BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÀI TIỂU LUẬN Protein tái tổ hợp virus cúm gia cầm Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Trần Thị Ngọc Quỳnh Ngày 31 tháng 10 năm 2009 MỤC LỤC I Đặt vấn đề Error! Bookmark not defined.  II Tổng quan Error! Bookmark not defined.  1.Căn bệnh: Error! Bookmark not defined.  a.Hình thái, cấu trúc: Error! Bookmark not defined.  b.Quá trình tái sản virus Error! Bookmark not defined.  c Những loài cảm nhiễm: loài dã cầm, gia cầm, heo, chuột, mèo, loài linh trưởng Error!  Bookmark not defined.  d.Triệu chứng: Error! Bookmark not defined.  e.Đường lây truyền Error! Bookmark not defined.  2.Các phương pháp chẩn đoán Error! Bookmark not defined.  a.Chẩn đoán lâm sàng phân biệt với số bệnh khác: Error! Bookmark not defined.  b.Chẩn đốn phịng thí nghiệm: Error! Bookmark not defined.   3.Phòng chống bệnh cúm gia cầm Error! Bookmark not defined.  a.Biện pháp an toàn sinh học Error! Bookmark not defined.  b.Phòng bệnh vaccine Error! Bookmark not defined.  4.Kỹ thuật tạo dòng (cloning) Error! Bookmark not defined.  5.Chủng virus vaccine NIBRG-14 Error! Bookmark not defined.  6.Sản xuất tiểu đơn vị virus cúm H9N2 Error! Bookmark not defined.  III Kết luận Error! Bookmark not defined.  1.Chủng virus vaccine NIBRG-14 Error! Bookmark not defined.  2.Sản xuất tiểu đơn vị virus cúm H9N2 Error! Bookmark not defined.  IV Tài liệu tham khảo Error! Bookmark not defined.  I Đặt vấn đề Bệnh cúm gia cầm bệnh truyền nhiễm virus gây chết cao gia cầm ( tỷ lệ chết lên đến 100%) với biểu hơ hấp, tiêu hóa hay thần kinh Những loài chim, chim nước hoang dã, chim biển xem nguồn tàng trữ virus gây nhiễm quan trọng Bệnh cúm gia cầm ghi nhận vào năm 1878 Ý gọi “dịch tả gà” (fowl plague) Sau đó, người ta thấy bệnh xuất nước Áo, Đức, Bỉ Pháp Hiện bệnh nước giới với subtype khác xác định Một số ổ dịch gần nước khác thông báo: Năm Subtype Nước 1991 H5N1 Gà tây Anh 1992-1995 H7N3 Úc 1994 H5N2 Mê-xi-cô 1995 H7N3 Pakistan 1997 H5N1 Hồng- Kong 1997 H5N2 Ý 1997 H7N4 Úc 1999 H7N1 Ý 2001 H5N1 Hồng- Kong ( Swayne & Halvorson, 2003) Từ cuối năm 2003 đến nay, bệnh cúm gia cầm subtype H5N1 xuất số nước Châu Á, có Việt Nam, sau lan sang nước Châu Á, Trung Đơng Bệnh có nguy lan rộng gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi đe dọa sức khỏe cộng đồng 1    Tại Việt Nam từ tháng 12/2003 đến 12/2005 có ba đợt dịch cúm gia cầm xảy nước Bệnh xảy 57/64 tỉnh thành vào năm 2004 35/64 tỉnh thành vào tháng đầu năm 2005, gây thiệt hại lớn cho kinh tế nước ta II Tổng quan Căn bệnh: a Hình thái, cấu trúc: Virus cúm gia cầm thuộc họ Orthomyxoviridae, chi Influenza virus type A, có dạng đa hình thái, kích thước 80- 120 nm Virus có vỏ bọc lipid, bề mặt bao bọc hai loại gai có chất glycoprotein ( dài 10-14 nm, đường kính 4-6 nm ) haemagglutinin (HA) neuraminidase (NA) Bộ gen RNA sợi đơn, chuỗi âm Cấu trúc gen virus bao gồm tám phân đoạn, mã hóa cho