Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ ENZYME PECTINASE, CELLULASE CỦA VI KHUẨN B.SUBTILIS, P.LANTARUM VÀ NẤM MỐC A.NIGER, PH.CHRYSOSPORIUM ĐỂ XỬ LÝ LỚP NHỚT CỦA VỎ CÀ PHÊ INVESTIGATION ON THE APPLICATION OF PECTINASE, CELLULASE ENZYMES OF BACTERIA B.SUBTILIS, P.LANTARUM AND FUNGI A.NIGER, PH.CHRYSOSPORIUM FOR MUCILAGE COAT FROM THE COFFEE BEANS SVTH: Dương Văn Tuân, Lê Thị Hoàng Linh Lớp 10SHLT và 07SH, Khoa Hóa, Trường Đại Học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô Khoa Hóa, Trường Đại Học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng TÓM TẮT Nghiên cứu này nhằm mục đích làm sạch lớp nhớt bám trên hạt cà phê sau khi tách vỏ. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 4 chủng vi sinh vật, bao gồm hai chủng nấm mốc: A.niger, Ph.chrysosporium,và hai chủng vi khuẩn: B. subtilis, L. plantarum, trong đó A. niger, Ph. chrysosporium có khả năng tổng hợp enzyme cellulase và pectinase, B. subtilis chỉ có khả năng tổng hợp cellulase và L. plantarum có khả năng tổng hợp acid lactic. Thử nghiệm khả năng xử lý nhớt của hạt cà phê sau 20 giờ lên men khi sử dụng đơn chủng và phối hợp các chủng với nhau chúng tôi nhận thấy: khi xử lý đơn chủng với A.niger cho hiệu quả cao nhất đạt 93%, xử lý phối hợp 2 chủng với Ph. chrysosporium và A. niger cho hiệu quả cao nhất đạt 96%, xử lý phối hợp 3 chủng với B. subtilis, Ph. chrysosporium và A. niger cho hiệu quả cao nhất đạt 98%, xử lý phối hợp 4 chủng với B. subtilis, Ph. chrysosporium, A. niger và L. plantarum cho hiệu quả cao nhất đạt 97%. ABSTRACT This study aims at mucilage coat from the coffee beans after shelling. In this study we used four strains of microorganisms, including two strains of fungi: A. niger, Ph. chrysosporium, and two strains of bacteria: B. subtilis, L. plantarum. A. niger, Ph. chrysosporium are capable of cellulase and pectinase synthesis, B. subtilis is only capable of cellulase synthesis and L. plantarum has the ability to synthesize lactic acid. The ability to treat the beans after 20 hours of fermentation of single strains and of different combination of strains was tested. The results showed that: when using only A.niger strain the maximum removing efficiency is 93%, using the combination Ph. chrysosporium and A. niger the maximum efficiency reached 96%, with three strains of B. subtilis, Ph. chrysosporium and A. niger the maximum removing efficiency is 98%, and with the combination of four strains of B. subtilis, Ph. chrysosporium, A. niger and L. plantarum the maximum efficiency reached 97%. 1. GIỚI THIỆU Các sản phẩm cà phê trên thị trường nước ta hiện nay chủ yếu được chế biến theo phương pháp khô nên việc tách chiết các chất hòa tan có trong hạt chưa đạt hiệu quả cao, làm giảm chất lượng cà phê. Nguyên nhân gây ra là do thành phần pectin và cellulose còn chiếm một tỉ lệ cao trong hạt chưa được tách triệt để [1][3]. Pectin liên kết với thành phần cellulose ở lớp vỏ thóc làm cho hạt sau khi bóc vỏ thịt có độ nhớt cao, khó sấy khô, gây khó khăn cho việc tách vỏ thóc một cách triệt để, làm giảm chất lượng cà phê. Để phá hủy lớp nhớt trong vỏ hạt cà phê có nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp sinh học: sử dụng các enzyme pectinase, protopectinase, cellulase…., phương pháp hóa học: sử dụng NaOH, Na 2 CO 3 , vôi, dùng nước ấm và phương pháp cơ học: sử dụng máy chà xát tươi. Với những yêu cầu về kinh tế và tính chủ động trong sản xuất thì phương pháp lên men sử Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 dụng các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme có nhiều triển vọng hơn, tuy nhiên nếu sử dụng hệ vi sinh vật không đặc hiệu thì sản phẩm sẽ không đạt chất lượng cao, thời gian lên men kéo dài. Sử dụng hệ enzyme pectinase, cellulase và môi trường acid do các vi sinh vật tổng hợp nhằm tạo ra chế phẩm vi sinh để xử lý nhớt cà phê trong phương pháp chế biến ướt có tính kinh tế cao, dễ thực hiện, chủ động trong sản xuất. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - Các chủng vi sinh vật: Bacillus subtilis, Lactobacillus plantarum, Phanerochaete chrysosporium và Aspergillus niger được phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng cung cấp. - Nguyên liệu cà phê Robusta được thu hái ở các tỉnh Tây Nguyên. - Pectin tinh khiết được mua của Merck - Môi trường nuôi các chủng vi sinh vật: Vi khuẩn B. subtilis được nuôi trên môi trường: bột gạo 2g/l, bột đậu tương 2g/l, NH 4 Cl 0,4g/l, K 2 HPO 4 1g/l, KH 2 PO 4 0,6g/l, pH = 7, lượng cơ chất cảm ứng bổ sung: CMC 2g/l, vỏ cà phê 4g/l. Vi khuẩn L. plantarum được nuôi trên môi trường: nước cà chua 10%, nước dừa 10%, cao nấm men 10g/l, vỏ cà phê 5g/l. Nấm A. niger nuôi trên môi trường: 75% cám, 12% trấu, 1% (NH 4 ) 2 SO 4 , lượng cơ chất cảm ứng bổ sung: 12% vỏ cà phê. Nấm Ph. chrysosporium nuôi trên môi trường: 50% cám, 20% bột mì, 5% đường, 12% trấu, 1% (NH 4 ) 2 SO 4, lượng cơ chất cảm ứng bổ sung: 12% vỏ cà phê. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Đo vòng thủy phân enzyme petinase, cellulase của 4 chủng vi sinh vật theo phương pháp khuếch tán enzym trên thạch cơ chất. [2] - Xác định hoạt độ enzyme pectinase, cellulase theo phưong pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5- dinitrisalycilic). Theo phương pháp Bernfeld [2] - Khảo sát khả năng xử lý lớp nhớt trên vỏ cà phê bằng phương pháp đếm số hạt sạch nhớt trên tổng số hạt xử lý. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme pectinase và cellulase của các chủng vi sinh vật 3.1.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme bằng phương pháp đo đường kính vòng thủy phân Để khảo sát hoạt lực enzyme cellulase chúng tôi sử dụng phương pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch có chứa cơ chất Carboxylmetylcellulose (CMC) 1%, và để khảo sát hoạt lực enzyme pectinase chúng tôi sử dụng đĩa thạch có chứa cơ chất pectin 0,5%. Hoạt lực enzyme được đánh giá bằng đường kính vòng thủy phân (D-d). Kết quả được trình bày tại bảng 3.1 Kết quả nghiên cứu cho thấy 2 chủng: A. niger và Ph. chrysosporium đều có khả năng tổng hợp cả hệ enzyme pectinase và cellulase, còn chủng B. subtilis không tổng hợp pectinase mà chỉ tổng hợp enzyme cellulase. Đường kính vòng thủy phân pectin và CMC của A. niger (18mm), lớn hơn so với đường kính vòng thủy phân của Ph. Chrysosporium (11mm). Hai chủn g vi khuẩn B. subtilis, L. plantarum không tổng hợp enzyme pectinase, riêng B. subtilis có khả năng sinh enzyme cellulase (16mm). Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 Bảng 3.1. Hình ảnh và đường kính vòng thủy phân của enzyme pectinase, cellulase của các chủng vi sinh vật: Chủng VSV Enzyme Bacillus subtilis Lactobacillus Phlantarum Aspergillus niger Phanerochaete chrysosporium Đo đường kính vòng thủy phân enzyme pectinase Không xuất hiện vòng thủy phân Không xuất hiện vòng thủy phân D - d = 27 - 9 = 18 mm D - d = 17 - 6 = 11mm Đo đường kính vòng thủy phân enzyme cellulase D - d = 22 - 6 = 16 mm Không xuất hiện vòng thủy phân D - d = 24 - 6 = 18 mm D - d = 18 - 7 = 11 mm 3.1.2. Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp DNS Phương pháp DNS cho phép đánh giá lượng đường khử giải phóng ra sau khi thủy phân bằng enzyme. Phương pháp này có độ chính xác cao hơn so với phương pháp đo đường kính vòng thủy phân. Một đơn vị hoạt độ được tính bằng lượng enzyme có khả năng phân giải cơ chất để tạo ra 1g đường khử trong thời gian 1 phút. Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát hoạt độ enzyme theo thời gian nuôi cấy. Kết quả được thể hiện các đồ thị hình 3.1, 3.3, 3.4. Riêng chủng L. plantarum thì không tổng hợp các enzyme mà chỉ acid hóa môi trường. Mức độ acid hóa môi trường được đánh giá bằng máy đo pH, kết quả được thể hiện ở đồ thị hình 3.2. 0 50 100 150 200 250 0 24 48 72 96 120 144 168 192 thời gian (giờ) Hoạt độ enzyme 1 2 0 100 200 300 400 500 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 thời gian (giờ) hoạt độ enzyme 2 1 Hình 3.1: Đồ thị biểu thị hoạt lực enzyme pectinase của B. subitlis Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn khả năng làm giảm pH môi trường của L. Plantarum 0 50 100 150 200 250 300 0 12 24 36 48 60 72 84 Thời gian nuôi (giờ) hoạt độ enzyme 0 1 2 3 4 5 6 7 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 Thời gian nuôi (giờ) pH Mẫu thử Mẫu trắng Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 Kết quả cho thấy rằng chủng A. niger tổng hợp enzyme pectinase cao nhất sau 48 giờ nuôi (437 đv), chủng Ph. chrysosporium tổng hợp enzyme pectinase cao nhất sau 96 giờ nuôi (238 đv), còn chủng B. subtilis tổng hợp enzyme cellulase cao nhất sau 68 giờ nuôi (250 đv). Khả năng acid hóa môi trường của L. plantarum cao nhất sau 48 giờ nuôi pH môi trường nuôi giảm từ 6,5 đến 3,6. Từ kết quả nghiên cứu này chúng tôi chọn thời gian nuôi để thu enzyme cho A. niger là 48 giờ, Ph. chrysosporium là 96 giờ, B. subtilis là 68 giờ và nuôi L. plantarum trong 48 giờ để tạo môi trường pH thấp. 3.2. Khảo sát khả năng xử lý nhớt cà phê của 4 chủng vi sinh vật Để đánh giá khả năng xử lý nhớt của hạt cà phê chúng tôi tiến hành khảo sát với từng chủng, sau đó khảo sát sự phối hợp giữa các chủng nhằm mục đích chọn một tổ hợp vi sinh vật có khả năng xử lý lớp nhớt của hạt cà phê cao nhất. Khả năng xử lý nhớt được đánh giá bằng số hạt sạch nhớt trên 100 hạt được chọn ngẫu nhiên. 3.2.1. Khảo sát khả năng xử lý nhớt của từng chủng Nuôi các chủng vi sinh vật theo kết quả khảo sát ở phần trên để thu chế phẩm, sau đó sử dụng chế phẩm để xử lý nhớt của hạt cà phê trong thời gian từ 12 đến 20 giờ. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2: Kết quả xử lý nhớt hạt cà phê của các chủng nghiên cứu (tỷ lệ % hạt sạch nhớt) Thời gian xử lý (giờ) Chủng 12 14 16 18 20 B. subtilis (%) 74 78 83 89 91 Ph. Chrysosporium (%) 60 69 73 80 88.4 A. niger (%) 76 79 82 89 93 L. plantarum (%) 36 45 52 57 62 Kết quả cho thấy thời gian xử lý càng dài thì khả năng loại nhớt càng cao. Hiệu quả xử lý đạt cao nhất với A. niger (93%) sau 20 giờ, tiếp đến là B. subtilis (91%) sau 20 giờ. Riêng chủng L. Plantarum, mặc dù không có khả năng tổng hợp enzyme nhưng cũng có khả năng làm sạch nhớt đến 62%, điều đó cho thấy môi trường acid cũng làm sạch lớp nhớt của hạt cà phê, hơn nữa theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy rằng acid lactic có vai trò tích cực trong quá trình nâng cao hương vị của sản phẩm cà phê. 3.2.2. Khảo sát khả năng xử lý nhớt của cà phê bằng cách kết hợp các chủng Hình 3.3: Đồ thị biểu thị hoạt lực enzyme pectinase và cellulose của Ph.chrysosporium Hình 3.4: Đồ thị biểu thị hoạt lực enzyme pectinase và cellulose của A. niger Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 Cách tiến hành thí nghiệm tương tự như khi khảo sát cho từng đơn chủng, nhưng có sự phối hợp lần lượt từng 2 chủng, 3 chủng và 4 chủng với nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3: Kết quả xử lý nhớt hạt cà phê bằng cách phối hợp giữa các chủng (tỷ lệ % hạt sạch nhớt) Thời gian lên men (giờ) Mẫu 12 14 16 18 20 Kết hợp 2 chủng B. subtilis và L. Plantarum (%) 80 83 85 88 92 A. niger và Ph. Chrysosporium (%) 77 82 88 95.7 97 A. niger và B. Subtilis (%) 79 82 85 92 95 B. subtilis và Ph. Chrysosporium (%) 78 82 86 92 94 Kết hợp 3 chủng B. subtilis, A. niger và Ph. Chrysosporium (%) 80 84 87 94 98 Kết hợp 4 chủng B. subtilis,A. niger,Ph. chrysosporium và L. Platanrum (%) 79 83 88 95 98 Khi kết hợp xử lý 2 chủng một, mẫu A. niger và Ph. chrysosporium cho hiệu quả xử lý cao nhất (97%), tiếp theo là cặp chủng A. niger và B. subtilis (95%) sau 20 giờ xử lý. Khi xử lý kết hợp 3 chủng có hiệu quả xử lý cao nhất (98%), khi xử lý bằng cách kết hợp 4 chủng thì hiệu quả xử lý tương đương với xử lý kết hợp 3 chủng (98%), nhưng L. plantarum lại có tác dụng tốt tới hương vị cà phê sau này. 3.3. Sản xuất chế phẩm Để sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong xử lý nhớt cà phê, các chủng được nuôi theo môi trường và thời gian đã được xác định ở mục 3.1.2. Sau đó tiến hành phối trộn 4 chủng vi sinh vật theo tỷ lệ 1:1:1:1 để thu được chế phẩm dạng ướt. Chế phẩm dạng ướt được sấy ở 40 o C trong 48 giờ để thu chế phẩm dạng khô. Kiểm tra khả năng làm sạch lớp nhớt hạt cà phê của chế phẩm sau khi sấy với trước lúc sấy ta thu được kết quả trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.5, 3.6 và 3.7. Bảng 3.4: Kết quả xử lý nhớt hạt cà phê của chế phẩm vi sinh vật (tỷ lệ % hạt sạch nhớt) Thời gian lên men (giờ) Mẫu 12 14 16 18 20 Chế phẩm ướt (%) 78 83 89 94 98 Chế phẩm dạng khô (%) 75 80 87 92 96 KẾT LUẬN Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đã thu được những kết quả sau đây: Hình 3.5: Cà phê sau khi lên men Hình 3.6: Cà phê sau khi sấy khô Hình 3.7. Chế phẩm vi sinh vật dạng khô Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012 - Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase, cellulase của 3 chủng A. niger, Ph. Chrysosporium, B. Subtilis cho thấy A. niger sinh enzyme pectinase cao nhất, cả 3 chủng đều có khả năng tổng hợp enzyme cellulase. L. Plantarum có khả năng giảm pH môi trường đến pH 3,6. - Chọn được thời gian và điều kiện nuôi cấy thích hợp để vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cao. Thời gian nuôi các chủng vi sinh vật trên để thu hệ enzyme pectinase, cellulase đạt cao nhất: A. niger 4 giờ, Ph. Chrysosporium 96giờ, B. Subtilis 72giờ và thời gian để thu acid của vi khuẩn L. Plantarum sau 48 giờ nuôi. - Khảo sát xử lý cà phê bằng cách sử dụng đơn chủng và phối hợp các chủng. Hiệu quả xử lý đạt cao nhất là 98% hạt sạch nhớt. - Thử nghiệm thành công khi dùng 4 chủng vi sinh vật vào sản xuất chế phẩm để làm sạch lớp nhớt vỏ cà phê. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Việt Chương (2000), Kỹ thuật trồng cà phê. Nhà xuất bản Thành phố Hồ Chí Minh [2] Nguyễn Ðức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh, tập 2 – Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Ðại học Quốc Gia, thành phố Hồ Chí Minh. [3]. Bùi Anh Võ, Nguyễn Ðức Lượng (2009), Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ cà phê. Đại học Tôn Đức Thắng, Đại Học Bách Khoa, ĐHQG-TPHCM. [4] Phan Thị Loan (2011), Xác định chế phẩm enzyme và điều kiện thích hợp để xử lý lớp nhớt cà phê vối, Luận văn thạc sĩ kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng. [6]. www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15917609, Nghiên cứu tối ưu các điều kiện sinh cellulose ngoại bào trên môi trường lên men công nghiệp, ngày truy cập 28/02/2012 [7]. www.pdfio.com/k-1114369.html. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, sổ kết quả nghiên cứu khoa học 6 tháng đầu năm,ngày truy cập 02/03/2012 . B. SUBTILIS, P. LANTARUM VÀ NẤM MỐC A. NIGER, PH. CHRYSOSPORIUM ĐỂ XỬ LÝ L P NHỚT C A VỎ CÀ PH INVESTIGATION ON THE APPLICATION OF PECTINASE, CELLULASE ENZYMES. trong vỏ hạt cà ph có nhiều ph ơng ph p khác nhau như ph ơng ph p sinh học: sử dụng các enzyme pectinase, protopectinase, cellulase ., ph ơng ph p h a học: