Application of fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify quickly some marine toxic algae species in Vietnam Luu Xuan Hoa Hanoi University of Science,VNU; Faculty of Biology Major: Genetics; Code: 60 42 70 Supervisors: Ass Prof Dr Dinh Doan Long Date of Presenting Thesis: 2011 Abstract Tổng quan kỹ thuật FISH: khái quát kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (FISH); tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH Việt Nam; bước quy trình lai huỳnh quang chỗ FISH; đặc điểm sinh thái số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu Nghiên cứu vật liệu phương pháp nghiên cứu: địa điểm thu mẫu đối tượng nghiên cứu; phương pháp thu lưu giữ mẫu; phương pháp phân loại hình thái; phương pháp kiểm tra phân loại AND thiết kế đầu dò; phương pháp lai huỳnh quang chỗ Trình bày kết nghiên cứu: kết phân lập phân loại chủng vi tảo độc hại hình thái; ảnh hưởng độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu; kết giải trình tự phân loại ADN mẫu nghiên cứu; tối ưu nhiệt độ lai thử nghiệm đầu dò Keywords Di truyền học; Kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang; Tảo độc; Biển Content MỞ ĐẦU Trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du biển nói chung vi tảo biển độc hại nói riêng, nhiều nhóm lồi sinh vật khó hồn tồn khơng thể phân loại đến lồi phương pháp so sánh hình thái Sự giống nhiều đặc điểm hình thái bên ngồi khó nhận biết đặc điểm khác chúng dễ dẫn đến nhầm lẫn nghiên cứu phân loại Cùng với số lượng lồi lớn có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau, cơng tác nghiên cứu phân loại vi tảo biển nhiều trường hợp gặp nhiều khó khăn, tốn thời gian Những điều gây cản trở công tác nghiên cứu hệ sinh thái biển, đánh giá quản lý nguồn lợi sinh vật biển nói chung nghiên cứu chuyên sâu nhóm lồi nói riêng Kế thừa đặc tính ưu việt kỹ thuật di lai axit nucleic tảng kỹ thuật lai chỗ (in situ hybridization - ISH), kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (fluorescence in situ hydridization - FISH) phát triển Kể từ đời, trở thành cơng cụ mạnh nhiều nghiên cứu sinh học, không lĩnh vực sinh học phân tử tế bào, mà nghiên cứu sinh thái học, môi trường, chẩn đốn nghiên cứu phát sinh lồi Kỹ thuật FISH đời khắc phục nhiều trở ngại nghiên cứu phân loại sinh vật Các trở ngại, vấn đề khó khăn phân loại hình thái, nhược điểm thời gian phân tích kéo dài, yêu cầu đòi hỏi lượng mẫu lớn hay yêu cầu môi trường nuôi cấy đặc chủng để sàng lọc lồi… khắc phục kỹ thuật FISH Bên cạnh đó, kỹ thuật này, nhà nghiên cứu khơng phân tích định tính mà cịn định lượng xác số lượng tế bào sinh vật, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường vi sinh vật Kỹ thuật FISH đặc biệt hữu ích nghiên cứu phân loại sinh vật phù du môi trường biển nói chung lồi tảo độc hại nói riêng Nhằm bước ứng dụng kỹ thuật FISH để giải khó khăn phân loại lồi vi tảo độc hại biển, tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang (FISH) nhằm xác định nhanh số loài tảo độc hại biển Việt Nam” Kết mong đợi đề tài giúp cho việc nghiên cứu đánh giá, quan trắc biến động loài vi tảo độc hại, cảnh báo tượng ô nhiễm môi trường biển (như thủy triều đỏ) trở nên thuận tiện, nhanh chóng hiệu PHẦN TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT FISH 1.1 Các bƣớc quy trình lai huỳnh quang chỗ - FISH Sự đời kỹ thuật FISH dựa cải tiến kỹ thuật ISH đời kết hợp xác phép lai đoạn oligonucleotit (đầu dị) có gắn tín hiệu huỳnh quang với trình tự ADN đích đặc trưng Bằng quan sát trực quan từ kính hiển vi huỳnh quang, phân tử huỳnh quang phát sáng với màu sinh động cho phép hiển thị đoạn ADN, nhiễm sắc thể hay tế bào đích Nhờ mà nhà nghiên cứu nhận dạng, liệt kê định vị tế bào sinh vật mẫu môi trường tự nhiên hay mơ bệnh phẩm Quy trình bao gồm bước sau: - Bước 1: Chuẩn bị mẫu đầu dị có trình