TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHẠM THỊ NGỌC XUÂN XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH MỦ GAN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN Năm 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHẠM THỊ NGỌC XUÂN XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH MỦ GAN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGUYỄN THỊ THU HẰNG ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Năm 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Hôm nay, để hồn thành luận văn này, tơi phải trải qua trình dài học tập rèn luyện trường Tuy nhiên gia đình nhân tố quan trọng giúp tơi hồn thành việc Bên cạnh đó, thầy bạn bè góp phần khơng nhỏ thành cơng tơi Vì hơm tơi xin gửi lịng biết ơn đến: - Ba Mẹ tồn thể gia đình tơi-những người ln bên tơi, động viên chăm sóc tơi từ vật chất đến tinh thần, giúp tơi có đủ sức mạnh vượt qua tất cả! - Lòng biết ơn sâu sắc xin gửi đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng Đặng Thị Hồng Oanh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành tốt luận văn này! - Xin gửi lòng biết ơn chân thành đến cô Trần Thị Tuyết Hoa, cô Đặng Thụy Mai Thy Bùi Thị Bích Hằng quan tâm, động viên suốt thời gian làm cố vấn học tập! - Xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Hà Giang, anh Lê Hữu Thôi tất thầy cô anh chị khoa Thủy Sản động viên giúp đỡ suốt q trình thực đề tài! - Lịng chân thành biết ơn xin gửi đến cô anh chị địa phương nhiệt tình giúp tơi q trình thu m ẫu! - Lịng tri ân xin gửi đến tất Thầy Cô dạy dỗ suốt thời gian theo học trường tiểu học Trương Định, trường trung học sở cấp II Thanh Đức A, trường trung học phổ thông Lưu Văn Liệttỉnh Vĩnh Long trường Đại học Cần Thơ! - Đồng thời, xin gửi lòng biết ơn đến tập thể bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản khoá 31 tất người bạn bên cạnh với chia sẻ, lời động viên lời khuyên chân thành! Và lần xin gửi đến tất người thân yêu, thầy cô, bạn bè…những người góp phần mang đến cho tơi thành cơng hương vị sống lời cảm ơn chân thành nhất!!! Tác giả Xin chân thành cảm ơn!!! i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Với mục tiêu nghiên cứu đề tài tìm hiểu mức độ xuất tính kháng thuốc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra bệnh mủ gan nuôi thâm canh số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Kết cho thấy vi khuẩn E ictaluri xuất hầu hết vùng nuôi Kết phân lập từ mẫu cá xác định 84 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Edwardsiella Qua kiểm tra tiêu nhuộm gram, tính di động, oxydase, catalase chọn 10 chủng để tiến hành định danh theo phương pháp truyền thống kit API 20E 10 chủng E ictaluri Tuy nhiên kết kiểm tra API lại sai khác số tiêu (citrate, indole) Kết chạy PCR lần khẳng định 10 chủng vi khuẩn E ictaluri tất vạch sáng 407 bp Kháng sinh đồ thực 10 chủng vi khuẩn E ictaluri với loại thuốc kháng sinh Kết 100% vi khuẩn kháng hoàn toàn với S (streptomycin) OA (oxolinic acid), 100% vi khuẩn kháng với FFC (florfenicol), vi khuẩn nhạy với AMX (amoxycillin) Riêng với DO (doxycycline) có 80% số chủng nhạy, 10% số chủng trung bình nhạy 10% số chủng kháng Nhìn chung tất 10 chủng có chủng CA4.4G đa kháng với S, OA, FFC DO Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) kháng sinh streptomycin chủng vi khuẩn phân lập trên, kết cho thấy vi khuẩn E ictaluri kháng với streptomycin mức thấp (2-4 µg/ml) ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC PHẦN I: GIỚI THIỆU PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi cá tra 2.2 Bệnh vi khuẩn cá 2.3 Bệnh vi khuẩn E ictaluri 2.3.1 Tình hình bệnh vi khuẩn E ictaluri giới 2.3.2 Tình hình bệnh vi khuẩn E ictaluri Việt Nam .5 2.3.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa vi khuẩn E ictaluri 2.3.4 Một số quan thường bị E ictaluri công .6 2.4 Một số nghiên cứu khác vi khuẩn E ictaluri 2.5 Tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản 2.6 Phương pháp PCR 2.6.