TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỊ ĐAN THANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN TRÊN CÁ TRA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỊ ĐAN THANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN TRÊN CÁ TRA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH ĐẶNG THỤY MAI THY 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com i LỜI CẢM TẠ Trong những năm tháng trên giảng đường đại học những kiến thức được tích lũy là hành trang quý báu cho tôi trên con đường phát triển nghề nghiệp tương lai. Vì thế thực hiện luận văn tốt nghiệp chính là sự lựa chọn tốt nhất để tổng hợp kiến thức trong những năm học của rất nhiều sinh viên trong đó có cá nhân tôi. Tuy nhiên để có thể hoàn thành luận văn ngoài phấn đấu bản thân còn được sự ủng hộ từ gia đình và sự tận tâm hướng dẫn của quý thầy cô. Do vậy đầu tiên tôi muốn gửi những lời biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình đã luôn động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong khoảng thời gian học tập. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và cô Đặng Thụy Mai Thy đã tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn cô Bùi Thị Bích Hằng, cô Trần Thị Tuyết Hoa đã quan tâm và động viên trong những thời gian qua. Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Bệnh học thủy sản K31 đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ii TÓM TẮT Sau khi được phục hồi từ nguồn vi khuẩn trong bộ sưu tập 10 chủng 3B3, E3, E8, CAF260, T8, A1, CAF255, STL303, CAF258, E223 được kiểm tra kháng sinh đồ trên 2 loại kháng sinh ampicillin và chloramphenicol. Đồng thời vi khuẩn cũng được dùng cho thí nghiệm MTT. Kết quả thu được ở cả phương pháp kháng sinh đồ và MTT đều cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn nhạy với 2 kháng sinh ngoại trừ chủng CAF258, E223 kháng ampicillin và chủng T8 kháng chloramphenicol. Đề tài cũng tiến hành nghiên cứu thí nghiệm MTT trên mô thận tươi. Kết quả thu được cho thấy sau khi sử dụng chloramphenicol mật độ tế bào tồn tại giảm từ 1-10% so với sử dụng ampicillin. Bên cạnh đó thực hiện thí nghiệm MTT trên mô đã giảm được thời gian (còn 1,5 ngày) và hạ giá thành từ 7-8 lần so với phương pháp kháng sinh đồ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v Chương I: GIỚI THIỆU 1 Chuơng II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2 2.1 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra 2 2.2 Bệnh mủ gan 2 2.2.1 Tác nhân gây bệnh 2 2.2.2 Đường lây truyền 3 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý 3 2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản 3 2.3.1 Định nghĩa 4 2.3.2 Nguyên tắc phối hợp kháng sinh trong điều trị 4 2.3.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh 5 2.3.4 Cơ chế của sự kháng thuốc 7 2.3.5 Những nghiên cứu về kháng sinh trên E.ictaluri 7 2.4 Thí nghiệm MTT 8 2.4.1 Định nghĩa 8 2.4.2 Những điểm đặc trưng của thí nghiệm MTT 10 2.4.3 Các nghiên cứu về thí nghiệm MTT 10 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13 3.2 Nội dung nghiên cứu 13 3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 14 3.3.1 Đối tượng thí nghiệm 14 3.3.2 Vật liệu 14 3.3.3 Thiết bị 14 3.3.4 Hóa chất 15 3.4 Phương pháp nghiên cứu 15 3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 15 3.4.2 Kháng sinh đồ 16 3.4.3 Thí nghiệm MTT 17 3.4.4 Xử lý số liệu 21 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết quả thí nghiệm trên vi khuẩn 22 4.1.1 Kết quả kháng sinh đồ 22 4.1.2 Kết quả thí nghiệm MTT trên vi khuẩn 24 4.1.3 So sánh số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh giữa phương pháp kháng sinh đồ và thí nghiệm MTT 29 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iv 4.1.4 So sánh thời gian xác định tính nhạy của kháng sinh giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 33 4.2 Kết quả thí nghiệm trên mô tươi 34 4.2.1 Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh 34 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 5.1 Kết luận 41 5.1.1 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo kháng sinh đồ 41 5.1.2 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo thí nghiệm MTT 41 5.1.3 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên mô theo thí nghiệm MTT 41 5.2 Đề xuất 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 46 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài 15 Bảng 3.2: Đường kính vòng tròn vô trùng một số thuốc kháng sinh 16 Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí mẫu vi khuẩn vào 7 hàng đầu của đĩa 96 giếng 17 Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí mẫu mô vào đĩa 96 giếng 20 Bảng 