Đang tải... (xem toàn văn)
NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA NHÓM VI KHUẨN Aeromonas spp, Vibrio spp TRONG MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH Ở CẦN THƠ VÀ VÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH VÀ BẾN TRE
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH HỌC THỦY SẢN HỒ NGỌC THI NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA NHÓM VI KHUẨN Aeromonas spp, Vibrio spp TRONG MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH Ở CẦN THƠ VÀVÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH VÀ BẾN TRE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành gởi đến Cơ Từ Thanh Dung tận tình hướng dẫn, giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến quý báu suốt thời gian thực đề tài, giúp tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Thầy cô Khoa Thuỷ Sản tạo điều kiện thuận lợi cho học tập hoàn thành tốt luận văn Anh, chị lớp Bệnh Học Thuỷ Sản khoá 30 giúp đỡ tơi suốt thời gian tơi làm việc phịng thí nghiệm Tập thể lớp Bệnh Học Thuỷ sản khóa 31 nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Đề tài nhằm nghiên cứu kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp, Vibrio spp môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh Cần Thơ, vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh, Bến Tre Vi khuẩn Aeromonas spp môi trường (nước, bùn) phân lập môi trường GSP-Agar Vibrio spp môi trường TCBS Kết kháng sinh đồ cho thấy Cần Thơ có nhiều vi khuẩn Aeromonas spp kháng thuốc tỉnh Trà Vinh Bến Tre: 3/9 chủng kháng với SM, TE, SXT; 2/9 chủng kháng với DO, khơng có chủng vi khuẩn kháng với CHL, đồng thời Aeromonas spp đa kháng chiếm 3/9 chủng Trong chủng kháng với SXT-DO-TE-SM, chủng kháng với SXT-DO-TE chủng kháng với SXT- SM Tỉnh Trà Vinh có 2/9 chủng đa kháng thuốc (một chủng kháng CHL-SM, chủng kháng SXT-TE), vi khuẩn Aeromonas spp kháng với CHL, SXT, DO, TE có số lượng 1/9 chủng, 3/9 chủng kháng với SM Bến Tre có số lượng vi khuẩn kháng, đa kháng thuốc tương đương với tỉnh Trà Vinh: 2/8 chủng đa kháng (1chủng kháng DO-TE, chủng kháng SXT-SM), vi khuẩn kháng thuốc SXT, DO, TE có số lượng: 1/8 chủng, 5/8 chủng kháng với SM khơng có chủng kháng với CHL Riêng chủng Vibrio spp Trà Vinh, Bến Tre có 9/11 chủng kháng với SM khơng có chủng kháng với CHL, SXT, DO, AM, TE Kết nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chủng vi khuẩn khảo sát cao Đối với SM có giá trị: 16-64 µg/ml, CHL 1-32 µg/ml, OXT: 0,125- 64 µg/ml Riêng chủng Vibrio spp VBT0930 với nồng độ thuốc OXT là: 0,125 µg/ml thấp so với chủng Aeromonas spp (32-64 µg/ml) ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC PHẦN I: GIỚI THIỆU PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thuốc kháng sinh nuôi trồng thuỷ sản 2.2 Những nhóm thuốc kháng sinh sử dụng phổ biến 2.2.1 Nhóm sulfamid 2.2.2 Nhóm β-lactamin 2.2.3 Nhóm tetracyclin 2.2.4 Nhóm phenicol 2.2.5 Nhóm aminosid 2.2.6 Nhóm trimethoprim 2.3 Vi khuẩn Aeromonas spp Vibrio spp 2.4 Nghiên cứu mật độ vi khuẩn tổng cộng môi trường nước 2.5 Nghiên cứu kháng thuốc vi khuẩn nuôi thuỷ sản 2.6 Các thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 13 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.2.1 Dụng cụ .15 3.2.2 Mơi trường, hố chất vật liệu nghiên cứu 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu .16 3.3.1 Địa điểm thu mẫu 16 3.3.2 Số mẫu 16 3.3.3 Phương pháp thu mẫu 16 3.3.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn 16 3.3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 17 3.3.6 Phương pháp lập kháng sinh đồ 17 3.