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 2.6.2 Ưu nhược điểm phương pháp PCR 10 2.7 Các nghiên cứu nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 10 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 12 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 12 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 12 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 12 3.2 Vật liệu nghiên cứu 12 3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm 12 3.2.2 Hóa chất môi trường 12 3.2.2.1 Hóa chất 12 3.2.2.2 Môi trường 12 3.3 Phương pháp nghiên cứu 13 3.3.1 Phương pháp thu mẫu 13 3.3.2 Phương pháp lấy mẫu vi sinh 13 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 3.3.3 Tách ròng mẻ cấy 14 3.3.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống 14 3.3.5 Định danh vi khuẩn Kit API 20E 14 3.3.6 Phương pháp PCR 14 3.3.7 Phương pháp lập kháng sinh đồ 16 3.3.8 Phương pháp xác định MIC 16 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 17 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 4.1 Kết phân lập định danh vi khuẩn 18 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn 18 4.1.2 Kết định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống 18 4.1.3 Kết định danh vi khuẩn Kit API 20E 20 4.2 Kết định danh vi khuẩn phương pháp PCR 22 4.3 Kết kháng sinh đồ 23 4.4 Kết MIC 25 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 27 5.1 Kết luận 27 5.2 Đề xuất 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 PHỤ LỤC 33 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình phát vi khuẩn E ictaluri 15 Bảng 3.2: Giới hạn xác định mức độ kháng, trung bình nhạy nhạy loại kháng sinh theo đường kính chuẩn trung bình cơng ty Bio-rad 16 Bảng 4.1 Các tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa vi khuẩn E ictaluri phương pháp truyền thống 19 Bảng 4.2 Kết phân tích tiêu hình thái, sinh lý sinh hố chủng vi khuẩn Kit API 20E 21 Bảng 4.3 Hàm lượng DNA chiết tách 22 Bảng 4.4 Kết kháng sinh đồ chủng vi khuẩn E ictaluri 24 Bảng 4.5 Giá trị MIC thuốc kháng sinh streptomycin chủng vi khuẩn E ictaluri 25 Bảng 3.3 Bảng kiểm tra kết test O/F 34 Bảng 3.4 Các tiêu định danh E ictaluri phương pháp sinh hóa truyền thống 37 Bảng 3.5 Cách đọc kết Kit API 20E 39 Bảng 4.5 Dấu hiệu bên bên mẫu cá 40 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Đĩa cấy (A), Vi khuẩn E ictaluri Gram âm, hình que ngắn (B) 18 Hình 4.2 Khả sử dụng loại đường (A), Các tiêu sinh hóa thuyền thống (B) 19 Hình 4.3 Kết kiểm tra vi khuẩn E ictaluri Kit API 20E 20 Hình 4.4 Kết chạy PCR phát E ictaluri 23 Hình 4.5 Kết kháng sinh đồ vi khuẩn E ictaluri 24 Hình 4.6 Kết MIC vi khuẩn E ictaluri 25 vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN I GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long vùng kinh tế trọng điểm nằm phía Nam đất nước, có diện tích gần triệu ha, chiếm khoảng 12% tổng diện tích nước Đây vùng hạ lưu châu thổ sông Mekong, xem vùng trù phú nhất, không Việt Nam mà khu vực Đông Nam Á Đồng thời vùng nuôi trồng thủy sản lớn nước, diện tích ni trồng thủy sản chiếm khoảng 60% với sản lượng chiếm khoảng 65% giá trị xuất thủy sản chiếm 51% (Dương Nhựt Long, 2003) Mười tháng đầu năm 2008, xuất thủy sản nước đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3.828 tỷ USD, tăng 39,4% lượng 24,4% giá trị so với kỳ năm 2007 Trong mặt hàng chủ lực cá tra cá basa đạt mức tăng trưởng cao (http://www.fistenet.gov.vn/) Để đạt kết đòi hỏi gia tăng số lượng lẫn chất lượng sản phẩm diện tích mật độ nuôi ngày nâng cao, kết năm gần đây, tình hình bệnh xuất động vật thủy sản ngày nhiều đến mức báo động Một số bệnh quan tâm hàng đầu bệnh mủ gan gây thiệt hại không nhỏ kinh tế cho nhiều hộ nuôi Ngày bệnh mủ gan mối quan tâm hàng đầu cho nuôi cá tra thâm canh khu vực ĐBSCL Theo Hawke (1981), Từ Thanh Dung (2004) cho vi khuẩn E ictaluri thuộc họ Enterobacteriaceae, vi khuẩn Gram âm, hình que, phản ứng âm tính với oxidase dương tính với catalase, khơng có khả sinh H2S Indole Trên môi trường TSA 28oC sau 48 vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc nhỏ, trịn, màu trắng, có rìa khơng đồng Nhiều nghiên cứu trước xác định tác nhân gây bệnh mủ gan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, bệnh thường xảy cá tra nuôi thâm canh tất giai đoạn, tỉ lệ hao hụt từ 10% cao lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh ctv, 2003; Crumlish, 2001; Từ Thanh Dung, 2004; Shotts et al., 1986) Cùng với xuất vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan nhiều nghiên cứu kháng sinh phòng trị bệnh Edwardsiella ictaluri tiến hành để góp phần khắc phục tình hình dịch bệnh vi khuẩn gây cá tra Theo nghiên cứu Từ Thanh Dung ctv (2005) nghiên cứu cho bệnh khống chế nhóm kháng sinh quinolon (flumequin, oxolinic acid, enrofloxacin) ngày nhóm kháng sinh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com bị cấm sử dụng Mặc khác, theo kết điều tra Nguyễn Quốc Thịnh (2006) đa số người dân nuôi cá thường sử dụng kháng sinh để phịng trị bệnh Tuy nhiên, phận khơng nhỏ người nuôi chưa nắm bắt tốt kỹ thuật nuôi việc quản lý sức khỏe động vật thủy sản ao nuôi hiểu biết thuốc kháng sinh nhiều hạn chế, liều lượng thời gian sử dụng không phù hợp dẫn đến gia tăng tượng kháng thuốc kháng sinh số giống lồi vi khuẩn nên việc phịng trị hiệu gây nhiều tổn thất to lớn kinh tế ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường sinh thái sức khỏe người Vì vậy, đề tài “Xác định đặc điểm sinh hoá khả kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh mủ gan Edwardsiella ictaluri cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long” thực nhằm đánh giá tình hình bệnh mủ gan số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long kháng thuốc chủng vi khuẩn để có biện pháp hợp lý q trình ni quản lý dịch bệnh khu vực góp phần bảo vệ môi trường sinh thái Mục tiêu đề tài: Tìm hiểu mức độ xuất tính kháng thuốc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra bệnh mủ gan Nội dung nghiên cứu đề tài: Phân lập vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan cá tra Định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phương pháp truyền thống phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Lập kháng sinh đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) vi khuẩn Edwardsiella ictaluri với số loại thuốc kháng sinh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 11 Dương Nhựt Long, 2003 Giáo trình Kỹ Thuật Ni Thủy Sản Nước Ngọt-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 12 FAO, 2005 Hướng dẫn chẩn đoán bệnh động vật thủy sản Châu Á Nhà xuất Nông Nghiệp, 247 trang 13 Ferguson, H.W., J.F Turnbull, A Shinn, K Thomson, T.T Dung and M Crumlish, 2001 Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong delta, Vietnam Journal of fish disease 2001, 24, page 509-513 14 Francis-Floyd, R., Beleau, M H., Waterstrat, P R and Bowser, P.R., 1987 Effect of water temperature on the clinical outcome of infection with Edwardsiella ictaluri in channel catfish J.Am Vet Med Ass 191: 1413-1416 15 Frerichs R.M and R.F Millar, 1993 Mannual for the isolate and indentification of fish bacterial pathogent Institure of aquaculture, University of Sterling, Scotland 107pp 16 GESAMP 2001 Planning and Management for Sustainable Coastal Aquaculture Development 17 Hawe, J.P (1979) A bacterial associated with disease of pond culture channel catfish Journal of the Fisheries research Board of Canada, 36, 1508-1512 18 Hawke J.P., A.C McWhorter, A.G Steigerwalt and D.J Brenner, 1981 Edwardsiella ictaluri sp Nov., the causative agent of enteric septicemia of catfish International Journal of Systematic Bacteriology, 31: 396-400 19 Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo Dục, 304 trang 20 Ho, S.P., T.Y.Hsu, M.H.Chen and W.S.Wang, 2000 Antibacterial effect of chloramphenicol, thiamfenicol and flofenicol against aquatic animal bacteria J Vet Med Sci.62:479 – 485 21 Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008 Tiêu chuẩn hoá phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc kháng sinh lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila khoa Thủy Sản Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ, 38 trang 22 Inglis, V., R.J Roberts and Niall R Bromage, 1994 Enteric septicaemia of catfish Bacterial Diseases of