4.1: Đường kính trung bình vòng vô trùng của 10 chủng vi khuẩn 22 Bảng 4.2: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh qua phương pháp kháng sinh đồ 23 Bảng 4.3: Sự sai khác của vi khuẩn và vi khuẩn sử dụng kháng sinh qua thí nghiệm MTT 26 Bảng 4.4: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm MTT trên vi khuẩn 27 Bảng 4.5: Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh qua thí nghiệm MTT 36 Bảng 4.6: Số lượng tế bào tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm MTT trên mô 37 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vi DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1: Mẫu vi khuẩn & MTT 25 Hình 4.2: Mẫu vi khuẩn & MTT sau khi ủ 4 giờ 25 Hình 4.3: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10 8 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 29 Hình 4.4: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10 8 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 29 Hình 4.5: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10 7 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 30 Hình 4.6: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10 7 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 30 Hình 4.7: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10 6 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 31 Hình 4.8: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10 6 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 31 Hình 4.9: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10 5 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 32 Hình 4.10: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 10 5 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 32 Hình 4.11: Thời gian xác định tính nhạy cảm kháng sinh trên vi khuẩn giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 33 Hình 4.12: Mẫu mô &MTT 35 Hình 4.13: Mẫu mô & MTT sau khi ủ 4 giờ 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long. Nafiquaved Cục Quản lý chất lượng, An toàn vệ sinh và Thú y thủy sản. MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards. ATCC American Type Culture Collection E.ictaluri Edwardsiella ictaluri. MIC Minimum Inhibitory Concentration. MBC Minimum Bactericidal Concentration. IC50 The half maximal inhibitory concentration. AM Ampicillin. CH Chloramphenicol. CK Cá khỏe. CB Cá bệnh. KS Kháng sinh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1 CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU Trong quá trình hội nhập WTO và đồng thời chịu ảnh hưởng do tình hình kinh tế khó khăn chung của thế giới nhưng xuất khẩu thủy sản Việt Nam vẫn có những bước đi vững chắc và ổn định. Tháng 7-2008, các doanh nghiệp chế biến xuất được trên 136.000 tấn thủy sản các loại, đạt kim ngạch gần 476 triệu USD. Đây là tháng có mức tăng trưởng cao nhất trong 3 năm qua về sản lượng lẫn giá trị, tạo đà cho xuất khẩu thủy sản về đích (www.atpvietnam.com, 18.11.2008). Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), 7 tháng đầu năm 2008 xuất khẩu thủy sản cả nước đạt khoảng 2,388 tỷ USD, tăng 20% so cùng kỳ năm ngoái, trong đó, sản phẩm cá tra- ba sa chiếm 31,9%. Riêng tháng 7- 2008, kim ngạch xuất khẩu cá tra, ba sa vào Nga tăng đến 64 lần so với tháng 7-2007. Song song với sự phát triển của nghề nuôi thì vấn đề dịch bệnh ngày càng trở nên trầm trọng, trong đó tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khá cao khoảng 61% (Trần Anh Dũng, 2005) và có xu hướng ngày càng tăng. Thiệt hại do bệnh rất lớn, tỷ lệ cá chết có thể lên đến 90% trên cá tra giống và 50% trên cá nuôi thương phẩm (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007) Khi bệnh xảy ra, người dân thường sử dụng sản phẩm thuốc thú y- thủy sản chứa kháng sinh hoặc kháng sinh nguyên liệu để điều trị cho cá. Việc sử dụng kháng sinh bừa bãi, không đúng liều lượng, đôi khi sử dụng với liều lượng thấp để phòng bệnh dẫn đến dịch bệnh ngày càng diễn biến phức tạp, khó điều trị hơn, tỷ lệ sống của cá ngày càng thấp (Nguyễn Chính, 2005). Một phương pháp được sử dụng khá phổ biến hiện nay để xác định các loại kháng sinh và liều lượng thích hợp trong việc điều trị bệnh mủ gan trên cá tra là phương pháp lập kháng sinh đồ. Tuy nhiên phương pháp lập kháng sinh đồ truyền thống đòi hỏi nhiều thời gian để phân lập, nuôi cấy. Vì vậy đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra” nhằm đánh giá độ tin cậy của biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra. Nhờ vào đó đề xuất việc sử dụng thuốc kháng sinh phù hợp, góp phần tăng năng suất và sản lượng, hướng đến nghề nuôi cá tra thâm canh bền vững. Nội dung: Dùng MTT để ước lượng mật độ vi khuẩn có trong dịch mô bệnh phẩm và dịch huyền phù từ khuẩn lạc. Kiểm tra tính nhạy của vi khuẩn trong 2 biện pháp trên với một số loại kháng sinh . PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com [...]... tượng kháng thuốc có nguy cơ xảy ra ở hầu hết các loại kháng sinh đã dùng trong nuôi trồng thủy sản Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh là khả năng mà một sinh vật có thể chịu được tác động của các loại kháng sinh Các gen kháng thuốc thường có sẵn trong các loài vi sinh vật tạo ra kháng sinh nhằm bảo vệ chúng khỏi tác động của thuốc kháng sinh này (Ricki, 1995) 2.3.5 Những nghiên cứu về kháng sinh trên. .. http://www.fineprint.com Trên mô thận tươi: - Tổng số mẫu cá phân tích: 32 mẫu cá bệnh + 4 mẫu cá khỏe - Giải phẫu cá bệnh mủ gan, quan sát dấu hiệu bệnh lý ở thận, gan và tỳ tạng Phân lập mẫu vi khuẩn ở thận cá bệnh trên môi trường TSA/NA - Cho 0.1g mẫu thận cá bệnh (cắt lát mỏng) + 1 ml nước muối sinh lý tiệt trùng vào ống efpendorf Dung dịch mẫu mô được dùng cho thí nghiệm - Cho 500 µl dung dịch kháng sinh vào... biệt bệnh xuất hiện không phụ thuộc vào mùa vụ thả giống hay lứa tuổi cá Theo Crumlish và ctv (2004) qua phân lập từ 181 mẫu cá tra bệnh thu được 108 dòng vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) Càng nghiêm trọng hơn theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) trong 55 mẫu cá tra bệnh phân lập được 97 chủng vi khuẩn thì đã có 47 chủng vi khuẩn gây bệnh mủ gan 2.2 Bênh mủ gan. .. II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra Phong trào nuôi cá tra tại Việt Nam ngày càng được nhân rộng để phục vụ cho nhu cầu tiêu thụ trong nước và đặc biệt là xuất khẩu Từ năm 1996-2006, diện tích nuôi cá tra, basa tăng gấp 7 lần; sản lượng tăng 36,2 lần Tổng diện tích nuôi cá tra, cá ba sa trong toàn khu vực ĐBSCL hiện đã lên đến 5.000 ha Năm 2001 tổng sản lượng cá tra, cá ba sa... nồng độ gây độc của các sản phẩm ngoại bào trên các vi sinh vật gây bệnh cho cá Vì thế kết quả thu được chính xác hơn so với phương pháp đếm truyền thống với trypan blue Ngoài những ưu điểm trên theo Caviedes (2002) sử dụng MTT để xác định sự mẫn cảm của kháng sinh còn giảm được giá thành trong quá trình tiến hành thí nghiệm; tác giả cho rằng kiểm tra khả năng đề kháng kháng sinh của mỗi chủng Mycobacterium... Thực hiện kháng sinh đồ 10 chủng vi khuẩn Bảng 3.1 (so sánh mật độ vi khuẩn với ống McFarland 1, mật độ vi khuẩn khoảng 3x108 cfu/ml) - Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩn trong dịch huyền phù từ khuẩn lạc - Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩntrong dịch mô bệnh phẩm (cá bệnh) - So sánh hiệu quả sử dụng kháng sinh giữa phương pháp kháng sinh đồ và thí nghiệm MTT trên vi khuẩn và mô tươi (cá bệnh) 3.3... 2004) 2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản Khi bệnh xảy ra trong ao, nông dân thường sử dụng các sản phẩm thuốc thú ythủy sản chứa kháng sinh hoặc kháng sinh nguyên liệu để điều trị cho cá Tuy nhiên theo Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) việc sử dụng kháng sinh còn tùy tiện, không đúng về liều lượng và liệu trình điều trị Nông dân thường dùng kháng sinh liều thấp để phòng bệnh cho cá Vì vậy hiệu... Thanh Phương và ctv (2005), 13 chủng E ictaluri phân lập trên cá tra tại ĐBSCL đều kháng với oxytetracylin, oxolinic acid và sulphonamid Vẫn trên đối tượng E ictaluri theo Cao Tuấn Anh và ctv (2006) kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 17 loại kháng sinh trên 8 chủng vi khuẩn thì tất cả đều nhạy với doxycilin, ofloxacin và kháng với 15 loại kháng sinh còn lại norfloxacin, oxolonic acid, pefloxacin, colistin,... sử dụng Alamar Blue, nhưng với MTT giá thành giảm còn 5,04$ Ứng dụng những thành công trong các nghiên cứu trước đây về thí nghiệm MTT, Schrader (2006) cũng đã tiến hành thí nghiệm trên đĩa 96 giếng, tìm hiểu về khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá da trơn và Flavobacterium columnare Tác giả nhận xét rằng trước đây các lọai thức ăn thủy sản thường được tẩm các kháng. .. • Do ức chế sinh tổng hợp protein, acid nucleic và chuyển hóa nội bào của vi khuẩn • Do vi khuẩn mất cơ chế tự bảo vệ • Các thuốc có tác dụng kìm khuẩn: Chloramphenicol, tetracycline, erythromycin, sulfonamid b Sử dụng kháng sinh đúng nguyên tắc hay tuân theo các chỉ định khi phối hợp kháng sinh: • Các thuốc ức chế và tiêu diệt vi khuẩn có thể có tác dụng đối kháng, tác dụng cộng hay tác dụng độc lập . cứu khả năng ứng dụng biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra nhằm đánh giá độ tin cậy của biện pháp kiểm tra. ĐAN THANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN TRÊN CÁ TRA LUẬN VĂN