tự nucleotit bổ sung đặc hiệu với trình tự đặc hiệu cần nhận biết - Bước 2: Cố định mẫu nghiên cứu - Bước 3: Lai đầu dị trình tự đích đặc hiệu nằm tế bào mẫu - Bước 4: Rửa mẫu để loại bỏ đầu dị khơng lai (đầu dò tự do) - Bước 5: Hiển thị, quan sát phân tích kết kính hiển vi huỳnh quang 1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH Việt Nam Cho đến nay, Việt Nam, kỹ thuật FISH chủ yếu nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực y học Một số nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đốn trước sinh kỹ thuật FISH tiến hành Các nghiên cứu dựa trình tự ADN đích thuộc nhiễm sắc thể nhằm phát cách xác bất thường nhiễm sắc thể (NST) tương ứng với bệnh di truyền quan tâm (Đặng Thị Hồng Nhung cộng sự, 2008) Trong số nghiên cứu khác, ứng dụng kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang dùng để chẩn đoán trước sinh hội chứng Đao, hội chứng Tớc-nơ cho kết thành công Kết nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ cho kết xác so sánh với phương pháp phân tích nhiễm sắc thể tế bào ối (Trần Thị Thu Hương cộng sự, 2005; 2006) Bên cạnh đó, nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH việc phát lệch bội nhiễm sắc thể số 13, 18, 21, X, Y từ tế bào dịch ối kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ thành cơng Trên sở phân tích mẫu thu từ phụ nữ mang thai giai đoạn 17 - 25 tuần có nguy cao bị dị tật, kỹ thuật FISH giúp phát trường hợp mắc hội chứng Patau (trisomy 13), trường hợp mắc hội chứng Đao (trisomy 21), trường hợp bất thường cánh dài NST 16 Kết cho thấy 100% mẫu kết FISH phù hợp với kết phân tích NST liên quan đến NST số 13, 18, 21, X, Y Quy trình chuẩn nhằm chẩn đoán trước sinh chọc ối làm xét nghiệm FISH an toàn hoàn thiện (Nguyễn Thị Tân Sinh cộng sự, 2011) Sử dụng kỹ thuật FISH nhằm phát khuếch đại gen NMYC bệnh nhân u nguyên bào thần kinh tiến hành bệnh viện Nhi trung ương cho kết tốt đẹp Một số biến đổi di truyền u nguyên bào thần kinh có ý nghĩa quan trọng việc lựa chọn phác đồ điều trị tiên lượng bệnh, khuếch đại gen NMYC xem yếu tố quan trọng tìm thấy Kết thành cơng có ý nghĩa quan trọng hỗ trợ bác sỹ lâm sàng việc phân nhóm bệnh nhân lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp (Vũ Đình Quang cộng sự, 2010) Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ FISH loài sinh vật thủy sinh Việt Nam gần Trong nghiên cứu gần Viện nghiên cứu hải sản ứng dụng kỹ thuật FISH cho việc nhận diện nhanh loài tảo giáp độc hại A tamarense A catenella, số thử nghiệm tiến hành Các trình tự đích thuộc vùng D1- D2 nhiễm sắc thể mã hóa cho tiều phần lớn LSU ribosome loài lấy làm sở thiết kế đầu dị Tín hiệu huỳnh quang FITC thiết kế gắn với đầu dò đặc hiệu Kết nghiên cứu cho thấy trùng lặp, giống đặc điểm hình thái lồi tảo giáp gây khó khăn quan trắc tảo độc hại phần giải nhờ kỹ thuật FISH Đây sở ban đầu cho việc ứng dụng kỹ thuật quan trắc cảnh báo bùng phát đối tượng thủy sinh gây thủy triều đỏ Việt Nam (Nguyễn Văn Nguyên cộng sự, 2011) PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm thu mẫu đối tƣợng nghiên cứu Hai mẫu tảo độc hại thu vùng biển Cát Bà – Hải Phòng, gồm có: + Mẫu A sp6 (Alexandrium affine) thu vào ngày 20/7/2010 khu vực cửa biển thuộc Bến Bèo (Cát Bà, Hải Phịng) với điều kiện mơi trường sau: độ mặn nước biển: 27‰, pH 7,72 + Mẫu A sp7 (Alexandrium pseudogonyaulax) thu vào ngày 27/4/2011 khu vực vịnh cảng Cát Bà (Hải Phòng) với điều kiện môi trường nước biển sau: độ mặn nước biển: 29‰, pH 7,44 2.2 Phƣơng pháp thu lƣu giữ mẫu Mẫu thu lưới thu thực vật phù du có đường kính 20cm, kích thước mắt lưới 20µm, thu theo phương thẳng đứng Mẫu sau bảo quản lọ giữ điều kiện nhiệt độ từ – 15oC Mẫu sau chuyển phịng thí nghiệm để phân lập (Hallegraeff cộng sự, 1995; Anderson, 1995) 2.3 Phân lập chủng vi tảo Theo phương pháp thu tế bào