protein: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M NS ( Cox ctv, 2000) Dựa vào phản ứng kết tủa khuếch tán thạch (AGID) sở xác định protein virus, chủ yếu protein NP M1 người ta xếp virus cúm gia cầm vào chi (genus) Influenza virus type A Các phân nhóm (subtype) virus cúm gia cầm xác định dựa cấu trúc protein bề mặt HA NA Đến người ta xác định 2    có tất 16 subtype HA subtype NA phân lập loại dã cầm gia cầm khắp nơi giới qua nhiều giai đoạn khác ( OIE, 2005, Capua Maragon 2007 ) Haemegglutinin (HA) Protein HA đóng vai trò quan trọng liên quan đến khả gây bệnh kích thích sinh kháng thể đặc điểm chức protein định, bao gồm: i) protein bề mặt, có khả bám thụ thể tế bào chứa acid sialic, giúp virus nhân lên gây bệnh, ii) khả gây ngưng kết hồng cầu, iii) kháng nguyên bề mặt, kích thích sinh kháng thể bảo hộ HI có tính đặc hiệu cao giúp định subtype, iv) thường xuyên biến đổi tạo nên tính đa dạng kháng nguyên Khi so sánh trình tự gene chủng virus cúm độc lực khác người ta nhận thấy phân lập virus độc lực cao thường có trình tự gene vị trí cắt HA protease tương ứng với acid amin lặp lại nhiều lần sau RRRKK (AGAAGAAGAAAAAAG) Sự gia tăng độc lực acid amin arginine (R) (và) lysine (K) biểu thị gia tăng độc lực phân lập virus Neuraminidase (NA) Là protein bề mặt, đặc điểm kháng ngun NI có tính đặc hiệu cao, giúp qui định subtype, thường xuyên biến đổi tạo tính đa dạng kháng ngun protein cịn có đặc điểm quan trọng yếu tố nhân lên virus có hoạt tính sialidase, giúp virus phân cắt HA khỏi màng, xâm nhập vào bên tế bào, phóng thích khỏi tế bào sau đâm chồi trình nhân lên virus Nucleoprotein (NP) Là protein bên có tính đặc hiệu virus cúm type A giúp phân biệt với virus cúm type B C Nucleoprotein tạo nên khung cấu trúc xoắn bên virus gắn kết với chuỗi RNA ba polymerase khác 3    Protein matrix (M) Bao gồm M1 M2, M1 protein bên trong, nằm lớp vỏ bọc lipid, gắn kết với ribonucleoprotein, qui định hình dạng virus có tính đặc hiệu cho virus type A, M2 protein bề mặt, giữ vai trò kênh trao đổi ion virus khơi mào cho hoạt tính gắn kết HA Protein khơng cấu trúc (NS) Nằm rải rác M1 Các polymerase: PB1, PB2 (polymerase kiềm), PA (polymerase acid) Những polymerase gắn kết với NP RNA virus, giúp cho trình chép RNA virus (rRNA) PB1 PB2 tham gia vào giai đoạn tổng hợp RNA trung gian virus nhân lên tế bào, PA NP tham gia trình tổng hợp RNA virus b Quá trình tái sản virus   4    • Giai đoạn bám virus lên bề mặt tế bào Nhờ HA virus gắn thụ thể cuả tế bào ký chủ có chứa acid sialic • Giai đoạn xâm nhập vào tế bào Nhờ hoạt tính sialidase, NA phân cắt sialic acid khỏi HA màng tế bào, giúp virus xâm nhập tiếp vào bên tế bào tạo nên hệ nội bào (endosan) • Giai đoạn phá màng Khi vùng bên nguyên sinh chất tế bào, gặp điều kiện acid, protein M2 có hoạt tính kênh trao đổi ion hoạt hóa, cho phép trao đổi ion từ thể nội bào vào bên hạt virus làm phá vỡ mối liên kết protein với dẫn đến phá vỡ màng giải phóng ribonucleoprotein Tiếp theo giai đoạn phân cắt HA enzyme phân hủy protein tế bào kí chủ tạo thành hai tiểu đơn vị HA1, HA2 Đây hai điều kiện tiên để virus có khả gắn kết lây nhiễm • Tổng hợp mRNA Xảy nhân tế bào, ban đầu nhờ đoạn mồi bao gồm từ 10-13 nucleotide tế bào ký chủ Quá trình cần xúc tác enzyme hoạt hóa PB1 PB2 • Quá trình tái RNA virus Xảy nhân tế bào theo kiểu chép khác Từ RNA chuỗi âm virus tạo phiên đầy đủ, chuỗi dương gọi cRNA chuỗi khuôn mẫu để tổng hợp RNA chuỗi âm, tạo nên genome hệ virus • Tổng hợp protein 5    Sau phân tử RNA tổng hợp nhân tế bào chất tổng hợp protein ( HA, NA, NP, PB1, PB2 PA ) Còn mRNA gen NS M trải qua trình gắn kết, sửa chữa để gen tạo hai gen mới, dịch mã tổng hợp protein NS1, NS2, M1, M2 Các protein HA NA đường hóa ( glycosylation ) lưới nội mơ có ribosome, gắn kết hình thành tam phân ( trimer) tứ phân ( tetra) máy golgi, sau chuyển đến màng nguyên sinh chất hình thành nên lớp vỏ hạt virus • Đóng gói hạt virus Tám phân tử RNA hệ virus gắn kết với protein ( NP, PB1, PB2, PA M2) di chuyển đến màng nguyên sinh chất, nơi protein HA, NA, M2 tập kết để đóng gói hình thành hạt virus • Giai đoạn đâm chồi phóng thích khỏi tế bào NA đóng vai trị quan trọng việc phóng thích virus khỏi màng tế bào Protein M1 làm gia tăng gắn kết màng nguyên sinh chất đâm chồi hạt virus c Những loài cảm nhiễm: loài dã cầm, gia cầm, heo, chuột, mèo, loài linh trưởng d Triệu chứng Các triệu chứng cúm gà thường biến đổi không đặc trưng Các triệu chứng theo sau nhiễm bệnh với cúm gà độc tính thấp nhẹ xù lơng, giảm đẻ trứng, cân kết hợp với giảm nhẹ khả hô hấp Kể từ triệu chứng làm cho chẩn đốn đồng trở nên khó khăn, xác định lây lan cúm gà cần phải có thí nghiệm phịng thí nghiệm với mẫu từ gà bị nhiễm Một số chủng cúm Châu Á H9N2 có độc tính cao cho gia cầm gây triệu chứng nặng chết nhiều Ở trạng thái độc nhất, cúm gà gà Tây tạo triệu chứng nặng 100% chết vịng ngày Vì virus lan nhanh điều kiện chật chội 6    trại nuôi gà gà Tây, dịch xảy gây thiệt hại kinh tế nặng cho nông dân nuôi gia cầm Các triệu chứng gà bị nhiễm cúm e Đường lây truyền Virus thải ngồi mơi trường thơng qua chất tiết đường hô hấp, miệng, kết mạc phân Virus truyền lây tiếp xúc trực tiếp thú bệnh thú khỏe hay gián tiếp qua khơng khí hay tiếp xúc vật dụng vấy nhiễm virus Các loài dã cầm đóng vai trị chủ yếu truyền lây virus đầu tiên, sau truyền lây học thơng qua vật dụng bị vấy nhiễm hay vận chuyển thú bệnh hay người 7    Các phương pháp chẩn đoán Các phương pháp chẩn đoán virus cúm thường sử dụng bao gồm: a Chẩn đoán lâm sàng phân biệt với số bệnh khác: Dựa vào triệu chứng, bệnh tích tính chất dịch tễ để xác định bệnh cúm gia cầm với bệnh khác b Chẩn đốn phịng thí nghiệm: Có khả hỗ trợ kết luận nguyên nhân gây bệnh xác Phát virus i) Phát protein hay RNA virus trực tiếp từ mẫu mô Miễn dịch mô gắn kết enzyme sử dụng kháng thể đơn dòng, miễn dịch huỳnh quang (FA) mẫu vết phết kính, ELISA, RT-PCR, real time PCR ii) Phân lập virus có khả thực từ mẫu ngốy hầu, họng hay hậu môn gia cầm sống tổ chức mô gia cầm chết Mẫu phân lập trứng gà có phơi 9-11 ngày tuổi cách tiêm xoang niệu mô, tế bào thường trực (cell line) MDCK, Vero hay tế bào sơ cấp CEF thận gà Để khẳng định virus phân lập cúm gia cầm, làm phản ứng HA ( cần phân biệt với virus khác có HA virus Newcastle, Reovirus…) dương tính tiếp tục định danh phản ứng HI NI với kháng huyết chuẩn RT-PCR hay real time PCR Phát kháng thể Sử dụng phản ứng huyết học ELISA, AGID, HI miễn dịch huỳnh quang (Swayne Halvarsone, 2003; OIE, 2005 Cục thú y, 2004) 8    Phòng chống bệnh cúm gia cầm a Biện pháp an toàn sinh học Chủ động thực biện pháp vệ sinh thú y định kỳ sát trùng chuồng trại, trang thiết bị chăn ni Tăng cường kiểm sốt phương tiện vận chuyển người chăn nuôi vào khu chăn nuôi Cách ly theo dõi đàn gia cầm nhập, không buôn bán gia cầm Thực sách kiểm sốt bệnh, giám sát dịch bệnh b Phòng bệnh vaccine Sử dụng vacine biện pháp hỗ trợ chiến lược tổng thể phòng chống bệnh cúm gia cầm Phòng chống bệnh cúm gia cầm chủ yếu liên quan đến đáp ứng miễn dịch kháng nguyên HA phần NA Trong thực tế, khả bảo hộ vacine nhờ subtype HA vaccine Các loại vaccine thông thường: - Vaccine vô hoạt đồng hồn tồn (inactivated homogeneous vaccines) - Vaccine vơ hoạt khơng đồng hồn tồn (inactivated heterologous vaccines) Các loại vaccine tái tổ hợp: - Vaccine với vector virus đậu gà mang kháng nguyên H5 - Vaccine với vector virus viêm khí quản tùy nhiễm (ILT) Các loại vaccine sử dụng Việt Nam: - Vaccine vô hoạt H5N1, Harbin Weike, Trung Quốc - Vaccine vô hoạt H5N2, Harbin Weike, Trung Quốc - Vaccine vô hoạt Nobilis Influenza H5N2, Intervert, Hà Lan 9    - Vaccine vô hoạt Bioflu H5N9 Merial, Ý - Chủng virus vaccine NIBRG-14 - Vaccine Trovac AIVH5, Meiral, Pháp Vaccine sống tái tổ hợp sử dụng gen H5 virus cúm gia cầm chủng A (turkey/ Ireland/ 1378/ 83H5N8) gắn vào virus đậu Kỹ thuật tạo dòng (cloning) Nguyên lý chung Kỹ thuật tạo dòng trình tái tổ hợp gene đoạn DNA với yếu tố mang (vector: plasmid, phage, cosmid…) có khả nhân lên cách độc lập tế bào chủ ( tế bào chứa yếu tố mang tái tổ hợp: vi khuẩn E.coli, nấm men…) Việc nuôi cấy tế bào chủ điều kiện nhân tạo cho phép thu lượng lớn, trạng thái tinh khiết, gen đoạn DNA chèn vào yếu tố mang Kỹ thuật tạo dòng ứng dụng rộng rãi việc giải trình tự, sản xuất protein dùng nhân y thú y (hormon insuline dùng điều trị bệnh tiểu đường người, hormon tăng trưởng…), sản xuất vaccine ( loại protein tái tổ hợp dùng làm kháng nguyên, loại vaccine DNA…), sản xuất kháng thể đơn dòng… Kỹ thuật tạo dòng thực qua giai đoạn chính: - Xác định đoạn gene (hoặc DNA) cần thiết lựa chọn yếu tố mang thích hợp - Nhân đoạn gene (hoặc DNA) thích hợp với số lượng lớn để đưa vào yếu tố mang - Thu nhận dòng tái tổ hợp kiểm tra chất lượng dòng thu Chủng virus vaccine NIBRG-14 Chủng virus A/Vietnam/ 1194/ 2004 (H5N1) phân lập bệnh nhân nhiễm cúm gia cầm, giống với chủng phân lập loại gia cầm khu vực bề mặt 10    kháng nguyên kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu (HA) mang chuỗi acid amin kiềm đặc trưng chủng gia cầm độc lực cao Thực tế, khó tìm kiếm chủng virus cúm gia cầm không độc lực tương đồng mặt kháng nguyên để sử dụng chủng vaccine Nhờ kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetices), nhà khoa học thuộc Viện kiểm soát tiêu chuẩn sinh học quốc gia (NIBSC), liên hiệp Anh (UK) nghiên cứu phát triển chủng độc lực nhờ sử dụng hệ thống 12 plasmid, gồm: • Hai plasmid mang đoạn gen HA NA virus A/ Vietnam/ 1194/ 2004 (H5N1) • Sáu plasmid mang sáu đoạn gen lại virus cúm PR8 • Bốn plasmid biểu chức hỗ trợ virus PR8 Chuyển nạp plasmid tế bào dòng thận khỉ (Vero) để phát triển thành chủng vaccine virus tái tổ hợp phóng thích vào mơi trường tế bào q trình ni cấy, sau cấy chuyển liên tiếp hai đời phôi gà Nước trứng thu hoạch lần tiêm truyền thứ hai Trứng sử dụng làm chủng vaccine đặt tên chủng NIBRG-14 11    Sơ đồ phát triển chủng virus vaccine kỹ thuật di truyền ngược từ chủng virus A/Vietnam/ 1194/ 2004 Trình tự vị trí cắt HA chủng virus A/ Vietnam/ 1194/ 2004 CCT CAA AGA GAG AGA AGA AGA AAA AAG AGA GCA TTA Ser Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg ↑ Gly Leu Vị trí lặp lại acid amin kiềm Vị trí cắt HA thành HA1, HA2 12    Trình tự vị trí phân cắt HA chủng virus vaccine NIBRG-14 CCT CCA CGA GAG ACG CGA GGA TTA loại bỏ Ser Gln Arg Glu Thr Arg ↑ Gly Leu Vị trí cắt HA thành HA1, HA2 Trong q trình dịng hóa, loại bỏ 15 nucleotide mã hóa cho acid amin kiềm vị trí phân cắt HA nhờ kỹ thuật di truyền Trong đoạn gene NA dịng hóa bình thường mà khơng có thay Sự thay gốc kiềm nhằm hạn chế khả hình thành trở lại chuỗi acid amin kiềm vị trí cắt HA Những nucleotide gạch cuối vị trí có thay nhân tạo Q trình đồng hóa giúp giảm khả đảo nghịch acid amin Sản xuất tiểu đơn vị virus cúm H9N2 Người ta biểu tế bào côn trùng tiểu phần virus bao gồm protein cấu trúc virus cúm A H9N2 A/Hong Kong/1073/99 Với việc nhiễm vào tế bào Sf9 baculovirus tái tổ hợp, protein hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), matrix (M1) đồng thể tế bào nhiễm, tự tập hợp giải phóng ngồi mơi trường ni cấy VLPs of 80–120 nm diameter Các tiểu phần virus biểu đặc điểm chức virus cúm bao gồm gắn hoạt động neuraminidase Trong BALB/c chuột, tiểu phần virus cúm tạo huyết kháng thể chuyên biệt cho virus cúm A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) ức chế nhân lên virus sau thử thách Vì vậy, tiểu phần virus chiến lược tiềm cho việc phát triển vaccine cho người chống lại virus cúm A H9N2 sử dụng chẩn đốn bệnh Tạo dịng gene HA, NA, and M1 Virus cúm A/Hong Kong/1073/99 cung cấp Dr K Subbarao Dr N Cox (Influenza Branch, CDC, Atlanta, GA) RNA virus tách chiết Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA) điều kiện chứa BSL-3 Sự phiên mã ngược 13    PCR sử dụng cho việc thu RNA virus sử dụng hệ thống RT-PCR bước (Invitrogen) với primer oligonucleotide chuyên biệt cho gene Những cặp primer sử dụng cho việc tổng hợp gene HA, NA, M1, tương ứng: 5’-AGGATCCATGGAAACAATATCACTAATAAC-3’ 5’-AGGTACCTTATATACAAATGTTGCATCTGC-3; 5’-AGAATTCATGAATCCAAATCAAAAGATAATA-3’ 5’-CTTATATAGACATGAAATTGATATTC-3’; 5’ -AGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3’ 5’ -AGGTACCTCACTTGAATCTCTGCATTTGC-3’; Theo RT-PCR, đoạn cDNA chứa gen HA, NA, and M1 dịng hóa vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) Những trình tự gen HA, NA, M1 xác định giải trình tự DNA tìm với trình tự thành lập trước (GenBank AJ404626, AJ404629, AJ278647, tương ứng) Sự tạo thành baculovirus tái tổ hợp Gene HA tạo dòng đoạn DNA BamHI-KpnI (1.7 kb) điều khiển promotor AcMNPV polyhedrin vector chuyển bacmid pFastBac1 (Invitrogen) cắt với enzyme BamHI KpnI Cũng tương tự vậy, gene NA M1 tạo dòng đoạn EcoRI-EcoRI DNA (1.4 0.8 kb, tương ứng) cắt EcoRI plasmid pFastBac1 Ba kết plasmid chuyển baculovirus chứa gene virus thiết kế pHA, pNA, pM1 Hình (a) Thể biểu chuyên biệt protein cúm (b) mô tả đồng biểu protein cúm Đã promoter polyhedrin (Polh), vùng tín hiệu polyadenilation, vùng Tn7, gene kháng gentamicin (Gm), gene virus 14    cúm A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) Protein HA, hemagglutinin; NA, neuraminidase; M1, protein chất Sự biểu vector chuyển bacmid gene HA M1 chuẩn bị tạo dòng đoạn DNA SnaBI-HpaI từ plasmid pM1 vùng HpaI pHA Kết plasmid mã hóa cho hai gene HA M1 từ promotor phân tách polyhedrin thiết kế pHAM Cuối cùng, vector chuyển bacmid cho phép biểu gene virus cúm mơ tả tạo dịng đoạn DNA SnaBI-AvrII từ pHAM mà mang biểu hai HA M1 plasmid pNA cắt HpaI-AvrII Kết plasmid pNAHAM, mà mã hóa gene HA, NA, M1, đoạn gene biểu hộp bao gồm promotor polyhedrin trình tự kết thúc phiên mã Ni cấy tế bào nhiễm baculovirus Tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda Sf9 (ATCC CRL-1711) trì dịch ni cấy huyền phù môi trường không huyết côn trùng HyQSFX (HyClone, Logan, UT) 28oC Những đĩa phân lập protein biểu virus cúm khuếch đại tế bào Sf9 nuôi flask lắc với mật độ × 10 tế bào/ml với multiplicity of infection (MOI) = 0.05 Sau 72 nuôi cấy, phần bề mặt nuôi cấy chứa protein tái tổ hợp baculovirus thu hoạch, tách li tâm, trữ 4oC Độ chuẩn hỗn hợp baculovirus tái tổ hợp xác định thí nghiệm đĩa agarose 15    Sự biểu protein Để biểu protein, tế bào Sf9 nhiễm thể tích 200ml 72h với mật độ tế bào 2×10 tế bào/ml với baculovirus tái tổ hợp MOI = Sự biểu xác định điện di SDS–PAGE sử dụng gel polyacrylamide 4-12% (Invitrogen) thuốc nhuộm Coomassie kỹ thuật lai Western blotting sử dụng huyết kháng thể chuyên biệt (không cho protein chuyên biệt) Sự biểu protein HA M1tái tổ hợp M1 xác định miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) sử dụng hỗn hợp tế bào nhiễm với acetone III Kết luận Chủng virus vaccine NIBRG-14 Virus NIBRG-14 có khả nhân lên xoang niệu mơ trứng gà có phơi 10 ngày tuổi khơng gây