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) .18 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .20 4.1 Kết thu mẫu, phân lập định danh vi khuẩn 20 4.2 Kết kiểm tra kháng sinh đồ .22 4.2.1 Kết kháng sinh đồ vi khuẩn Aeromonas spp Cần Thơ 22 4.2.2 Kết kháng sinh đồ vi khuẩn Aeromonas spp Trà Vinh 24 4.2.3 Kết kháng sinh đồ vi khuẩn Aeromonas spp Bến Tre 26 4.2.4 Kết kháng sinh đồ vi khuẩn Vibrio spp Trà Vinh Bến Tre 27 4.3 Kết nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) kháng sinh lên vi khuẩn 29 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề xuất 32 PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 37 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1 : Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp Cần Thơ 23 Bảng 4.2: Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp Trà Vinh 26 Bảng 4.3 : Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp Bến Tre 27 Bảng 4.4 : Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Các đường trao đổi kháng thuốc vi khuẩn động vật người………………………………………………………………… Hình 4.1: Đĩa phân lập Aeromonas spp màu vàng (mũi tên) môi trường GSP (a) , cấy Aeromonas spp môi trường GSP (b)…………………… 21 Hình 4.2: Hình đĩa kháng sinh đồ chủng Aeromonas spp Cần Thơ……… 22 Hình 4.3: Biểu đồ đặc tính kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp Cần Thơ………………………………………………………………………… 23 Hình 4.4: Biểu đồ đặc tính kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp Trà Vinh………………………………………………………………………… 25 Hình 4.5: Biểu đồ đặc tính kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp Bến Tre……………………………………………………………………………27 Hình 4.6: Biểu đồ đặc tính kháng thuốc vi khuẩn Vibrio spp Trà Vinh, Bến Tre………………………………………………………………………28 Hình 4.7: Kết MIC chủng Aeromonas spp ACT097 ……………….30 vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long AM: ampicillin CHL: chloramphenicol DO: doxycyclin FT: nitrofurantion NA: nalidixic NFXC: norfloxcin OXLA: oxolinic acid OXT: oxytetracyclin SM: streptomycin SMX: sulfamethoxazol SXT: trimethoprim + sulfamethoxazol TE: tetracyclin TMP: trimethoprim R: kháng I: trung bình nhạy S: nhạy vii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN I GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) với ngành nuôi trồng thủy sản phát triển nhanh chóng góp phần tích cực vào việc nâng cao nguồn thu nhập cộng đồng tăng kim ngạch xuất (http://www.mekongdelta.com.vn) Vùng cung cấp 80% tổng sản phẩm thủy sản nước Trong cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) sản phẩm quan trọng khu vực nước Năm 2007, tổng sản lượng cá tra, ba sa toàn vùng 1,2 triệu tấn, theo dự đoán ngành thủy sản: sản lượng quy hoạch năm 2010 1,5 triệu Riêng tỉnh Bến Tre tính đến có khoảng 600 ni cá tra, basa (http://www.vasep.com.vn) Tổng diện tích đất sử dụng để nuôi trồng thủy sản Trà Vinh khoảng 29.187 (http://www.mdec.vn) Với nổ lực tăng nhanh sản lượng thuỷ sản kim ngạch xuất khẩu, nước phát triển trọng tới nuôi trồng thuỷ sản Ðể đạt sản lượng lợi nhuận cao nhất, nhiều ngư dân áp dụng phương thức ni thâm canh tăng cường mở rộng diện tích.Tuy nhiên, nghề ni thâm canh hóa ni với mật độ cao vấn đề dịch bệnh xảy thường xuyên thiệt hại nhiều Nghề nuôi thủy sản phải đương đầu với tình trạng bệnh thường xuyên xuất ngày nghiêm trọng môi trường ô nhiểm lây lan mầm bệnh Nhất bệnh vi khuẩn gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản lượng tôm cá Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát vi khuẩn gây bệnh Do việc sử dụng không cách nên gây tượng vi khuẩn kháng thuốc tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh sản phẩm Việc sử dụng kháng sinh bừa bãi nuôi trồng thuỷ sản gây nhiều vấn đề nghiêm trọng gây độc, biến đổi hệ vi khuẩn người tiêu dùng (www.nhanong.net) Thực trạng cho thấy, việc sử dụng thuốc kháng sinh thủy sản không phổ biến ĐBSCL nói riêng, Việt Nam nói chung mà cịn diễn nhiều nước giới Đây vấn đề đáng quan tâm nhiều nhà khoa học nghiên cứu (Phuong et al., 2005; Le et al., 2005; Sarter et al., 2006; Dung et al., 