đơn lẻ micropipet Richmon (2004) Andersen (2005): Môi trường nuôi sử dụng môi trường IMK (Daigo IMK – mua từ hãng Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) dành cho nhóm tảo giáp (Alexandrium) 2.4 2.5 Phƣơng pháp ni giữ chủng vi tảo biển Theo Shoko cộng (2005); Nguyễn Văn Nguyên cộng (2011): Cường độ chiếu sáng: 2.500 lux, hệ thống ánh sáng trắng (đèn neon); Chế độ chiếu sáng: 13h sáng liên tục/11h tối liên tục, điều khiển đồng hồ đóng ngắt tự động; Nhiệt độ ni: ổn định 24oC liên tục buồng có điều hịa nhiệt độ; Mơi trường ni: IMK Phƣơng pháp phân loại hình thái Phân loại mẫu tảo giáp thực chủ yếu dựa vào công thức vỏ tế bào nhuộm Calco - fluor, quan sát kính hiển vi quang học Các tài liệu để phân loại là: Balech (1995), Abe (1967a,b), Larsen cộng (2004) Phƣơng pháp chuẩn bị ADN khuôn cho PCR 2.6 Các ống mẫu chứa tế bào sốc nhiệt qua lại lần -20oC 90oC thời gian 20 giây điều kiện, nhằm làm vỡ tế bào dung giải ADN Các mẫu lắc rung (votex) ly tâm trở lại (5.000vòng/phút) chuẩn bị cho phản ứng PCR (Sebastián cộng (2001) Phƣơng pháp Singel cell PCR 2.7 Theo Sebastián cộng (2001); Shoko cộng (2005): Phản ứng PCR tiến hành lần để nhân vùng D1 – D2 gen mã hóa tiểu đơn vị lớn 28s ARN ribosome Cặp mồi dùng cho PCR lần 1: S1R (5’-TACCTGG TTGATCCTG CCAG-3’) 28-1483R (5’GCTACTACCACCAAGATCTGC-3’) Cặp mồi dùng cho PCR lần là: D1R (5’ACCCGCTGAATTTAAGCATA-3’) D2C (5’-CCTT GGTCCGTTTCAAGA-3’) Phƣơng pháp kiểm tra phân loại ADN 2.8 Giải trình tự ADN vùng D1-D2 máy Applied Biosystems 3130 Series Xây dựng phát sinh chủng loại theo phương pháp kết nối lân cận (neighbor joining) sử dụng thuật toán Jukes-Cantor với độ lặp lại 1000 lần Cây phát sinh chủng loại xây dựng phần mềm Mega phiên 5.03 Phƣơng pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu 2.9 Sử dụng công cụ ClustalW, phần mềm BioEdit để xếp, so sánh trình tự nucleotit thu với trình tự lồi gần gũi mặt phân loại Trên sở đó, lựa chọn đoạn ADN đặc trưng cho loài để thiết kế đầu dò Đầu dò chế tạo với yêu cầu gắn thêm chất phát huỳnh quang fluorescein isothiocyanate (FITC) đầu 5’ hiển thị diện trình tự đặc trưng 2.10 Phƣơng pháp lai huỳnh quang chỗ (dựa theo phương pháp Shoko cộng (2005)):  Mẫu đưa vào ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút phút 4oC)  Cố định tế bào 1ml dung dịch PBS (5x) Ly tâm thu mẫu loại nước mẫu dung dịch ethanol 50% 80% Ly tâm thu tế bào, lai với đầu dò dung dịch Formamide (40%), SSC (5x) thang nhiệt độ khác nhau: 37°C, 40°C, 43°C, 46°C, 49°C, 52°C phút - Mẫu rửa lần SSC (5x) Tế bào lai huỳnh quang sau quan sát kính hiển vi huỳnh quang PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập phân loại chủng vi tảo độc hại hình thái Trên sở mẫu thu từ vùng biển Cát Bà, chủng vi tảo độc hại phân lập, nuôi giữ phân loại sơ dựa đặc điểm hình thái Hai lồi tảo giáp xác định sơ thuộc chi Alexandrium bao gồm: 3.1.1 Lồi Alexandrium affine Hình dạng ngồi tế bào (A); Tấm 1' với lỗ bụng tổ hợp lỗ đỉnh (B, C); Tấm S.a hình thang, khơng có phần phụ (D) 3.1.2 Lồi A pseudogonyaulax Tấm 1’ hình cạnh, khơng liên kết với lỗ bụng có lỗ bụng lớn tròn tiếp giáp với mép; vài tế bào, lỗ bụng vị trí tiếp giáp 1’-4’6” 3.2 Ảnh hƣởng độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu Trong điều kiện ni có độ mặn 30‰ (cường độ chiếu sáng 2500lux, chế độ chiếu sáng 13 sáng: 11 tối) loài A affine phát triển tốt chế độ ni cấy Đối với lồi A pseudogonyaulax, kết thí nghiệm cho thấy, điều kiện độ mặn thuận lợi cho sinh trưởng phát triển chúng với điều kiện phịng thí nghiệm nêu 29‰ 3.3 Kết giải trình tự phân loại ADN mẫu nghiên cứu Ở mẫu thí nghiệm, đoạn mồi D1R, D2C nhân đoạn ADN có kích thước tương ứng với đoạn dự kiến Vùng D1-D2 mẫu L3 (xác định hình thái A affine) có kích thước gồm 651bp Đối với mẫu L4 (xác định hình thái A pseudogonyaulax), vùng D1-D2 