Fish, page 67-79 312pp 29 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 23 Kasornchandra, J., Rogers W.A and Plumb, J.A (1987) Edwardsiella ictaluri from walking catfish Clarias batrachus L., in Thailand Journal of Fish Disease 10, 137-138 24 Kent, M L., Lyons, J M (1982) Edwardsiella ictaluri in the green knife fish, Egemannia virescens Fish Health News 2:2 25 Khuất Hữu Thanh, 2006 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, 270 trang 26 Lê Minh Đương, 2007 So sánh khả xâm nhập hai dòng vi khuẩn E ictaluri cá tra (Pangasius hypophthalmus) Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ, 63 trang 27 Lê Thị Bé Năm, 2002 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus, Sauvage 1878) Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Trường Đại học Cần Thơ, 38 trang 28 Lê Thị Kim Liên Nguyễn Quốc Thịnh, 2006 Giáo trình thuốc hóa chất nuôi trồng Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 29 Lê Xuân Sinh ctv, 2006 Đánh giá tiếp nhận ảnh hưởng thông tin liên quan đến việc quản lý sức khoẻ cá tra (pangasius hypophthalmus) nuôi An Giang Dự án DFID Trang 15-17 30 Lê Xuân Sinh Nguyễn Thị Phương Nga, 2005 Những nhận xét liên quan tới việc cung cấp sử dụng hố chất thuốc cho ni trồng thủy sản Đồng Bằng Sông Cửu Long Báo cáo hội nghị khoa học ni trồng thủy sản tồn quốc Vũng Tàu 22-24/12/2005 31 Lương Trần Thục Đoan, 2006 Khảo sát xâm nhập vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) quan khác cá tra (Pangasius hypophthalmus) Luận văn Đại học-Khoa Thủy SảnTrường Đại học Cần Thơ, 47 trang 32 Mygolomba, T.N and J.A Plumb, 1992 Longevity of E ictaluri in the organs of experimentally infected channel catfish, Ictalurus puntatus Aquaculture 100: 1-6 33 Nguyễn Phú Son ctv, 2003 Nghiên cứu thị trường cá tra, cá basa Đồng Bằng Sông Cửu Long Dự án nghiên cứu hợp tác Đại học Stirling – Scotland Đại học Cần Thơ 30 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 34 Nguyễn Quốc Thịnh, 2002 Bước đầu nghiên cứu mô bệnh học đốm trắng nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) Luận văn Đại học-Khoa Nông Nghiệp-Đại học Cần Thơ 35 Nguyễn Quốc Thịnh, 2006 Điều tra đánh giá ảnh hưởng việc sử dụng thuốc hóa chất trình ni cá tra bè Khoa Thuỷ SảnĐại học Cần Thơ 36 Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008 Điều tra trạng ni, bệnh tình hình sử dụng thuốc-hóa chất nuôi thâm canh cá tra ao (Pangasianodon hypophthalmus) Luận văn Đại học-Khoa Thủy SảnĐại học Cần Thơ, 84 trang 37 Nguyễn Thanh Phương, Phạm Minh Đức, Vũ Nam Sơn Trần Văn Bùi, 2004 Báo cáo tổng quan ứng dụng công nghệ nhằm nâng cao chất lượng hạ giá thành sản phẩm thủy sản (Tôm xanh, Cá tra, Cá basa Cá rô phi) tỉnh An Giang Sở khoa học & Công nghệ Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 38 Nguyễn Thị Tiên, 2007 Xác định đặc điểm sinh hóa khả kháng thuốc mầm bệnh vi khuẩn phân lập tôm sú (Penaeus monodon) bệnh phân trắng Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ, 48 trang 39 Nguyễn Trúc Phương, 2008 Tìm hiểu khác tiêu sinh lý sinh hóa dịng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri xác định phương pháp sinh hóa truyền thống API 20E Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ, 42 trang 40 Nguyễn Văn Kiểm, 2004 Giáo trình kỹ thuật sản xuất cá giống-Khoa Thủy Sản-Trường Đại học Cần Thơ 41 Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004 Nghiên cứu số ảnh hưởng bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra (Pangasius hypophthalmus) ĐBSCL Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Trường Đại học Cần Thơ, 47 trang 42 Plumb, J.A and Sanchez, D.J, 1983 Susceptibility of five species of fish to Edwardsiella ictaluri Journal of Fish Disease 6, 261-266 43 Plumb, J.A., 1999 Edwardsiella Septicaemias Fish diseases and disorders, Volume 3: Viral, Bacterial and Fungal infections 44 Reger P.J., D.F Mockler, and M.A Miller 1993 Comparison of antimicrobial susceptibility beta-lactamase production, plasmid analysis 31 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com and serum bactericidal activity in Edwardsiella tarda, E ictaluri and E hoshinae J Med Microbitol 39: 273-281 45 Shotts, E.B and Waltman W D.,, 1986 Antimicrobial susceptibility of Edwardsiella ictaluri, Journal of U’ildife Disrasrs 21 (21.1986), pp173-177 46 Stock, I., and Bernd Wiedemann, 2001 Natural Antibiotic susceptibilities of Edwardsiella tarda, E ictaluri and E hoshinac Antibiomicrobial Agenrs and chemotherapy, Aug, 2001, P.2245-2255 47 Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chun mơn bệnh học thủy sản, 2008 Bộ môn sinh học bệnh thủy sản-Khoa Thủy Sản-Trường Đại học Cần Thơ, 52 trang 48 Trần Linh Phước, 2003 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm Nhà Xuất Bản Giáo Dục 49 Trần Thị Hồng Tơ, 2004 Khảo sát số giống vi khuẩn mơ hình ni thủy sản thành phố Cần Thơ tính nhạy cảm chúng với kháng sinh Luận văn Đại học-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ, 20 trang 50 Trương Quốc Phú, 2004 Bài giảng quản lý chất lượng nước ao nuôi thủy sản Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ 51 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh Trần Thị Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình bệnh học Thủy Sản-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 52 Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh Đặng Thụy Mai Thy, 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 137-142 53 Từ Thanh Dung, Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006 Bài giảng thực hành bệnh vi khuẩn động vật thủy sản-Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 32 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Phụ lục 1: thành phần hóa chất tiêu thực phản ứng sinh lý, sinh hóa truyền thống v Nhuộm Gram Cho giọt nước muối sinh lý lên lame Dùng que cấy triệt trùng lấy khuẩn lạc trãi lên lame Để lame khô tự nhiên Hơ lướt lame lên đèn cồn để cố định vi khuẩn, để nguội Nhuộm Crystal violet (dung dịch 1) khoảng phút, rửa lame nước Nhuộm iodine (dung dịch 2) phút, rửa lame nước Rửa lame dung dịch alcohol/acetone (dung dịch 3) từ 2-3 giây Rửa lame lại nước Nhuộm safranin (dung dịch 4) khoảng phút, rửa lại nước để khô Quan sát lame kính hiển vi quang học (40X 100X) Vi khuẩn Gram (+): màu xanh / tím Vi khuẩn Gram (-): màu hồng v Tính di động Cho Vaseline lên góc lamelle đặt ngữa lamelle lên bàn Dùng pipet tiệt trùng nhỏ giọt nước cất (hoặc nước muối sinh lý) lên lamelle Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc hịa tan vào giọt nước muối lamelle Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước chứa vi khuẩn Cẩn thận lật nhanh lame để giọt nước treo ngược lamelle Đặt lame lên kính hiển vi, quan sát tính di động vi khuẩn vật kính 40X v Phản ứng Oxidase Chạm nhẹ que thử oxidase vào khuẩn lạc đĩa agar dùng que cấy nhặt khuẩn lạc cho tiếp xúc que thử oxidase Quan sát que thử 30 giây quan sát thay đổi màu sắc: que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng oxidase dương tính (+) khơng chuyển màu âm tính (-) 33 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v Phản ứng Catalase Nhỏ giọt dung dịch H2O2 3% lên lame Dùng que cấy triệt trùng lấy vi khuẩn cho vào dung dịch H2O2 3% Phản ứng Catalase dương tính có tượng sủi bọt ngược lại catalase âm tính khơng sủi bọt v Khả lên men oxy hóa đường glucose (O/F test) Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường O/F tiệt trùng Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn đĩa agar cấy thẳng vào ống nghiệm chứa mơi trường O/F, sau phủ 0,5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào ống nghiệm tạo điều kiện yếm khí ống nghiệm (F), ống cịn lại kiểm tra tính hiếu khí vi khuẩn (O) Để ống nghiệm vào tủ ấm 28oC Đọc kết sau 1-7 ngày Lên men (F) ống có phủ dầu paraffin chuyển màu vàng Oxy hóa (O) ống khơng có phủ dầu paraffin chuyển sang màu vàng Không phản ứng ống nghiệm màu xanh Bảng 3.3: Bảng kiểm tra kết test O/F Ống tiếp xúc khơng khí Ống phủ dầu paraffin Kết Xanh Không phản ứng với glucose Xanh lơ phần Xanh Phản ứng kiềm tính Vàng Xanh Phản ứng oxy hóa Vàng v Xanh Vàng Phản ứng lên men Khả sinh H2S Các bước thực hiện: Môi trường TSI (60g/1000ml nước cất) Đun khuấy cho tan hoàn toàn Tiệt trùng 121oC 15 phút Để nguội 45oC Cho khoảng 5ml môi trường vào ống nghiệm Để nghiêng ống nghiệm tạo mặt phẳng nghiêng Cấy vi khuẩn bề mặt nghiêng mặt đứng ống nghiệm Ủ 28oC Đọc kết sau 14-28 Vi khuẩn lên men đường Glucose cho màu đỏ phần thạch nghiêng 34 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com màu vàng phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Glucose Lactose Sucrose cho màu vàng phần thạch nghiêng màu vàng phần thạch đứng (A(acid)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Lactose Sucrose cho màu vàng phần thạch nghiêng màu đỏ phần thạch đứng (A (acid)/K (alkaline)) Vi khuẩn không lên men đường Glucose, không lên men đường Lactose Sucrose cho màu đỏ phần thạch nghiêng màu đỏ phần thạch đứng (K (alkaline)/K (alkaline)) Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen ống nghiệm v Khả sinh indole Các bước thực hiện: Cho khoảng 3ml môi trường Nutrient broth vào ống nghiệm Thanh trùng 121oC 15 phút Để nguội Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Để tủ ấm 28oC Sau 48 nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm Kết quả: Vi khuẩn sinh Indole cho phản ứng (+) với vòng màu hồng đến đỏ sậm bề mặt môi trường ngược lại v Phản ứng Decarboxylase Môi trường Decarboxylase Thêm 1% amino acid (Arginine, Lysine, Ornithine) cho phản ứng Mơi trường làm đối chứng khơng có amino acid Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 121oC 15 phút Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Sau phủ lên ống 0,5 ml paraffin tiệt trùng Để tủ ấm 28oC Đọc kết từ 1-4 ngày Phản ứng dương tính ống nghiệm có amino acid chuyển màu khác với màu ống đối chứng ngược lại v Phản ứng Voges-Proskauer (VP) Môi trường MR-VP broth Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 121oC 15 phút Để nguội Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ nhiệt độ 28oC Sau 48 nhỏ 0,6 ml dung dịch thuốc thử A 0,2 ml dung dịch thuốc thử B vào ống nghiệm Lắc để ống nghiệm 30 phút 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Đọc kết quả: phản ứng dương tính có màu hồng mơi trường xuất hiện, ngược lại Thuốc thử: A: Hòa tan 5g alpha naphthol 100 ml ethyl alcohol B: Hòa tan 40g KOH 100 ml nước cất v Khả sử dụng Citrate Môi trường Simmon’s Citrate agar Đun sôi khuấy cho tan Cho 5ml môi trường vào ống nghiệm trùng 121oC 15 phút Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng ống nghiệm để nguội Cấy vi khuẩn mặt nghiêng ống nghiệm, ủ tủ ấm 28oC Đọc kết sau 2-7 ngày Vi khuẩn sử dụng citrate tạo màu xanh lơ môi trường Simmon’s citrate agar ngược lại v Khả sử dụng Ure Môi trường 0,1% Pepton + 0,2% KH 2PO4 + 0,0012% Phenol red + 0,1% Glucose, thêm 2% Urea cho phản ứng Mơi trường đối chứng khơng có urea Cho ml môi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 121oC 15 phút Cấy vi khuẩn vào hai ống nghiệm Để tủ ấm 28oC Đọc kết vòng ngày Phản ứng dương tính ống nghiệm có urea chuyển sang màu hồng v Khả sử dụng loại đường Môi trường: Các dung dịch đường Glucose, Sucrose, Sorbitol, Inositol, Arabinose, Rhamnose, Trehalose Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ tủ ấm 28oC Sau 48 đọc kết Phản ứng dương tính ống nghiệm chuyển sang màu vàng ngược lại 36 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Bảng 3.4: Các tiêu định danh E ictaluri phương pháp sinh hóa truyền thống STT Chỉ tiêu test Nhuộm Gram Hình dạng Oxidase Catalase Khả lên men Tính di động Arginine Lysin Ornithine 10 Khả sử dụng nitrate 11 Khả sử dụng citrate 12 Khả sinh H2S 13 Khả sinh urea 14 Khả sinh indole 15 Phản ứng VP Khả sử dụng loại đuờng 16 Arabinose 17 Glucose 18 Innositol 19 Mannitol 20 Rhamnose 21 Sorbitol 22 Sucrose 37 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phụ lục Các bước chuẩn bị thực kiểm tra API 20E Xác định tiêu Các bước chuẩn bị - Cho nước cất nước máy vào khay nhựa kít để giữ ẩm q trình ủ tủ ấm - Đặt kít API vào khay nhựa - Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho vào ml nước muối sinh lý nước cất tiệt trùng, lắc trộn Các bước thực - Dùng pipet tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào ô CIT, VP GEL - Tương tự cho vi khuẩn vào đầy phần tuýp ô ADH, LDC, ODC, H2S URE Tiếp theo cho dầu paraffin tiệt trùng vào phần lõm ô - Đậy nắp khay ủ tủ ấm 28oC đọc kết sau 48 Đọc kết + Các tiêu cần sử dụng thuốc thử - TDA: nhỏ giọt thuốc thử TDA vào ô TDA, đọc kết sau vài giây Nếu có màu nâu đỏ nhạt xuất cho phản ứng dương tính (+), màu vàng cho phản ứng âm (-) - IND: cho giọt thuốc thử IND vào ô IND, đọc kết sau vài giây Nếu có màu hồng xuất cho phản ứng dương tính (+), màu vàng màu xanh nhạt xuất cho phản ứng âm tính (-) - VP: nhỏ giọt thuốc thử VP1 sau cho giọt VP2 vào VP, đọc kết sau 10-15 phút Màu hồng màu đỏ xuất cho phản ứng dương tính (+), khơng có màu xuất cho phản ứng âm tính (-) + Các tiêu cịn lại khơng cần sử dụng thuốc thử, kết đọc dựa vào bảng tiêu • Sau cho thuốc thử vào ô TDA, IND VP đậy nắp khay nhựa lại • Khi cho thuốc thử vào tiêu không nên đem ủ trở lại tủ ấm 38 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Bảng 3.5: Cách đọc kết kít API STT Chỉ tiêu ONPG ADH LDC ODC Thành phần Ortho-notrophenyl galactoxydase Arginine Lysine Ornithine CIT Sodium citrate H2S Sodium thiosulphate URE TDA Urea L-Tryptophane IND L-Tryptophane 10 VP Sodium Pyruvate 11 GEL Gelatin 12 GLU D-glucose 13 MAN D-mannitol 14 INO Innositol 15 SOR D-sorbitol 16 RHA L-rhamnose 17 SAC D-sucrose 18 MEL D-melibiose 19 AMY Amygdalin 20 ARA L-arabinose Âm tính Khơng màu Vàng Vàng Vàng Xanh nhạt/ vàng Không màu/ xám nhạt Vàng Vàng Xanh nhạt/ vàng Không màu Không xuất màu đen Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh 39 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Dương tính Vàng Đỏ/ cam Đỏ/ cam Đỏ/ cam Xanh cây/ xanh biển Đen Đỏ/ cam Nâu đỏ nhạt Hồng Hồng/ đỏ Khuếch tán màu đen Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Phụ lục Bảng 4.6 Dấu hiệu bên bên mẫu cá ST T KH mẫu Dấu hiệu bên MX2.1 Xuất huyết vi, da thân, nắp mang MX2.2 Xuất huyết vi, da thân, nắp mang MX2.3 MX2.4 MX2.5 MX2.6 MX3.1 Xuất huyết vi, da bụng MX3.2 Xuất huyết vi MX3.3 Xuất huyết vi bụng 10 MX3.4 11 MX3.5 12 MX3.6 Xuất huyết vi, da bụng Xuất huyết vi, miệng Xuất huyết vi 13 MX4.1 Bình thường 14 MX4.2 Bình thường 15 MX4.3 16 MX4.4 17 MX4.5 18 MX4.6 19 MX5.1 20 MX5.2 Xuất huyết vi Xuất huyết vi bụng, đuôi Xuất huyết vi ngực, da bụng Xuất huyết vi 21 MX5.3 Xuất huyết vi 22 MX5.4 Xuất huyết vi, da bụng Xuất huyết bụng, vùng mắt Xuất huyết vi, hậu môn, da bụng Xuất huyết vi bụng, hậu mơn Bình thường Xuất huyết vi ngực, vi bụng Bình thường Dấu hiệu bên Thận tỳ tạng có đốm trắng Gan, thận tỳ tạng có đốm trắng Gan nhạt màu Gan, thận, tỳ tạng có đốm trắng Thận, tỳ tạng có đốm Gan tái nhạt Chất dịch thể Cơ quan phân lập G T TT x x Dịch x x x x x Bình thường Bình thường Thận, tỳ tạng có đốm trắng Thận bị nhủn G-T-TT có đốm trắng G-TT có đốm Thận nhủn Gan nhạt màu G-TT có đốm trắng Thận nhủn Dịch Dịch Dịch x x Dịch x x Bình thường Bình thường Gan trắng nhạt Bóng sưng TT có đốm trắng Gan trắng nhạt Bóng sưng Dịch Dịch Gan trắng nhạt Gan trắng nhạt Dịch Bình thường Bóng sưng Thận nhủn TT có đốm G-T-TT có đốm G-TT có đốm Thận nhủn Bóng trương to Gan trắng nhạt TT có đốm x Dịch vàng 40 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com x x x x x 23 MX5.5 24 MX5.6 25 MX13.1 26 MX13.2 Xuất huyết vi hậu môn Xuất hưyết miệng Vi bị ăn mịn đến hậu mơn Cơ bị ăn mịn Xuất huyết vi Đi bị ăn mịn Bình thường Bình thường Thận nhủn, có đốm trắng TT sưng Thận có đốm trắng T-TT có đốm trắng 27 MX13.3 28 MX13.4 Đi bị ăn mịn 29 MX13.5 Xuất huyết vi G-T-TT có đốm trắng Bình thường 30 MX13.6 Bình thường CA1.1 Bình thướng 32 CA1.2 Xuất huyết vi CA1.3 Xuất huyết da bụng Gan nhạt 34 CA1.4 Bình thường 35 CA1.5 Bình thường 36 CA1.6 Bình thường 37 CA2.1 Bình thường 38 CA2.2 Bình thường 39 CA2.3 Bình thường 40 CA2.4 Bình thường 41 CA2.5 Bình thường Gan vàng Xoang bụng có mùi Thận có đốm trắng G-T có nhiều đốm trắng Thận có đốm trắng Bóng sưng G-T có đốm trắng Gan trắng nhạt Thận có đốm trắng Gan nhạt màu 42 CA2.6 Bình thường 43 CA3.1 Bình thường 44 CA3.2 Xuất huyết vi 45 CA3.3 Bình thường 46 CA3.4 Bình thường 47 CA3.5 Bình thường 48 CA3.6 49 CA4.1 Bình thường Xuất huyết vi Mang nhạt màu 50 CA4.2 Xuất huyết da bụng 51 CA4.3 Xuất huyết thân 52 CA4.4 Xuất huyết thân, x x x x x x Dịch trong, có mùi Dịch có mùi hôi Gan trắng nhạt Xuất huyết thành bụng 33 x x Bình thường 31 Dịch Bình thường G-T-TT có đốm trắng G-T có đốm trắng G-T có đốm trắng Thận trước sưng G-T-TT có đốm trắng Bóng sưng Gan nhạt màu Xoang bụng có mùi Bình thường Gan có đốm trắng T-TT sưng Gan nhạt màu TTT có đốm trắng G-T-TT có đốm trắng G-T-TT có đốm Dịch trắng đục hôi Dịch vàng x x x x Dịch Dịch vàng x x x x Dịch vàng x x x x x Dịch vàng 41 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com x x x x x x x x x bụng trắng T-TT sưng Bình thường Xuất huyết vi đi, quanh miệng Xuất huyết nhẹ Vi bị đứt ngang Bình thường 53 CA4.5 54 CA4.6 55 CS1.1 56 CS1.2 Cơ bị thối rửa 57 CS1.3 Lở loét toàn thân 58 CS1.4 59 CS2.1 60 CS2.2 61 CS2.3 Xuất huyết vi Lở loét, xuất huyết vi Vi đuôi bị đứt, xuất huyết vi Lở loét nặng Xuất huyết vi 62 TT1.1 Bình thường 63 TT1.2 Bình thường 64 TT1.3 Xuất huyết hậu môn 65 TT1.4 Xuất huyết vi lưng 66 TT1.5 Bình thường 67 TT1.6 68 TT2.1 69 TT2.2 70 TT2.3 71 TT2.4 72 TT2.5 Bình thường Bình thường Xuất huyết nắp mang, Gan nhạt màu phù mắt Xuất huyết vi Gan nhạt màu Gan nhạt màu Bình thường Thận có đốm trắng G-T-TT có đốm Bình thường trắng Bình thường Gan nhạt màu 73 TT2.6 Bình thường 74 SD1.1 Bình thường 75 SD1.2 Bình thường 76 SD1.3 Xuất huyết vi hậu mơn 77 SD1.4 Bình thường 78 SD1.5 Bình thường 79 SD1.6 Bình thường Bình thường Xuất huyết nội quan Xuất huyết thành bụng Thận nhủn Gan có đốm trắng Gan nhủn, có đốm trắng G-T-TT có đốm trắng Gan tái nhạt TT sưng G-T-TT có đốm trắng Gan có màu khơng đồng T-TT có đốm trắng G-T-TT có đốm trắng Thận nhủn Ruột sưng G-T-TT có đốm trắng Bình thường Bình thường Gan nhạt màu TTT có đốm Gan nhạt màu TTT có đốm trắng Gan nhạt Thận nhủn TT có đốm trắng T-TT có đốm trắng Gan nhạt màu Thận có đốm trắng Gan nhạt màu Thận sưng, có đốm trắng Dịch có mùi Dịch Dịch nhày, có mùi Dịch x x Dịch vàng x x Dịch vàng x x x x x x Dịch vàng x Dịch vàng x Dịch vàng x Dịch x x x Dịch vàng x x x Dịch x x Dịch màu hồng 42 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com x x x x x x x 80 SD2.1 Bình thường 81 SD2.2 Sưng hầu 82 SD2.3 Xuất huyết vi 83 SD2.5 Bình thường Gan nhạt màu Nội quan xuất huyết Bình thường G-T-TT có đốm trắng Bóng trương to 84 SD2.6 Bình thường Gan nhạt màu 85 SD3.1 Xuất huyết vi Bóng trương to 86 SD3.2 Xuất huyết vi Gan nhạt màu 87 SD3.3 Xuất huyết vi Gan nhạt màu 88 SD3.5 Gan, thận nhạt màu 89 SD3.6 90 TN1.1 91 TN1.2 Xuất huyết vi Xuất huyết vi Đuôi bị ăn mòn Phù mắt, hàm sưng, xuất huyết quanh mắt Xuất huyết thân, da bụng 92 TN1.3 Bình thường 93 TN1.4 94 TN1.5 95 TN1.6 96 TN2.1 97 TN2.2 98 TN2.3 99 TN2.4 100 TN2.5 Bình thường Xuất huyết vi, da bụng Xuất huyết da bụng, hậu môn Xuất huyết vi, hầu, hốc mắt Trắng vi Xuất huyết da bụng, hậu môn Xuất huyết hầu, vi ngực Phù mắt Xuất huyết thân 101 TN2.6 Bình thường Dịch vàng x Dịch vàng Gan nhạt màu Xuất huyết nội tạng Gan có đốm trắng Thận có đốm trắng T-TT có đốm trắng Gan nhạt màu Bình thường Dịch vàng x x Dịch vàng x x x x x x Bình thường Bình thường Xuất huyết nội tạng Dịch có mùi G-T có đốm trắng Xuất huyết bụng Dịch có mùi Xuất huyết ruột Bình thường Bình thường Dịch vàng Ghi : G: Gan T: Thận TT: Tỳ tạng 43 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ... XUÂN XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH MỦ GAN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU... tính kháng thuốc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra bệnh mủ gan nuôi thâm canh số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Kết cho thấy vi khuẩn E ictaluri xuất hầu hết vùng nuôi Kết phân lập từ mẫu cá xác. .. ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường sinh thái sức khỏe người Vì vậy, đề tài ? ?Xác định đặc điểm sinh hoá khả kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh mủ gan Edwardsiella ictaluri cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)