2008) Do nhu cầu thị trường, nhu cầu cải thiện đời sống, chuyển đổi đối tượng nuôi vùng nhằm hạn chế rủi ro dịch bệnh cho đối tượng nuôi người dân Hiện cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com nuôi phổ biến vùng nước lợ Song song với việc làm việc sử dụng thuốc kháng sinh người dân vấn quan trọng cần quan tâm Việc sử dụng thuốc kháng sinh không cách tạo nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc, tạo nên mối nguy hiểm tiềm tàng Theo Kruse (1994) Prescott et al., (2000) gen kháng thuốc từ vi khuẩn liên quan đến động vật nuôi truyền sang vi khuẩn liên quan đến người qua chuỗi thức ăn qua tiếp xúc trực tiếp (được thể qua hình 2.1) tác động đến khả kháng thuốc chủng vi khuẩn người Xuất phát từ vấn đề cho thấy việc thực đề tài “Nghiên cứu kháng thuốc nhóm vi khuẩn Aeromonas spp, vibrio spp môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh Cần Thơ vùng nước lợ tỉnh Trà vinh, Bến Tre” cần thiết Mục tiêu Đánh giá, kháng thuốc hai nhóm vi khuẩn Aeromonas spp Vibrio spp môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh Cần Thơ vùng nước lợ Trà Vinh, Bến Tre Từ có cách nhìn sâu thuốc kháng sinh nhằm có biện pháp kiểm sốt việc sử dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi, thuỷ sản cách triệt để hơn, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng Nội Dung Thu mẫu, phân lập, định danh đến giống loại vi khuẩn Aeromonas spp, Vibrio spp môi trường nuôi cá tra (nước bùn) thâm canh Cần Thơ, Trà Vinh, Bến Tre Lập kháng sinh đồ hai loại vi khuẩn Aeromonas spp Vibrio spp Xác định giá trị MIC phương pháp pha loãng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com sinh ngắn hơn, tỉ lệ vi khuẩn kháng thuốc ao nuôi Trà Vinh thấp so với nơi khác Tuy nhiên, có tính kháng thuốc thấp tỉnh Cần thơ, Trà Vinh xuất vi khuẩn đa kháng mức thấp phạm vi kháng thuốc hẹp so với chủng vi khuẩn Cần Thơ Bảng 4.2: Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp Trà Vinh Các loại thuốc Số lượng SXT, TE CHL, SM Bên cạnh đó, Trà Vinh lại có 1/9 chủng Aeromonas spp kháng 2/9 chủng trung bình nhạy với chloramphenicol, Bến Tre Cần Thơ khơng có vi khuẩn kháng lại với loại kháng sinh Song, loại thuốc kháng sinh xếp vào danh sách cấm sử dụng, điều đáng quan tâm quan chức địa phương 4.2.3 Kết kháng sinh đồ vi khuẩn Aeromonas spp Bến Tre Bến Tre có địa hình nằm sát biển, bốn bề có sơng nước bao bọc, hệ thống kênh rạch chằn chịt Trong tỉnh có: 64.592 diện tích đất mặn, đất bị mặn chủ yếu tác động nước thuỷ triều nước ngằm mặn, thường xảy vào mùa khô Hiện tình hình ni cá tra tỉnh phát triển nhanh Qua kết kháng sinh đồ cho thấy nhóm vi khuẩn Aerommonas spp môi trường ao nuôi cá tra tỉnh có tính nhạy với kháng sinh mức cao giống Trà Vinh, vi khuẩn nhạy với CHL 8/8 chủng có 7/8; 6/8; 4/8 chủng nhạy với DO, TE, SXT, kết khơng có khác biệt lớn với kết tỉnh Trà Vinh (7/9; 6/9; 8/9) Song, chủng Aeromonas spp lại khơng có chủng nhạy với SM Trái lại, Aeromonas spp trung bình nhạy kháng với kháng sinh SM mức cao (3/8; 5/8 chủng), Trà Vinh 5/9; 3/9 chủng Những thuốc kháng sinh cịn lại có vi khuẩn kháng thuốc mức thấp (1/8 chủng) (Hình 4.5) 26 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 8 Số chủng vi khuẩn S 6 5 4 I R 3 1 1 0 CHL SXT DO TE SM Tên thuốc Hình 4.5: Biểu đồ đặc tính kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp Bến Tre Bên cạnh đó, Bến Tre có số lượng vi khuẩn đa kháng thuốc tương đương với Trà Vinh (2/8 chủng), tính đa kháng thuốc lại khác (ở Trà Vinh có chủng kháng với SXT-TE, chủng kháng với CHL-SM; Bến Tre chủng kháng với DO-TE, chủng kháng với SXT-SM) (Bảng 4.3) Bảng 4.3 : Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp Bến Tre Các loại thuốc Số lượng DO, TE SXT, SM Điều cho thấy rằng, khả nhạy, trung bình kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: thời