có trình tự bao gồm 650 bp Kết phân tích BLAST trình tự nói khẳng định hai loài A affine A pseudogonyaulax Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang chỗ Phần mềm Bioedit sử dụng để xếp, so sánh với trình tự tham khảo (từ NBCI) vùng tương đồng D1 - D2 loài thuộc chi Alexandrium Những khác biệt từ trình tự bảo thủ so với loài khác sở cho việc chọn lọc trình tự phù hợp để thiết kế đầu dị đặc hiệu cho loài Kết xếp so sánh lồi A affine tìm trình tự nucleotit từ vị trí 657 đến 676 phù hợp để thiết kế đầu dị Trình tự đầu dị cho loài A affine xác định là: 5’-TGTAAGCTCTAGTAGGGTAG-3’ Tương tự vậy, kết so sánh trình tự đoạn D1 – D2 loài A pseudogonyaulax tìm trình tự 774 đến 794 phù hợp cho thiết kế đầu dị đặc trưng cho lồi Trình tự đầu dò xác định là: 5’-ACAGCTGACAATCGCAA TTG-3’ Các trình tự sau đặt sản xuất cơng ty TOS (Nhật Bản) với điều kiện có gắn tín hiệu Fluorescein 5-isothiocyanate (FITC) vào đầu 5’ để phục vụ cho thí nghiệm lai huỳnh quang 3.4 3.5 Tối ƣu nhiệt độ lai thử nghiệm đầu dò Trên sở đầu dò thiết kế được, thí nghiệm lai huỳnh quang chỗ kiểm tra cho loài A affine A pseudogonyaulax tiến hành Kết thử nghiệm cho thấy, có tương đối giống nhiệt độ lai lai đầu dò hai đối tượng vi tảo Đối với loài A affine, nhiệt độ lai phù hợp 40°C 43°C Trong đó, tín hiệu huỳnh quang thu rõ nét 43°C Tương tự loài A pseudogonyaulax, kết thử nghiệm cho thấy, mẫu lai nhiệt độ 43°C cho kết tốt nhất, hình ảnh sắc nét 3.6 Thử nghiệm đầu dò với mẫu vi tảo thu tự nhiên Nhằm hoàn thiện ứng dụng kỹ thuật này, thử nghiệm lai huỳnh quang với mẫu thu tự nhiên tiến hành với nhiệt độ lai 43°C Kết cho thấy, số 32 mẫu thu từ biển Cát Bà, đầu dị cho lồi A affine phát 17 mẫu có diện lồi với mật độ tế bào khác (Hình 3.11) Trong 15 mẫu cịn lại, đầu dị khơng tìm trình tự đích Trong đó, số phân tích thành phần mẫu thu thành phần lồi nhóm Alexandrium Lai đầu dị A affine với mẫu tự nhiên Các mũi tên tế bào A affine ánh sáng thường (trái) phát với màu xanh đặc trưng (phải) Lai đầu dò A pseudogonyaulax với mẫu tự nhiên Các mũi tên tế bào A pseudogonyaulax ánh sáng thường (trái) phát với màu xanh đặc trưng (phải) Quy trình lai huỳnh quang chỗ (FISH) sử dụng đầu dị rARN có gắn tín hiệu FITC hai loài A affine A pseudogonyaulax tổng hợp lại đề nghị sau:  Mẫu (5000-7000 tế bào/ml) đưa vào ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút phút, 4oC)  Cố định tế bào 1ml dung dịch PBS (5x) có chứa paraformandehyde (4%), để mẫu đá lạnh phút  Ly tâm mẫu 3000vòng/phút phút (4oC)  Loại nước mẫu theo bước: - Thêm 1ml dung dịch ethanol 50% vào mẫu, ủ đá phút Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút phút, 4oC) - Thêm 1ml dung dịch ethanol 80% vào mẫu, ủ đá phút Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút phút, 4oC)  Thêm 500µl dung dịch lai (gồm: Formamide (40%), SSC (5x), mẫu dị có gắn huỳnh quang (50 pmol))  Lai tế bào 43°C phút  Sau lai, mẫu rửa lần: - Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu 50oC phút Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút phút, 4oC) - Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu 50oC phút Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút phút, 4oC) Sản phẩm lai huỳnh quang sau quan sát kính hiển vi huỳnh quang (ECLIPSE E800, Nikon, Tokyo, Japan) với kính lọc sắc B-2A, bước sóng kích thích tín hiệu FITC 490 nm, hiển thị chụp ảnh tế bào camera DS Nikon Tổng thời gian thao tác cho q trình tính tốn khoảng 2,5 Điều cho phép thí nghiệm nghiên cứu phát loài vi tảo biển độc hại xác, nhanh nhiều so với phương pháp phân tích truyền thống hình thái trước KẾT LUẬN Chúng rút số kết luận sau từ nghiên cứu này: Đã xác định trình tự gen vùng mã hóa cho đoạn D1 – D2 tiểu phần lớn (LSU) thuộc ribosome hai loài tảo giáp độc hại A affine A pseudogonyaulax biển Việt Nam Đã thiết kế thử nghiệm thành cơng hai đầu dị phân tử gắn tín hiệu huỳnh quang FITC phục vụ cho ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ hai loài tảo độc A affine A pseudogonyaulax biển Việt Nam Các đầu dị hoạt động tốt mẫu ni cấy mẫu thu tự nhiên đầu dị đảm bảo tính đặc hiệu lồi Đã ứng dụng thành công kỹ thuật FISH việc xác định nhanh chóng xác lồi tảo độc hại biển Việt Nam nói trên, làm sở cho việc ứng dụng phương pháp quan trắc, đánh giá nhanh mơi trường biển, nghiên cứu dự đốn diễn biến thủy triều đỏ vùng ven biển Việt Nam sau KIẾN NGHỊ Cần nghiên cứu thiết kế thêm đầu dò nhằm ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang để nhận diện nhanh, nhiều loài tảo biển độc hại khác vùng biển ven biển Việt Nam Cần có nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật di truyền việc quan trắc, phân loại nhanh loài vi tảo biển Việt Nam nhằm theo dõi thường xuyên, đánh giá nhanh biến đổi môi trường gây thủy triều đỏ tảo biển độc hại gây ra, hạn chế thiệt hại nuôi trồng thủy sản ven biển References Tài liệu tiếng Việt Trần Thị Thu Hương, Hoàng Thu Lan, Trần Thị Ngọc Lan, Trịnh Đức Cường (2005), “Ứng dụng kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang để chẩn đoán trước sinh hội chứng down”, Tạp chí y học thực hành, 11, tr 9-11 2 Trần Thị Thu Hương, Hoàng Thu Lan, Trần Thị Ngọc Lan, Trịnh Đức Cường, Nguyễn Thị Quỳnh Thơ (2006), “Chẩn đoán trước sinh hội chứng Down, hội chứng Turner kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang kết hợp phân tích nhiễm sắc thể tế bào ối”, Tạp chí nghiên cứu y học, 1, tr 4-8 Nguyễn Văn Nguyên, Lê Thanh Tùng, Lưu Xuân Hịa, Vũ Tuấn Nam, Vũ Minh Hào, Đinh Thái Bình (2011), “Thử nghiệm kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ F.I.S.H nhận diện nhanh chuẩn xác số loài tảo giáp độc hại”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học cơng nghệ biển tồn quốc lần thứ V, Quyển - Sinh học nguồn lợi biển, tr 261-268 Đặng Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc (2008), “Áp dụng kỹ thuật huỳnh quang chỗ phát bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể Bệnh viện Nhi Trung ương”, Tạp chí nghiên cứu y học, 57, tr 57-62 Vũ Đình Quang, Ngơ Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai, Đinh Thị Hồng Nhung, Phùng Tuyết Lan, Trần Đức Hậu, Trần Ngọc Sơn, Nguyễn Thanh Liêm (2010), “Đánh giá khuếch đại gen NMYC bệnh nhân Neuroblastoma”, Tạp chí Nhi khoa, (3), tr 358-363 Nguyễn Thị Tân Sinh, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Đinh Thị Hồng Nhung, Lê Thị Liễu, Nguyễn Thanh Liêm (2011), “Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ chẩn đoán trước sinh lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp”, Tạp chí Y học lâm sàng, số đặc biệt, tháng 2, tr 253-258 Chu Văn Thuộc (2002), “Nghiên cứu thành phần loài, phân bố thăm dò khả gây hại số loài tảo độc hại (harmful algae) thuộc ngành tảo giáp (Dinophyta) vùng cửa sông, ven biển miền Bắc Việt Nam”, Luận án tiến sĩ ngành sinh học, Viện nghiên cứu hải sản Tài liệu tiếng Anh Abé, T H (1967a), “The armoured Dinoflagellata: II Prorocentridae and Dinophysidae (A)”, Publ Seto Mar Biol., 14(5), pp 369 - 389 Abé, T H (1967b), “The armoured Dinoflagellata: II Prorocentridae and Dinophysidae (B), Dinophysis and its allied genera”, Publ Seto Mar Biol., 15(1), pp 37 - 78 10 Adachi M., Sako Y., Ishida Y (1996), “Analysis of Alexandrium (Dinophyceae) species using sequences of the 5,8S ribosomal DNA and internal transcribed spacer regions” J Phycol, 32, pp 424–432 11 Alfreider A., Pernthaler J., Amann R., Sattler B., Glöckner F O., Wille A., and Psenner R (1996), “Community analysis of the bacterial assemblages in he winter cover and pelagic layers of a high mountain lake by in situ hybridization”, Appl Environ Microbiol, 62, pp: 2138 2144 12 Amann R., Fuchs B