết khác • Ḿn khảo sát rõ hơn thì dùng HPLC 22 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất Chỉ nên tìm cách xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất tinh khiết sau đã kết tinh nhiều lần dung môi phù hợp (độ tinh khiết 95%) Kết quả khảo sát cấu trúc hóa học của một hợp chất theo các chi tiết sau: • Mô tả hình dạng, màu sắc và mùi của sản phẩm • Sắc ký lớp mỏng hệ dung môi gì, thuốc hiện hình gì, giá trị Rf của vết, hình chụp mỏng • Điểm nóng chảy, Năng lực triền quang • Khới phở, Phân tích nguyên tớ, Phổ hồng ngoại IR, Phổ tử ngoại: λmax, Phổ 1H –NMR, Phở 13C-NMR Sau biện luận các tín hiệu của các loại phổ, so sánh với các số liệu tài liệu sẽ đề xuất cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập được 23 Ưu - nhược điểm Nhược điểm Ưu điểm • Có thể sử dụng hai lĩnh vực phân tích và điều chế • Sắc ký cột không những dùng để xác định số lượng các thành phần của hỗn hợp mà nó còn có thể được dùng để tách và tinh chế những thành phần phân tích • 24 Pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm; có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất • Khi chạy cột sắc ký đòi hỏi sự theo dõi liên tục để trì mức dung môi vì nếu không sẽ dễ gây xuất hiện các bọt khí làm tắc cột, nứt cột, biến dạng đường của dung môi • Quá trình chạy cột mất thời gian • Quá trình tách chậm và hiệu thấp so với sắc ký lỏng cao áp Thank For Watching ... Sắc ký khí: pha động là khí Sắc ký lỏng: pha động là lỏng Sắc ký chất lỏng siêu tới hạn: CO2 lỏng Theo chế: • • • • Sắc ký hấp phụ Sắc ký phân bố Sắc ký ion Sắc ký rây... ký phân bố Sắc ký ion Sắc ký rây phân tử Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Sắc ký giấy Dụng cụ, hoá chất Dụng cụ, hoá chất Cột Cột là những ống hình trụ bằng thủy tinh dài... thu được mẫu ở dạng bột mịn tơi xốp Dạng dung dịch đậm đặc 12 Dạng bột khô Kỹ Thuật Tiến Hành 1.Nhồi cột Cách 1: 1.Cho dung môi vào cột, cho chạy qua cát và miếng đêm bông vải

Ngày đăng: 10/06/2022, 12:43

Xem thêm: