Đang tải... (xem toàn văn)
Microsoft PowerPoint CNDT 2 Má»� Ăầu Chuyá» n gen á»� vi khuẩn TÔN BẢO LINH tonbaolinhhcmuaf edu vn CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2 72013 Giới thiệu môn học Mục tiêu môn học Cung cấp cho sinh viên ngành Công nghệ Sinh học kiến thức về phương pháp tạo DNA tái tổ hợp; Giới thiệu các phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn, nấm men, thực vật, động vật; ứng dụng kỹ thuật tái tổ hợp DNA trong sản xuất công nghiệp Nội dung đánh giá bài tập nhóm (10%), thi thực hành (20%), kiểm tra đánh giá.
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN TÔN BẢO LINH tonbaolinh@hcmuaf.edu.vn 7/2013 Giới thiệu môn học Mục tiêu môn học -Cung cấp cho sinh viên ngành Công nghệ Sinh học kiến thức phương pháp tạo DNA tái tổ hợp; - Giới thiệu phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn, nấm men, thực vật, động vật; ứng dụng kỹ thuật tái tổ hợp DNA sản xuất cơng nghiệp Nội dung đánh giá: tập nhóm (10%), thi thực hành (20%), kiểm tra - đánh giá cuối kì (70%) Tài liệu tham khảo • Glick B and Pasternak J J., 2007 Công nghệ sinh học phân tửNguyên lý ứng dụng DNA tái tổ hợp NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Phần I.2 Các hệ thống sinh học dùng CNSH phân tử Phần I.6 Thao tác biểu gen sinh vật nhân sơ Phần I.7 Sản xuất protein dị chủng tế bào nhân chuẩn Phần III.17 Cải biến gen thực vật: phương pháp luận Phần III.19 Động vật chuyển gen • OLD R.W and Primrose S.B., 1994 Principles of Gene Manipulation Blackwell Science • Madigan M.T., Martinko J M., Parker J., 2003 Brock Biology of Microorganisms (10th ed) Prentice Hall Pearson Education International Giới thiệu môn học Tạo vi sinh vật BĐG biểu gen sinh vật nhân sơ Sản xuất protein dị chủng tế bào nhân chuẩn Cải biến gen thực vật Động vật chuyển gen Ni tế bào Tạo dịng gen Tạo sinh vật biến đổi gen Giới thiệu môn học Công nghệ di truyền (genetic engineering) hay biến đổi di truyền (genetic transformation) biến đổi gen sinh vật cách bổ sung vào gen hay vài gen Gen đưa vào gọi “gen chuyển” (transgene); sinh vật nhận gene chuyển vào gen cách bền vững gọi sinh vật biến đổi gen (transgenic organism hay transformed organism) CNDT sử dụng ứng dụng thực tế (cải tạo giống trồng, vật nuôi hay tạo sinh vật biến đổi gen), đồng thời công cụ hữu hiệu cho nghiên cứu (nghiên cứu chức gen, tạo đột biến) NGUYÊN TẮC BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN Quá trình biến đổi di truyền gồm bước bản: (1) chuyển DNA ngoại lai vào tế bào tạo tế bào biến đổi gen, (2) nhận sinh vật biến đổi gen từ tế bào biến đổi Sự xác nhập (integration) gen vào gen tế bào nhận có định hướng hay ngẫu nhiên CÁC HÌNH THỨC CHUYỂN GEN Tiếp hợp (conjugation): phổ biến vi khuẩn, truyền thông tin di truyền thông qua tiếp xúc trực tiếp tế bào Chuyển nạp (transduction): trình DNA chuyển từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác virus Quá trình bao gồm việc chuyển DNA ngoại lai vào tế bào vector virus Gen ngoại lai xác nhập bền vững vào gen tế bào chủ Chuyển nhiễm (transfection): trình chuyển nucleic acid (hay protein) tự vào tế bào Thường dùng để nói đến chuyển gen sinh vật nhân chuẩn Biến nạp (Transformation): thường dùng để mơ tả q trình chuyển vật liệu di truyền vào tế bào vi khuẩn, tế bào động vật thực vật CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENCHUYỂN GEN CÁC HÌNH THỨC CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN PP GIÁN TIẾP •Thực khuẩn thể •Virus •Vi khuẩn kí sinh • • • • • PP TRỰC TIẾP Hóa học Điện biến nạp (electroporation) Vi tiêm (microinjection) Bắn gen (biolistics) Silicon carbide Phương pháp chuyển gen sử dụng PEG (Polyethylene glycol) Tế bào trần lục mô (mesophyll protoplasts) Arabidopsis Lá Arabidopsis phân giải cellulase macerozyme (cellulase, Hemicellulase, Pectinase) nhiệt độ phòng Sự biểu gen tín hiệu (reporter gene) GUS (A) GFP (B) tế bào trần lục mô Arabidopsis CHUYỂN GEN QUA TIẾP HỢP (Conjugation) Sự chuyển DNA plasmid trình tiếp hợp CHUYỂN GEN QUA TIẾP HỢP (Conjugation) Sự kết hợp F plasmid vào NST hình thành Hfr Plasmid chèn vào NST vị trí yếu tố IS Trên NST có trình tự IS3 nằm gen pro lac CHUYỂN GEN SỬ DỤNG TÁC NHÂN HÓA LÝ Tạo tế bào khả nạp (electro-/chemical competent cell) dùng chuyển gen cách sốc nhiệt dùng xung điện Chuyển gen cách sốc nhiệt dùng xung điện Sàng lọc tế bào mang gen chuyển môi trường chọn lọc SÀNG LỌC VI KHUẨN CHUYỂN GEN Tăng sinh • Tăng sinh mơi trường LB lỏng, 37oC, • Tốc độ lắc >200 rpm Sàng lọc • Chọn lọc mơi trường LB chứa kháng sinh thích hợp • IPTG (1 mM), X-gal (40 àg/ml) Ly trớch plasmid ã Chn khun lc cú khả mang plasmid sang đĩa môi trường (masterplate) • Chọn khuẩn lạc “masterplate” ly trích plasmid phân tích SÀNG LỌC VI KHUẨN CHUYỂN GEN Tế bào E.coli sau tăng sinh chọn lọc môi trường LB chứa kháng sinh, IPTG X-gal Khuẩn lạc đơn màu trắng xanh chọn để phân tích PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN GEN • Cảm ứng biểu gen với thời gian tăng dần (vd, Isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside, IPTG) • Ly trích, tinh protein, điện di • Chuyển protein lên màng, Western blot A Protein dịch chiết thô tế bào E coli B Protein dịch chiết bào E coli sau tinh Tank transfer apparatus for Western blotting Schematic showing the assembly of a typical Western blot apparatus with the position of the position of the gel, transfer membrane and direction of protein in relation to the electrode position (http://www.piercenet.com/method/western-blot-transfer-methods) CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ PHỔ BIẾN TRONG CHUYỂN GEN Ở VI KHUẨN • SURE cell: {e14–(McrA–) Δ.(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)]} (Stratagene, La Jolla, CA) • DH5α: [Fˉφ80lacZΔM15 Δ.(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17 (rkˉ, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ-] (Invitrogen, Carlsbad, CA) • TOP10F’: F′ {lacIq, Tn10(TetR)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacΧ74 recA1deoR araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG (Invitrogen, Carlsbad, CA) • BL21(DE3)pLysS: Fˉ, ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysS (CamR) (Invitrogen, Carlsbad, CA) Vector chủng vi khuẩn sử dụng biểu gen http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/transformation/ VECTOR BIỂU HIỆN GEN VECTOR DÙNG TRONG CHUYỂN GEN Ở E.COLI Các vector với chức khác cải tiến phù hợp với nhiều ứng dụng như: • dùng biểu protein • Dùng để phát tín hiệu điều hịa • Chọn lọc trực tiếp vector tái tổ hợp • Với vị trí cắt bổ sung • Với marker chọn lọc bổ sung • Phục vụ giải trình tự DNA • Cho phép giải phóng protein • Gen-fusion vector phục vụ tinh protein MỘT SỐ LƯU Ý • Tế bào khả nạp giữ lạnh thao tác • Sự phù hợp tế bào khả nạp vector cần chuyển tác nhân chọn lọc (kháng sinh, chất thị màu) • Vector dùng tạo dịng thường có khối lượng thấp, mang tính trạng chọn lọc tế bào chủ vị trí cắt nhiều enzyme cắt giới hạn VECTOR DÙNG TRONG CHUYỂN GEN Ở E.COLI Thực khuẩn thể cosmid vector Thực khuẩn thể lamda có gen gồm DNA mạch thẳng, sợi đơi kích thước khoảng 45 kb Lamda DNA tự nhiên có đầu đính để tạo thành vị trí cos Trong q trình chuyển nhiễm, DNA lamda kết hợp với DNA ngoại lai tạo thành cosmid http://teachers.guardian.co.uk Sự tái lamda DNA chu kì tiềm tan ly giải Lamda vector cải biến để chèn phân đoạn lên đến 15 – 20 kb ... (transduction): trình DNA chuyển từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác virus Quá trình bao gồm vi? ??c chuyển DNA ngoại lai vào tế bào vector virus Gen ngoại lai xác nhập bền vững vào gen tế bào chủ Chuyển nhiễm (transfection):... truyền vào tế bào vi khuẩn, tế bào động vật thực vật CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENCHUYỂN GEN CÁC HÌNH THỨC CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN PP GIÁN TIẾP •Thực khuẩn thể •Virus ? ?Vi khuẩn kí sinh • • •... truyền (genetic engineering) hay biến đổi di truyền (genetic transformation) biến đổi gen sinh vật cách bổ sung vào gen hay vài gen Gen đưa vào gọi ? ?gen chuyển? ?? (transgene); sinh vật nhận gene chuyển
