Đang tải... (xem toàn văn)
Microsoft PowerPoint CNDT 2 Chuyá» n gen á»� tế bÀo nấm men CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2 Chuyển gen ở nấm men Tháng 22015 HẠN CHẾ CỦA HÊ THỐNG CHUYỂN GEN SINH VẬT TIỀN NHÂN Protein được tổng hợp từ vi khuẩn thường không bền hoặckhông có hoạt tính sinh học, do • (1) sự xoắn cuộn protein khác nhau (thể vùi, inclusionbody), tạo cầu nối disulfide không chính xác • (2) ở tế bào nhân sơ không có các biến đổi sau dịch mãqua đó các nhóm hóa học chức năng không được gắn vàovị trí amino acid đặc hiệu • (3).
CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN Chuyển gen nấm men Tháng 2/2015 HẠN CHẾ CỦA HÊ THỐNG CHUYỂN GEN SINH VẬT TIỀN NHÂN Protein tổng hợp từ vi khuẩn thường khơng bền khơng có hoạt tính sinh học, • (1) xoắn cuộn protein khác (thể vùi, inclusion body), tạo cầu nối disulfide khơng xác • (2) tế bào nhân sơ khơng có biến đổi sau dịch mã qua nhóm hóa học chức khơng gắn vào vị trí amino acid đặc hiệu • (3) khơng tổng hợp protein gồm nhiều tiểu đơn vị E coli chưa sử dụng lên men công nghiệp vi khuẩn Gram +, vd Bacillus (amylase, protease), actinomycetes (kháng sinh) hay coryneforms (amino acid, steroid) Tuy nhiên, việc tạo dòng vi khuẩn không hiệu E coli Quá trình phiên mã, dịch mã Sự hình thành mRNA chức tế bào nhân chuẩn Q trình glycosyl hóa nấm men • Các glycans nấm thường gồm mannose (S pombe galactose) • S cerevisiae trường hợp ngoại lệ tạo nhiều phản ứng mannose hóa, khơng diễn tất protein • Sự glycosyl hóa nấm men ảnh hưởng đến đặc tính sản phẩm protein hoạt tính hay gắn kết • Liên kết α-1,3-Man cuối chuỗi mang tính miễn dịch với vật thể lạ động vật có vú Các hệ thống biểu gen phổ biến eukaryote • Để khắc phục nhược điểm nói trên, hệ thống biểu nhân chuẩn sử dụng nấm men, côn trùng, tế bào động vật có vú phát triển • Protein tái tổ hợp từ tế bào nhân chuẩn có tính ổn định hoạt tính sinh học phù hợp cho nghiên cứu hóa sinh, lý sinh cấu trúc, vd protein tái tổ hợp dùng y học • Yeast • Nấm men (yeast) • Tế bào côn trùng (insect cells) • Tế bào động vật có vú (và hybridomas) • Động vật có vú (mammals): chuột, cừu • Thực vật • Tế bào thực vật/ bào quan (organs) • Bào quan thực vật: lục lạp (chloroplasts) ƯU ĐIỂM CỦA HỆ THỐNG BIỂU HIỆN NẤM MEN chủng nấm men thường sử dụng Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris SINH HỌC NẤM MEN • Sinh vật nhân chuẩn, đơn bào, đường kính khoảng µm, có 16 nhiễm sắc thể (n) • Bộ gen S cerevisiae gồm khoảng 1,2 x 107 cặp base, nhỏ gen người 200 lần • Nấm men phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy, thời gian phân chia khoảng gen có kích thước nhỏ, sinh sản nhanh (giống vi khuẩn) • Nấm men sinh sản cách chồi hay phân chia trực tiếp (fission), phát triển dạng sợi khuẩn ty (mycelium) Tế bào nấm men Nguồn: www.bbc.co.uk CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở NẤM MEN • 1978 Hinnen cs lần chuyển gen nấm men Spheroplast S cerevisiae (nấm men khơng có thành tế bào) hòa polyethylen glycol (PEG) với DNA CaCl2, sau tái tạo thành tế bào mơi trường ổn định chứa 3% agar • Kỹ thuật dùng xung điện (electroporation) thay cách dùng spheroplast nấm men dễ thực nhanh Các tế bào biến đổi chọn lọc bề mặt môi trường rắn YIp (Yeast integrating plasmid) YIp xác nhập với DNA gen tái tổ hợp đồng Sự kết hợp dạng Sự kết hợp nhiều xảy Do vector thích hợp để xây dựng chủng bền vững gia tăng biểu gen chuyên biệt YAC (Yeast artificial chromosome) • Các hệ thống tạo dịng YAC dựa plasmid mạch thẳng nấm men, bậc YLp, chứa trình tự DNA có chức telomeres (TEL) in vivo, mang đoạn ARS CEN • YAC vector mang đoạn DNA lớn (lên đến Mb), hiệu chuyển gen thấp Các thành phần chủ yếu YAC: • Centromeres (CEN), telomeres (TEL) trình tự tái độc lập (ARS) • Marker: ampr , TRP1 URA3 • Vị trí nhận biết cắt giới hạn (như EcoRI BamHI) CÁC VECTOR NẤM MEN – YAC (Yeast artificial chromosome) Promoter biểu gen Promoter biểu gen Thơng thường, promotor cảm ứng kiểm soát chặt chẽ việc phiên mã, sử dụng để sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp vào thời điểm định nuôi cấy mô qui mô lớn Vacine Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B Protein vỏ bào tử sốt rét Protein vỏ HIV-1 Chẩn đoán Protein virus viêm gan C Các kháng nguyên HIV-1 Các tác nhân chữa bệnh người Tác nhân tăng sinh biểu bì Insulin Proinsulin Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi Yếu tố đông máu XIIIa Hyrudin Albumin huyết người TẠO PROTEIN DUNG HỢP HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH GẤP VÀ BÀI TIẾT PROTEIN CÁC PHƯƠNG PHÁP GIA TĂNG BÀI TIẾT PROTEIN Ở NẤM MEN Phân lập dòng đột biến siêu tiết Đã phân lập nhiều Hầu hết không ảnh hưởng tiết Hầu hết tính trạng lặn Dung hợp protein tái tổ hợp với protein nội sinh tiết tốt Yếu tố Prepro – α, Hsp150 Loại bỏ gen kiểm soát chất lượng CNE (dạng tương đồng calnexin) protein gấp sai Biểu vượt mức máy gấp protein mạng lưới nội chất Biểu vượt mức thành phần máy tiết Tối ưu hóa điều kiện sản xuất Yeast media YPAD medium or Also Called YPD plus Adenine Yeast Extract - Peptone - Dextrose plus Adenine medium • 6.0 gm yeast extract (Difco) 12.0 gm Peptone (Difco) 12.0 gm Glucose 60 mg adenine hemisulphate 600 ml distilled water Bacto-agar (Difco) 10 g (added for agar medium) • Sterilise by autoclaving at 121°C for 15 We always use a liter flask and make 600 mls of media because it gives exactly 20 plates (1 Sleeve of plates) In addition this volume of liquid is more easily handled when pouring after autoclaving http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/media.html Yeast media Synthetic Complete drop-out Medium Mix (SC drop-out) Supplement Amount • 2.0 gm Adenine hemisulfate* 2.0 gm Arginine HCl 2.0 gm Histidine HCl* 2.0 gm Isoleucine 2.0 gm Leucine* 2.0 gm Lysine HCl 2.0 gm Methionine 3.0 gm Phenylalanine 6.0 gm Homoserine 3.0 gm Tryptophan* 2.0 gm Tyrosine 1.2 gm Uracil* 9.0 gm Valine Omit the appropriate component(s), indicated in bold type, to prepare SC-Ade, SC-His, SC-Leu, SC-Trp, SC- Trp/Leu, and SC-Trp/Leu/His Combine the ingredients in a clean 250 ml plastic bottle Add three or four clean glass marbles and shake vigorously to mix This quantity will be sufficient for approximately 100 (600 ml) batches of SC drop-out medium Some recipes call for 20 amino acids in the SC mixture however most yeast strains not need all of them In addition some recipes not use homoserine due to the expense, it can be replaced by the addition of serine and threonine (2 grams each) ... khuẩn ty (mycelium) Tế bào nấm men Nguồn: www.bbc.co.uk CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở NẤM MEN • 1978 Hinnen cs lần chuyển gen nấm men Spheroplast S cerevisiae (nấm men khơng có thành tế bào) hịa... thể nấm men nhân tạo (YAC) VECTOR E COLI - NẤM MEN Điểm khởi đầu tái nấm men CÁC VECTOR NẤM MEN Các tế bào bị biến đổi chọn lọc dựa vào đột biến khuyết dưỡng (auxotrophy) đặc điểm đoạn gen chèn... (electroporation) thay cách dùng spheroplast nấm men dễ thực nhanh Các tế bào biến đổi chọn lọc bề mặt môi trường rắn CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở NẤM MEN Các phương pháp chuyển gene • Sử dụng spheroplast •