gian, địa điểm thu mẫu, tình hình sử dụng thuốc kháng sinh địa điểm Do vậy, vùng ni khác hiệu sử dụng thuốc kháng sinh khác dẫn đến sai khác độ nhạy thuốc kháng sinh vùng điều thiết yếu 4.2.4 Kết kháng sinh đồ vi khuẩn Vibrio spp Trà Vinh Bến Tre Theo Frerichs et al., (1993) loài Vibrio trừ V cholerae V metschnikovii, cần Na+ để phát triển, Aeromonas spp khơng cần độ mặn sống mơi trường khơng có muối Với đặc điểm thế, nhóm Vibrio spp phần lớn tìm thấy nước mặn môi trường nước cửa sông phần lớn mầm bệnh cho cá động vật khác sống vùng Aeromonas spp trái ngược lại, sinh vật nước ngọt, mầm bệnh động vật nước Tuy nhiên, Sự khác biệt khơng hồn tồn, nhóm Aeromonas spp lây nhiễm cá nước mặn Vibrio spp nhiễm cá nước Theo đó, mục đích 27 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com nghiên cứu nhằm kiểm tra mối tương tác hai nhóm vi khuẩn vùng nước mặn nhiễm (Trà Vinh, Bến Tre), đồng thời kiểm tra khả phát triển số nhóm vi khuẩn gây bệnh mục đích hạn chế mầm bệnh, hạn chế phát sinh vi khuẩn đa kháng thuốc cá tra vùng Kết tất chủng vi khuẩn Vibrio spp nhạy với loại thuốc kháng sinh Đối với kháng sinh TE, DO, SXT, CHL không thấy xuất vi khuẩn kháng thuốc Riêng kháng sinh AM có số vi khuẩn nhạy 10/11 chủng Đặc biệt hơn, khơng có chủng vi khuẩn nhạy với SM, ngược lại số vi khuẩn kháng lại kháng sinh 9/11 chủng, kết cao so với kết vi khuẩn Aeromonas spp kháng lại thuốc kháng sinh SM tỉnh Trà Vinh (3/9 chủng), tỉnh Bến Tre (5/8 chủng) đồng thời khơng có vi khuẩn Vibrio spp đa kháng thuốc (Hình 4.6) 12 11 11 11 11 10 Số chủng vi khuẩn 10 S I R 2 0 0 0 CHL SXT DO AM TE SM Tên thuốc Hình 4.6: Biểu đồ đặc tính kháng thuốc vi khuẩn Vibrio spp Trà Vinh, Bến Tre Phuong et al., (2005) kiểm tra độ nhạy loại kháng sinh 32 chủng Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú ĐBSCL cho thấy tất kháng với ampicilin 1–3 chủng kiểm tra kháng với oxinilic acid, streptomycin, tetracycline, oxytetracycline chloramphenicol Đặng Thị Hoàng Oanh ctv (2006) xác định khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) Kết kháng sinh đồ 26 27 chủng vi khuẩn phân lập với loại thuốc kháng sinh có 100% chủng thử nghiệm kháng với AM có khỗng từ (hoặc hơn) 15% kháng với SXT, TE, CHL Phần lớn (77%) chủng vi khuẩn kháng với loại kháng sinh Số chủng khác kháng với loại kháng sinh (15%) Có chủng kháng loại chủng kháng với loại kháng sinh thử nghiệm Nhìn chung, kết nghiên cứu có tỉ lệ vi khuẩn Vibrio kháng, đa thuốc cao kết nghiên cứu 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Nhưng với kết nghiên cứu Trần Thị Tuyết Hoa ctv (2004) tính kháng thuốc 50 chủng vi khuẩn Vibrio phân lập từ hệ thống ương tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) trại sản xuất giống Cần Thơ có tương đồng (các chủng vi khuẩn nhạy với kháng sinh TE có 40/50 chủng vi khuẩn kháng lại SM) Kết nghiên cứu Nguyễn Thị Tiên (2007) khả kháng thuốc vi khuẩn phân lập tôm sú Penaeus monodon bệnh phân trắng Bến Tre, Sóc Trăng 26,3% kháng với AM, 21.05% kháng với SM, kháng với TE 5,26%, khơng có vi khuẩn kháng với CHL Kết có khác biệt đáng kể so với kết nghiên cứu Nhưng xét mặt thời gian, không gian cho ta thấy nghiên cứu vào năm khác nơi khác nên có kết khác điều tất yếu Song, nhìn chung tính kháng thuốc Vibrio spp tác giả nghiên cứu mức cao Nhưng, với kết nghiên cứu khơng có vi khuẩn kháng với kháng sinh nghiên cứu ngoại trừ SM (8/11 chủng kháng) vi khuẩn Aeromonas spp từ môi trường ao nuôi hai tỉnh lại có 1/9 chủng kháng (tỉnh Trà Vinh) 1/8 chủng kháng (tỉnh Bến Tre) với CHL, SXT, DO, TE Sự khác biệt giải thích sau: đặc điểm vùng khảo sát ln có mùa nước mùa nước mặn năm nên hệ vi khuẩn ao nuôi thường xuyên biến đổi Do hệ vi khuẩn Vibrio spp tồn ao tiếp xúc với hệ vi khuẩn Aeromonas spp Vibrio spp khác thời gian ngắn nên bị ảnh hưởng, tương tác từ hệ vi khuẩn khác, từ đặc tính nhạy với kháng sinh hệ vi khuẩn ổn định Bên cạn đó, tất nghiên cứu có SM kháng cao với Aeromonas spp Vibrio spp điều dể dàng nhận thấy SM có tính lờn thuốc xảy nhanh (Bùi Kim Tùng ctv, 2001) 4.3 Kết nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) kháng sinh lên vi khuẩn Sau lập kháng sinh đồ, số nhóm vi khuẩn Aeromonas spp tỉnh chọn chủng mang tính đa kháng thuốc chủng Vibrio spp để xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu loại thuốc: oxytetracyclin (OXT), chloramphenicol (CHL), streptomicin (SM) Kết giá trị MIC chủng chuẩn E coli (ATCC 25922) với loại thuốc kháng sinh điều nằm khoãng cho phép theo tiêu chuẩn Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2006b 29 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Hình 4.7: Kết MIC chủng Aeromonas spp ACT097 với nồng độ 64 ppm Giá trị MIC chủng khảo sát sau: Bảng 4.4 : Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Giá trị MIC (µg/ml) Vi khuẩn OXT CHL SM Aeromonas spp ATV0811 64 32 16 Aeromonas spp ABT099 32 32 Aeromonas spp ACT097 32 32 64 Vibrio spp VBT0930 0.125 32 Giá trị MIC lồi vi khuẩn với SM biến động có giá trị cao (16-64 µg/ml) giá trị MIC OXT CHL lại biến động lớn (OXT: 0,125-64 µg/ml; CHL: 1-32 µg/ml) so với nghiên cứu Nguyễn Thị Tiên (2007) giá trị MIC CHL số loài vi khuẩn Vibrio gây bệnh phân trắng tơm sú 2-256 µg/ml, điều cho thấy hệ vi khuẩn Vibrio tơm sú có tính kháng thuốc cao giá trị MIC Vibrio khảo sát lại tương đối thấp (4 µg/ml) Mặc khác, theo nghiên cứu Châu Hồng Thuý, (2008) xác định giá trị MIC 16 chủng vi khuẩn E ictaluri từ cá tra bệnh mủ gan Trà Vinh cho thấy giá trị MIC với CHL từ 0,5-4 µg/ml, khảo sát địa điểm thời gian giá trị MIC ATV0811 với CHL 32 µg/ml Kết khác biệt hai lồi vi khuẩn khác nên tính kháng thuốc khác Tuy nhiên, OXT thí nghiệm cho kết MIC từ 0,125-64 µg/ml tương đương với nghiên cứu Dung et al., (2008) vi khuẩn gây bệnh mủ gang (Edwardsiella ictaluri) ĐBSCL với giá trị MIC: 0,125-64 30 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com µg/ml, qua ta thấy vi khuẩn tồn mơi trường mang đặc tính kháng tương đương với vi khuẩn gây bệnh cá Qua kết nghiên cứu thấy, việc dùng thuốc kháng sinh thuỷ sản gây tác động lớn đến môi trường Khi thuốc kháng sinh sử dụng với số lượng lớn thời giàn dài để lại tồn lưu môi trường, điều dễ làm phát sinh nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc Khi vi khuẩn có yếu tố kháng thuốc khơng truyền cho vi khuẩn lồi mà cịn truyền lồi với nhau, lý làm cho nhiều loại thuốc kháng sinh trở nên vô tác dụng Vì vậy, để bảo vệ sức khoẻ vật ni nói riêng lợi ích cộng đồng nói chung việc hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh, bảo vệ môi trường sinh thái cần thiết 31 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Qua kết nghiên cứu tính kháng nhóm vi khuẩn vùng khác cho thấy vi khuẩn Cần Thơ có tính kháng thuốc cao với 3/9 chủng vi khuẩn đa kháng thuốc, vi khuẩn kháng với SM, TE, SXT 3/9 chủng, kháng với DO 2/9 chủng, khơng có vi khuẩn kháng với CHL Vi khuẩn Trà Vinh Bến Tre có tính kháng thuốc tương đương Trong đó, Trà Vinh với vi khuẩn đa kháng thuốc 2/9 chủng kháng với loại thuốc CHL, SXT, DO, TE 1/9 chủng, riêng SM 3/9 chủng kháng Bến Tre vi khuẩn đa kháng thuốc 2/8 chủng, 1/8 chủng kháng với SXT, DO, TE, riêng SM có 5/8 chủng kháng khơng có vi khuẩn kháng với CHL Tính nhạy cảm vi khuẩn Vibrio cao, khơng có chủng kháng với loại kháng sinh (CHL, SXT, DO, AM), riêng SM có 9/11 chủng kháng Giá trị MIC chủng Aeromonas spp vùng chủng Vibrio spp VBT0930 cao có biến động lớn CHL: 1-32 µg/ml, OXT: 0,125-64 µg/ml, riêng với SM giá trị MIC cao biến đơng (16-64 µg/ml) Qua ta thấy, nồng độ ức chế tối thiểu thuốc kháng sinh vi khuẩn môi trường nước bùn loại kháng sinh cao 5.2 Đề xuất Do thời gian thực đề tài có hạn thí nghiệm cần khảo sát thêm nhiều vùng nuôi thuỷ sản khác ĐBSCL để nghiên cứu phạm vi rộng Cần thử nghiệm nhiều loại thuốc kháng sinh để khảo sát tính kháng thuốc cách tồn diện vi khuẩn nhiều loại thuốc khác Tiếp tục nghiên cứu chủng vi khuẩn cịn lại có mơi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Ứng dụng sinh kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu sở di truyền kháng thuốc vi khuẩn 32 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Kim Tùng, Bùi Kim Hoàng Bùi Kim Tân, 2001 Thuốc kháng sinh Sở khoa học công nghệ môi trường tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu 255 trang Bùi Quang Tề, 2003 Bệnh tơm ni biện pháp phịng trị Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội 112 trang Bùi Thị Tho, 2003.Thuốc kháng sinh nguyên tắc sử dụng chăn nuôi, nhà xuất Hà Nội 323 trang Châu Hồng Thuý, 2008 Khảo sát tình hình xuất bệnh mủ gan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra nuôi thâm canh tỉnh Trà Vinh Luận văn cao học Khoa thuỷ sản Trường Đại Học Cần Thơ, 75 trang Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006 Methods for broth dilution susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals: informational supplement M49-A Clinical and Laboratory Standards Institute Wayne, USA Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng Nguyễn Thanh Phương, 2006 Xác định vị trí phân loại khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Vibrio phat sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) Tạp chí nghiên cứu khoa học: 42-52 300 trang Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng Nguyễn Thị Muội 2004 Giáo trình bệnh học thuỷ sản Khoa nuôi trồng thuỷ sản - Đại Học Thuỷ Sản Nha Trang 346 trang Dung, T.T., F Haesebrouck, N.A Tuan, P Sorgeloose, M Baele and A Decosrere, 2008 Antimicrobial susceptibility pattern of Edwardsiella ictaluri isolates from natural outbreak of bacillary necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Viet Nam Microb Drug Resist: 14(4): 311-6 Durborow, R M and R F Floyd, 1996.Medicated feed for food fish Souhern Regional Aquaculture Center (SRAC) publicction no 743pp 10 Frerichs, G N and S d Millar 1993 Mannual for the isolate and indentification of fish bacterial pathogent Institute of aquqculture, University of Stirling, Scotland 107pp 11 Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008 Tiêu chuẩn hoá phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc kháng sinh lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila khoa Thuỷ Sản Luận văn tốt nghiệp khoa Thuỷ Sản- Trường Đại Học Cần Thơ 38 trang 12 Inglis, V, R J Roberts and N R Bromage, 1993 Bacterial diseases of fish Institte of aquaculture, University Press, Cambridge 312 pp 13 Kiêm Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, Nguyễn Thị Như Ngọc Phạm Thanh Liêm, 2007 Thuốc hố chất ni trồng thuỷ sản Khoa thuỷ sản Trường Đại Học Cần Thơ 79 trang 14 Kruse, H, and H Sorum, 1994 Transfer of Multiple Drug Resistance Plasmids between bacteria of Diverse Origins in Natural 33 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Microenviroments Applied and environmental microbiology, 60: 40154021 15 Lê Thị Barrow, G.I and R K A Feltham, 1993 Cowan and Steel’s manual for the indentification of medical bacteria, 3rd edn Cambridge Univesity Press, Cambridge 262pp 16 Le, T X, Y Munekage and S Kato, 2005 Antibiotic resistance in bacteria from shrimp farming in mangrove areas Science of the Total Environment 349 95-105 17 Neela, F A, L.Nonaka and S Suzuki, 2006 The diversity of multi-drug resistace profiles in tetracycline-resistant Vibrio species isolated from coastal seawater The Journal of Microbiology, 45: 64-68 18 Nguyễn Chính, 2005 Đánh giá tình hình sử dụng thuốc thú y thuỷ sản nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh An Giang Cần Thơ Luận văn cao học Khoa thuỷ sản Trường Đại Học Cần Thơ, 80 trang 19 Nguyễn Hà Giang, 2008 Tiêu chuẩn hoá phương pháp xác định tiêu sinh hoá vi khuẩn Aeromonas hydrophila khoa thuỷ sản Luận văn tốt nghiệp đại học, Khoa Thuỷ Sản-Trường Đại Học Cần Thơ 42 trang 20 Nguyễn Mạnh Hùng, 2008 Khảo sát mật độ vi khuẩn tổng cộng nước vi khuẩn Coliforms cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ao Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Thuỷ Sản-Trường Đại Học Cần Thơ 47 trang 21 Nguyễn Phước Tương Trần Diễm Quyên, 2000 Sử dụng thuốc biện dược thú y Nhà xuất Nông Nghiệp 314 trang 22 Nguyễn Thị Thuý Hằng, 2008 Tiêu chuẩn hoá phương pháp lập kháng sinh đồ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila khoa thuỷ sản Luận văn tốt nghiệp đại học khoa Thuỷ Sản- Trường Đại Học Cần Thơ 56 trang 23 Nguyễn Thị Tiên, 2007 Xác định đặc điểm sinh hoá mầm bệnh vi khuẩn phân lập tôm sú (Penaeus monodon) bệnh phân trắng Luận văn tốt nghiệp đại học khoa Thuỷ Sản- Trường Đại Học Cần Thơ 48 trang 24 Petersen, A., J S Andersen, T.Kaewmak, T Somsiri, and A Dalsgaard, 2002 Impact of Integrated Fish Farming on Antimicrobial Resistance in a Pond Environment Applied and enviromental microbiology,68: 60366042 25 Prescot, J F, J D Baggot and R D Walker, 2000 Antimicrobial therapy in veterinary medicine Iowa State University Press/Ames 795 pp 26 Saavedra, M.J, S G Novais, A Alves, P Rema, M Tacao, A Correia and A M Murcia, 2004 Resistance to β-lactam antibiotics in Aeromonas hydrophila isolated from rainbow trout (oncorhynchus mykiss) International Microbiology 7:207-211 34 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 27 Sarter,S, H N K Nguyen, L.T Hung, J Lazard and D Montet, 2006 Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria isolated from farmed catfish Food Control 18 (2007) 1391-1396 28 Tô Công Tâm, 2002 Khảo sát biến động yếu tố thuỷ lý hoá nước nhóm vi khuẩn gây bệnh ao ni cá tra mùa lũ Luận văn tốt nghiệp đại học, Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại Học Cần Thơ 27 trang 29 Trần Anh Dũng, 2005 Khảo sát tác nhân gây bệnh ao nuôi cá tra thâm canh tỉnh An Giang Luận văn thạc sĩ ngành nuôi trồng thuỷ sản, Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại Học Cần Thơ 66 trang 30 Trần Thị Thu Hằng, 2006 Dược lực học, tái lần tám Nhà xuất Phương Đông, trang 629-699 31 Trần Thị Tuyết Hoa, Nguyễn Thị Thu Hằng, Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Phương, 2004 Thành phần loài khả gây bệnh nhóm vi khuẩn Vibrio phân lập từ hệ thống ương tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ Tập chí khoa học 2004 Trang 153-164 32 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình bệnh học thuỷ sản Khoa thuỷ sản Trường Đại Học Cần Thơ, 123 trang 33 Các trang web: www.thuocbietduoc.com.vn http://investment.ttv.vn http://snn.cantho.gov.vn http://www.mdec.vn http://www.mekongdelta.com.vn http://www.vasep.com.vn www.laocai.gov.vn www.nhanong.net 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Phụ lục PHIẾU THU MẪU Số TT:…… Ngày thu mẫu: Họ tên người nuôi: Địa chỉ: Điện thoại: Loài cá: Tuổi hay cỡ cá: Trọng lượng (g): Chiều dài (cm): Chi ều Cao (cm): Kích thước ao: Dài (m): Rộng (m): Sâu (m): Kích thước bè: Dài (m): Rộng (m): Sâu (m): Số lượng cá thả ao hay bè: Mật độ cá thả (con/m2, con/m3): Ngày thả cá: Nguồn giống: Vệ sinh, cải tạo ao/bè (có/khơng): Hóa chất sử dụng, liều lượng: Vôi: Thuốc tím: Các loại khác: Loại thức ăn: Ngày mua thức ăn: Thức ăn tươi sống: % thức ăn/trọng lượng thể: Tần số cho ăn: Thức ăn chế biến: % thức ăn/trọng lượng thể: Tần số cho ăn: Nguồn nước: 36 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Chất lượng nước: Các tiêu môi trường: pH: NH4 +: Độ kiềm: Màu nước ao hay bè: Có thay nước hay khơng: Thời gian thay nước: Ngày xuất bệnh: Số cá chết hàng ngày: Tăng/giảm: Ngày bắt đầu dung thuốc: Các loại thuốc sử dụng, liều lượng: Loại thuốc sử dụng có hiệu không: Tên người thu mẫu 37 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phụ lục Xác định tiêu (Theo cẩm nang Cowan Steel (Barrow Feltham, 1993)) Quan sát tính di động Sự di động vi khuẩn quan sát phương pháp giọt nước treo vật kính 40X Các bước thực sau: Cho Vaseline lên bốn góc lamelle đặc ngửa lamelle bàn Dùng que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle Tiệt trùng que cấy, lấy vi khuẩn cho lên lamelle hoà vào nước muối sinh lý Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước treo ngược lamelle Đặt lame lên kính hiển vi quan sát tính di động vi khuẩn vật kính 40X Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ giọt nước cất lên lame, dùng que cấy nhặt vi khuẩn trãi lên giọt nước cất Để khơ nhiệt độ phịng sau hơ lướt lame lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn lame Các bước nhuộm Gram: Nhỏ dung dịch crystal violet lên lame Để phút Rửa nước cho hết màu tím lame (khoảng giây), để khơ nhiệt độ phịng Nhỏ dung dịch 95% cồn:5% aceton để tẩy màu cách nghiên lame nhỏ từ từ dung dịch giọt nước cuối lame khơng cịn màu tím Rửa để khơ nhiệt độ phòng Nhỏ dung dịch safranin lên lame, để khoảng phút Rửa để khô nhiệt độ phịng Quan sát vật kính 100X Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ Phản ứng oxidase Sử dụng test Bactident Oxidase Dùng que cấy phết vi khuẩn lên giấy tâm cytochrome oxidase Vi khuẩn cho phản ứng oxidase (+) làm giấy chuyển sang màu tím tím đen vịng 60 giây ngược lại Phản ứng catalase 38 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Dung que cấy nhặt vi khuẩn lên lame, sau nhỏ lên vi khuẩn giọt H2O2 3% Vi khuẩn cho phản ứng catalase (+) gây tượng sủi bọt dung dịch H2O2 3% ngược lại Khả lên men oxy hoá đường glucose (Fermentation/ oxidation: O/F) Môi trường O/F (xem công thức pha chế nhãn) Đun khuấy cho tan hoàn toàn Tiệt trùng 121oC 15 phút, để nguội 45oC Thêm 1% glucose tiệt trùng Cho ml môi trường vào ống nghiệm Cấy vi khuẩn vào hai ống nghiệm có chứa mơi trường OF Sau cho phủ 0.5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào ống nghiệm để tạo thành điều kiện yếm khí ống nghiệm Để tủ tủ ấm 28oC Đọc kết sau 1-7 ngày Lên men (F) ống có phủ paraffin chuyển sang màu vàng Oxidation (O) ống không phủ paraffin chuyển sang màu vàng Khơng đổi hai ống có màu xanh xanh lơ Khả phản ứng với O/129 Tiến hành giống kháng sinh đồ Đọc kết đường kính vịng vơ trùng ≥ 20 mm: nhạy; < 20: kháng 39 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phụ lục Bảng: nồng độ thuốc dung dịch vi khuẩn cần pha Nồng Thuốc độ cần kháng sinh STT pha (ml) (µg/ml) Thể tích nước muối sinh lý (ml) Thể tích dd thuốc kháng sinh (ml) Thể tích dd vi khuẩn (ml) Nồng độ cuối (µg/ml) 3 512 1024 25 (dd thuốc gốc 1) 512 25 (1024) 25 3 256 256 25 (512) 25 3 128 128 25 (dd thuốc gốc 2) 25 3 64 64 25 (128) 25 3 32 32 25 (64) 25 3 16 16 25 (32) 25 3 8 25 (16) 25 3 25 (8) 25 3 10 25 (4) 25 3 11 25 (2) 25 3 0,5 12 0,5 25 (1) 25 3 0,25 13 0,25 25 (0,5) 25 3 0,125 40 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ... nhằm nghiên cứu kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp, Vibrio spp môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh Cần Thơ, vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh, Bến Tre Vi khuẩn Aeromonas spp. .. Cần Thơ vùng nước lợ tỉnh Trà vinh, Bến Tre? ?? cần thiết Mục tiêu Đánh giá, kháng thuốc hai nhóm vi khuẩn Aeromonas spp Vibrio spp môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh. .. đến giống loại vi khuẩn Aeromonas spp, Vibrio spp môi trường nuôi cá tra (nước bùn) thâm canh Cần Thơ, Trà Vinh, Bến Tre Lập kháng sinh đồ hai loại vi khuẩn Aeromonas spp Vibrio spp Xác định giá