chết phơi trứng Virus khơng có khả nhân lên nghiên cứu tế bào xơ phôi gà CEF lớp không bổ sung trypsin Virus không gây chết biểu bệnh cho gà vịt tiêm tĩnh mạch cánh vịng 10 ngày theo dõi Virus vơ hoạt đáp ứng miễn dịch tốt có tính hiệu cao virus H5N1 độc lực cao gây bệnh Việt Nam Virus vơ hoạt có khả bảo hộ cho đàn gà vịt tuần tuổi sau tiêm tuần Như chủng virus NIBRG-14 đạt tiêu chuẩn chủng vaccine khả chọn để nghiên cứu sản xuất vaccine vơ hoạt phịng bệnh cúm gia cầm subtype H5N1 độc lực cao tương lai 16    Sản xuất tiểu đơn vị virus cúm H9N2 Sự tinh tiểu phần virus cúm từ phần nuôi cấy tế bào Sf9 li tâm gradient tỉ trọng sucrose (a) phân tích tiểu phần từ tới Western blot sử dụng huyết gà C99-26 chuyên biệt cho H9 (bảng trên) kháng thể đơn dòng chuột MCA401 tới M1 (bảng dưới) Những vị trí protein HA M1 bên phải Virus cúm A/Sydney/5/97 (H3N2) sử dụng đối chứng (không mô tả) (b) Phân tích tiểu phần thử nghiệm hemagglutination (bảng trên) neuraminidase (bảng dưới) Trong hemagglutination, tế bào máu heo guinea sử dụng Thí nghiệm neuraminidase thực sử dụng fetuin chất Dữ liệu mức trung bình tiêu biểu hai thí nghiệm, đường kẻ giá trị độ lệch chuẩn Những kết thu chứng minh tiểu đơn vị virus cúm thu từ tế bào trùng có chứa protein HA, NA, and M1 hứa hẹn vaccine ứng viên cho cúm H9N2 influenza 17    Trong chuột, tiểu phần virus cúm độ chuẩn kháng thể tạo giống với độ chuẩn kháng thể tạo tinh từ tiêm chủng vaccine chứa toàn virus H9N2 xem có khả bảo vệ cho người IV Tài liệu tham khảo Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y NXB Nông nghiệp Phan Xuân Thảo, 2005 Khảo sát đặc điểm dịch tễ bệnh cúm gia cầm địa bàn thành phố Hồ Chí Minh kiểm nghiệm vaccine TROVAC AIV H5 để phòng bệnh Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Dung, 2007 Khảo sát số đặc tính sinh học chủng cúm gia cầm NIBRG-14 Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Trần Xn Hạnh, 2004 Một vài vấn đề phòng bệnh cúm gia cầm vaccine Tạp chí KHKT thú y, tập XI (3) 2004, 84-85 Trương Văn Dung, Nguyễn Viết Không, 2004 Một số hoạt động nghiên cứu khoa học viện thú y quốc gia bệnh cúm gia cầm giải pháp khoa học công nghệ thời gian tới Tạp chí KHKT thú y, tập XI (3), 2004, 62-65 Tơ Long Thành, 2005 Một số thông tin bệnh cúm gia cầm Tạp chí KHKT thú y, tập XI (1) 2005 84-91 http://www.sciencedirect.com http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed   18    ... phố Hồ Chí Minh kiểm nghiệm vaccine TROVAC AIV H5 để phòng bệnh Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Dung, 2007 Khảo sát số đặc tính sinh học. .. cầm NIBRG-14 Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Trần Xuân Hạnh, 2004 Một vài vấn đề phịng bệnh cúm gia cầm vaccine Tạp chí KHKT thú y, tập XI (3) 2004,... thể tạo giống với độ chuẩn kháng thể tạo tinh từ tiêm chủng vaccine chứa tồn virus H9N2 xem có khả bảo vệ cho người IV Tài liệu tham khảo Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y NXB Nông