M., Beherens S (2001), “The identification of microorganisms by fluorescence in situ hybridization”, Curr Opin Biotechnol., 12, pp 231 – 236 13 Andersen, G (2005), “Traditional Microalgae Isolation Techniques, Algal cuturing techniques”, Phycologycal society of America, 578p 14 Anderson, P (1996), “Design and implementation of some harmful agal monitoring system”, IOC Technical Series, 44, UNESCO 15 Anderson, D.M (1995), “Identification of harmful algal species using molecular probes, an emerging technology”, Harmful Marine Algal Blooms, Lavoiser Science Publishers, pp 3–13 16 Balech, I (1995), “The genus Alexandrium Halim (Dinoflagellata)”, Trans Am Microscop Soc., 113, pp 216 - 220 17 Baoyu Z., Guofu C., Guangce W., Douding L (2010), “Identification of two Skeletonema costatum-like diatoms by fluorescence in situ hybridization” Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 28(2), pp 310 - 314 18 Benedetta B., Danilo E., Monica G., Erasmo N (2006), “Application of FISH technology for microbiological analysis: current state and prospects”, Appl Microbiol Biotechnol., 73, pp 485 – 494 19 Bouvier T., Del G (2003), “Factors influencing the detection of bacterial cells using fluorescence in situ hybridization (FISH)”, FEMS Microbiol Ecol., 44, pp – 15 20 Cho E S., Hur H J., Byun H S., Lee S G., Rhodes L L., Jeong C S and Park J G.(2002), “Monthly monitoring of domoic acid producer Pseudo-nitzschia multiseries (Hasle) Hasle using species-specific DNA probes and WGA lectins and abundance of Pseudo-nitzschia species (Bacillariophyceae) from Chinhae Bay”, Korea Bot Mar., 45, pp 364 - 372 21 Choi, B K (1994), “Diversity of cultivable and uncultivable oral spirochetes from a patient with severe destructive periodontitis” Infect Immun., 62, pp 1889 – 1895 22 Choong J K., Yoshihiko S (2005), “Molecular identification of toxic Alexandrium tamiyavanichii (Dinophyceae) using two DNA probes”, Harmful Algae, 4, pp 984 - 991 23 Deere, D (1998), “Evaluation of fluorochromes for flow cytometric detection of Cryptosporidium parvum oocysts labelled by fluorescence in situ hybridization”, Lett Appl Microbiol., 27, pp 352 – 356 24 DeLong, E F (1989), “Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single microbial cells”, Science, 243, pp 1360 –1363 25 DeLong E F., Taylor L T., Marsh T L and Preston C M (1999), “Visualization and enumeration of mMarine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes and fluorescent in situ hybridization”, Applied and Environmental Microbiology, 65, pp 5554 - 5563 26 Felske, A (1998), “In situ detection of an uncultured predominant Bacillus in dutch grassland soils”, Appl Environ Microbiol., 64, pp 4588 – 4590 27 Fuchs B M., Syutsubo K., Ludwig W., Amann R (2000), “In situ accessibility of Escherichia coli 23S rRNA to fluorescently labeled oligonucleotide probes”, Appl Environ Microbiol., 67, pp 961 – 968 28 Gersdorf H (1993a), “Identification of bacteroides forsythus in subgingival plaque from patients with advanced periodontitis”, J Clin Microbiol., 31, pp 941 – 946 29 Gersdorf, H (1993b), “Fluorescence in situ hybridization for direct visualization of Gramnegative an aerobes in subgingival plaque samples”, FEMS Immunol Med Microbiol., 6, pp 109 – 114 30 Glockner, F O (1996), “An in situ hybridization protocol for detection and identification of planctonic bacteria”, Syst Appl Microbiol., 19, pp 403 – 406 31 Glöckner F O., Fuchs B M and Amann R (1999), “Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization”, Appl Environ Microbiol., 65, pp 3721 - 3726.Hallegraeff G M., Anderson D M., Cembella A D., Enevoldsen H O (1995), “Manual on harmful marine microalgae, IOC Manual and Guides”, UNESCO, 33, 794p 33 Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J Clin Microbiol., 38, pp 818 – 825 34 Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J Clin Microbiol 38, pp 818 – 825 35 Hougaard D M., Hansen H and Larsson L I (1997), “Non-radioactive in situ hybridization for mRNA with emphasis on the use of oligodeoxynucleotide probes”, Histochem Cell Biol., 108, pp 335 - 344 36 Inacio J., Beherens S., Fuchs B M., Fonseca A., Spencer M I., Amann R (2003), “In situ accessibility of Saccharomyces cerevisiae 26S rRNA to Cy3-labeled oligonucleotide probes comprising the D1 and D2 domains”, Appl Environ Microbiol., 69, pp 2899 – 2905 37 Jansen, G J (2000), “Rapid identification of bacteria in blood cultures by using fluorescently labeled oligonucleotide probes”, J Clin Microbiol., 38, pp 814 – 817 38 Jeffrey M L and Robert H S (2003), “Fluorescence in situ hybridization: past, present and future”, Journal of Cell Science, 116, pp 2833 – 2838 39 Johannes Z., Wolfgang L., Karl H S (2001), “DNA polynucleotide probes generated from representatives of the genus acinetobacter and their application in fluorescence in situ hybridization of environmental samples”, System Appl Microbiol., 24, pp 238 – 244 40 Kagiyama, N (1993), “A novel fluorescent method for in situ hybridization”, Acta Histochem Cytochem., 26, pp 441 – 445 41 Kempf, V A (2000), “Fluorescent in situ hybridization allows rapid identification of microorganisms in blood cultures”, J Clin Microbiol., 38, pp 830 – 838 42 Kenzaka, T (1998), “rRNA targeted fluorescent in situ hybridization analysis of bacterial community structure in river water”, Microbiology, 144, pp 2085 – 2093 43 Kim C J., Kim C H., Sako Y (2005), “Development of molecular identification method for genus Alexandrium (Dinophyceae) using whole-cell FISH”, Marine Biotechnology, 7, pp 215 – 222 44 Langendijk P S, Schut F., Jansen G J., Raangs G C., Kamphuis G R., Wilkinson M H F., Welling G W (1995), “Quantitative fluorescence in situ hybridization of Bifidobacterium spp with genus-specific 16S rRNA-targeted probes and its application in faecal samples”, Appl Environ Microbiol., 61, pp 3069 – 3075 45 Larsen J and Nguyen N L (2004), “Potentially toxic microalgae of Vietnamese waters”, Opera Botanica, 140, 216p 46 Llobet B., Rosselló M., and Amann R (1998), “Microbial community composition of wadden sea sediments as revealed by fluorescence in situ hybridization”, Appl Environ Microbiol., 64, pp 2691 - 2696 47 Manuelidis L., Langer P R and Ward D C (1982), “High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes”, J Cell Biol., 95, pp 619 - 625 48 Michael H., Ralph W., Georg H., Jutta F., Andrea W., Alexander R., Eberhard S., Siegfried J., Christoph C (2003), “COMBO-FISH: specific labeling of nondenatured chromatin targets by computer-selected DNA oligonucleotide probe combinations”, BioTechniques, 35(3), pp 564 – 577 49 Miller P E., Scholin C A (2000), “On detection of Pseudo-nitzschia (Bacillariophyceae) species using whole cell hybridization: sample fixation and stability”, J Phycol., 36, pp 238 – 250 50 Miller P E., Scholin C A (1996), “Identification of cultured Pseudonitzschia (Bacillariophyceae) using species-specific LSU rRNAtargeted fluorescent probes”, J Phycol., 32, pp 646 – 655 51 Miller P E., Scholin C A (1998), “Identification and enumeration of cultured and wild Pseudo-nitzschia (Bacillariophyceae) using species-specific LSU rRNA-targeted fluorescent probes and filter-based whole cell hybridization”, J Phycol., 34, pp 371 – 382 52 Moter, A (1998), “Molecular epidemiology of oral treponemes associated with periodontal disease”, J Clin Microbiol., 36, pp 1399 – 1403 53 Niels B R., Henrik F., Timothy G F., Finn A., Bo T (1996), “Distribution of bacterial populations in a stratified fjord (Mariager Fjord, Denmark) quantified by in situ hybridization and related to chemical gradients in the water column”, Appl Environ Microbiol., 62, pp 1391 – 1404 54 Pardue, M L (1969), “Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations”, Proc Natl Acad Sci., 64, pp 600 –604 55 Pernthaler J., Glöckner F O., Schönhuber W., and Amann R (2001), “Fluorescence in situ hybridization (FISH) with rRNA-targeted oligonucleotide probes”, Methods in Microbiology: Marine Microbiology, 30, pp 207 – 210 56 Puvion D., and Puvion E., (1996), “Non-isotopic electron microscope in situ hybridization for studying the functional sub-compartmentalization of the cell nucleus”, Histochem Cell Biol., 106, pp 59 - 78 57 Richmon, A (2004), “Handbook of Microalgal culture: Biotechnology and Applied Phycology”, Blackwell Science, 577p 58 Rudkin G T., and Stollar B D (1977), “High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence”, Nature, 265, pp 472-473 59 Scholin C., Miller P E., Buck K., Chavez F., Harris P., Haydock P., Howard J (1997), “Detection and quantification of Pseudo-nitzschia australis in cultured and natural populations using LSU rRNA-targeted probes”, Limnol Oceanogr 42(5), pp 1265 –1272 60 Shoko H T., Sako Y (2005), “Rapid detection of natural cells of Alexandrium tamarense and A catenella (Dinophyceae) by fluorescence in situ hybridization”, Harmful Algae, 4, pp 319 – 328 61 Singer R H., and Ward D C (1982), “Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog”, Proc Natl Acad Sci., 79, pp 7331 - 7335 62 Sebatián C R., and Ryan C O’ (2001), “Single-cell sequencing of dinoflagellate (Dinophyceae) nuclear ribosomal genes”, Molecular Ecology Resources, 1(4), pp 329-331 63 Tanabe S H., Sako Y (2006), “Development and application of fluorescence in situ hybridization (FISH) method for simple and rapid identification of the toxic dinoflagellates Alexandrium tamarense and Alexandrium catenella in cultured and natural seawater”, Fishersies science, 72(1), pp 77 - 82 64 Trebesius K., Amann R., Ludwig W., Mühlegger K., and Schleifer K (1994),“ Identification of whole fixed bacterial cells with nonradioactive 23S rRNA-targeted polynucleotide probes”, Appl Environ Microbiol 60, pp 3228 - 3235 65 Wagner M., Schmid S J., Trebesius K., Bubert A., Goebel W., and Schleifer K (1998), “In situ detection of a virulence factor mRNA and 16s rRNA in Listeria monocytogenes”, FEMS Microbiology Letters, 160, pp 159 - 168 66 Werner M., Rudolf A., Wolfgang L., Marc V., and Karl H S (1996), “Application of a suite of 16s rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment”, Microbiology, 142, pp 1097 – 1106 67 Yamaguchi, N (1996) “Detection of specific bacterial cells with 2-hydroxy-3-naphthoic acid-29-phenylanilide phosphate and Fast Red TR in situ hybridization”, Appl Environ Microbiol., 62, pp 275–278 68 Ylmaz L S., Hatice E O., Noguera D R (2005), “Making all parts of the 16S rRNA of Escherichia coli accessible in situ to single DNA oligonucleotides”, Appl Environ Microbiol., 72, pp 733 – 744 69 Zarda, B (1991), “Identification of single bacterial cells using digoxigeninlabelled, rRNA-targeted oligonucleotides”, J Gen Microbiol., 137, pp 2823 – 2830  ... lồi tảo độc hại nói riêng Nhằm bước ứng dụng kỹ thuật FISH để giải khó khăn phân loại loài vi tảo độc hại biển, tiến hành đề tài ? ?Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang (FISH) nhằm xác định nhanh. .. vùng ven biển Việt Nam sau KIẾN NGHỊ Cần nghiên cứu thiết kế thêm đầu dò nhằm ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang để nhận diện nhanh, nhiều loài tảo biển độc hại khác vùng biển ven biển Việt Nam Cần... hai loài tảo giáp độc hại A affine A pseudogonyaulax biển Việt Nam Đã thiết kế thử nghiệm thành công hai đầu dị phân tử gắn tín hiệu huỳnh quang FITC phục vụ cho ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang