Tổng hợp chất, chế tạo kít nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhuộm tế bào phục vụ chẩn đốn bệnh ung thư bạch cầu Trần Văn Tính Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận án TS ngành: Hóa học hữu cơ; Mã số: 62 44 27 01 Người hướng dẫn: PGS.TSKH Lưu Văn Bôi, GS.TS Nguyễn Anh Trí Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Nghiên cứu tổng hợp 3-hiđroxi-(Nthế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu điều chế chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người Nghiên cứu tổng hợp este 3-(N-thếcacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người Xác định cấu trúc hợp chất điều chế phương pháp vật lý hóa lý đại (Phổ IR, 1HNMR MS) nghiên cứu mối tương quan độ nhạy phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử chất phương pháp tính hóa lượng tử Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thếcacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người tìm kiếm chất có độ đặc hiệu độ nhạy cao Nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron nhóm X, hiệu ứng khơng gian gốc N-hiđrocacbon nhóm amit gốc cacboxylat phân tử chất đến độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng nhuộm esteraza Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm phương pháp đơn hình ứng dụng để chế tạo kít nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào bệnh bạch cầu người từ chất tổng hợp Keywords: Hóa hữu cơ; Tổng hợp chất; Chế tạo kit; Nhuộm tế bào; Ung thư bạch cầu Content MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện việc phân loại dòng tế bào ung thư máu theo tiêu chuẩn nhà khoa học Pháp, Mỹ Anh (gọi tắt tiêu chuẩn FAB) chủ yếu dựa kết ba phương pháp: đánh dấu, miễn dịch nhuộm hóa học tế bào Nhuộm esteraza đặc hiệu phương pháp phổ biến để phân biệt ung thư bạch cầu dòng tuỷ với dòng tế bào khác bệnh máu ác tính Naphtol AS-D cloaxetat chất sử dụng rộng rãi để nhuộm esteraza đặc hiệu có độ nhạy độ đặc hiệu cao tế bào bạch cầu dòng tuỷ so với chất khác Ngoài naphtol AS-D cloaxetat dùng để phân biệt nhiều loại đối tượng khác vi khuẩn từ sa khoáng biển, khuẩn cầu tách từ huyết nhiễm HIV… Tuy nhiên, có nhiều khó khăn sử dụng naphtol AS-D cloaxetat để nhuộm tế bào Một là, việc tổng hợp nguyên liệu đầu thực theo phương pháp truyền thống nên hiệu suất thấp; thứ hai, kết nhuộm chênh lệch so với phương pháp di truyền miễn dịch cao (~29%); thứ ba, chất dễ phân hủy nhiệt độ >-200C, khó khăn vận chuyển bảo quản Vì vậy, nghiên cứu sử dụng phương pháp tiên tiến để tổng hợp chất có hoạt tính cao giá thành rẻ nhằm sản xuất kít nhuộm esteraza tế bào bạch cầu Việt Nam, phục vụ việc khám chữa bệnh cho cộng đồng đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn kinh tế - xã hội cấp thiết Mục đích nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu đề tài ứng dụng phương pháp mới, hiệu cao để tổng hợp chất; khảo sát cách có hệ thống mối quan hệ cấu trúc hoạt tính để tìm kiếm chất có độ nhạy độ đặc hiệu cao hơn; tối ưu hóa điều kiện nhuộm nhằm giảm chênh lệch chế tạo kít nhuộm esteraza để phân loại tế bào phục vụ việc khám điều trị bệnh ung thư máu Đối tượng phạm vi nghiên cứu luận án 1- Nghiên cứu tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2cacboxamit làm nguyên liệu điều chế chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người 2- Nghiên cứu tổng hợp este 3-(N-thếcacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người 3- Xác định cấu trúc hợp chất điều chế phương pháp vật lý hóa lý đại (Phổ IR, 1HNMR MS) nghiên cứu mối tương quan độ nhạy phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử chất phương pháp tính hóa lượng tử 4- Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen2-yl cacboxylat để nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người tìm kiếm chất có độ đặc hiệu độ nhạy cao 5- Nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron nhóm X, hiệu ứng khơng gian gốc N-hiđrocacbon nhóm amit gốc cacboxylat phân tử chất đến độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng nhuộm esteraza 6- Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm phương pháp đơn hình ứng dụng để chế tạo kít nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào bệnh bạch cầu người từ chất tổng hợp Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án - Đã nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp để điều chế nguyên liệu đầu 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2cacboxamit phương pháp truyền thống phương pháp sử dụng kỹ thuật vi sóng - Đã nghiên cứu cải tiến quy trình phản ứng 3-hiđroxi(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit với caboxylic cloanhiđrit tổng hợp hợp chất 3-(N-thếcacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat có hoạt tính với esteraza đặc hiệu bạch cầu người - Đã nghiên cứu cách có hệ thống xác định ảnh hưởng hiệu ứng electron nhóm X, yếu tố khơng gian gốc N-hiđrocacbon nhóm amit gốc cacboxylat lên hoạt tính nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người - Đã khảo sát có hệ thống phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người hợp chất 3-(N-thế)naphtalen-2-ylcacboxylat xác định chất có độ nhạy cao chất naphtol AS-D cloaxetat hãng Sigma bán thị trường - Đã tiến hành nghiên cứu kế hoạch hóa thực nghiệm theo phương pháp đơn hình tìm điều kiện tối ưu sản xuất kít nhuộm esteraza để phân loại dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp Điểm luận án - Đã nghiên cứu sử dụng kỹ thuật hiệu cao phương pháp lị vi sóng để tổng hợp 16 3-hiđroxi-(Nthế)naphtalen-2-cacboxamit, có chất - Đã nghiên cứu cải tiến quy trình phản ứng 3hiđroxi- (N-thế)naphtalen-2-cacboxamit với cacboxylic cloanhiđrit Kết tổng hợp 38 dẫn xuất 3-(Nthế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat, có 36 chất - Trên sở nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian gốc nhị diện nhóm cacboxyl lên độ đặc hiệu, độ nhạy chất phản ứng nhuộm esteraza, xác định được: Các nhóm đẩy cho điểm nhuộm cao nhóm hút điện tử, nhóm hút điện tử vị trí octo- cho điểm nhuộm cao vị trí para- Điểm nhuộm cao thuộc gốc N-hiđrocacbon amit nhóm cacboxylat kích thước trung bình Các góc nhị diện nhóm cacboxyl có ảnh hưởng quan trọng độ chọn lọc esteraza phản ứng thủy phân gốc este độ nhạy chất - Đã điều chế naphtol AS-OL -clopropionat làm chất có độ đặc hiệu tương đương, độ nhạy cao 1,188 lần so với naphtol AS-D cloaxetat hãng Sigma cung cấp với giá thành 20% - Đã chế tạo thành cơng kít nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người sử dụng chất naphtol AS-OL clopropionat; kết kiểm định máu người bình thường Viện Huyết học-Truyền máu trung ương tủy bệnh nhân bị bệnh máu phân loại dòng tế bào cho thấy: kit chế tạo có tính đặc hiệu tương đương với sản phẩm hãng Sigma, độ nhạy cao 1,188 lần, khuyến cáo đưa vào sản xuất thay sản phẩm nhập ngoại Bố cục luận án Luận án gồm 135 trang, có 21 hình vẽ, đồ thị, 41 bảng biểu, chưa kể 129 trang phụ lục 115 tài liệu tham khảo Ngoài phần mở đầu kết luận, luận án chia làm ba chương; chương I – Tổng quan tài liệu, gồm 24 trang; chương II – Thực nghiệm, gồm 22 trang chương III – Kết bàn luận, gồm 76 trang, Kết luận kiến nghị trang Liên quan đến nội dung luận án đăng Tạp chí Thơng tin y dược, báo Tạp chí hóa học (Viện KH&CN Việt Nam), Tạp chí Khoa học (ĐHQG Hà Nội) đăng ký sáng chế (Cục sở hữu trí tuệ Bộ KH&CN) Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hóa học hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2cacboxamit Đã tổng kết kết đạt việc điều chế, nghiên cứu tính chất ứng dụng hợp chất 3hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có cấu trúc sau: O NH 10 R1 A OH R1 = xiclohexyl, 1-naphtyl, 1-antraxyl X-C6H4-; X = o- p-ankyl, o- p-Hal, o- p-NO2 1.1 Các phương pháp điều chế Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2cacboxamit chủ yếu điều chế hai phương pháp truyền thống, gồm: a) Phương pháp trực tiếp giai đoạn O NH2 OH O PCl3 /SOCl2 + NH OH OH b) Phương pháp gián tiếp hai giai đoạn COOH + SOCl2 COCl OH - SO2 OH 1) COCl + 2) NH2 CONH X OH X OH 3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit điều chế theo phương pháp truyền thống nhiều thời gian, tốn lượng hiệu suất thấp (20-70%) 1.2 Tính chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2cacboxamit Đã khái quát tính chất vật lý, tính chất phổ tính chất hóa học chủ yếu 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen2-cacboxamit 1.3 Ứng dụng 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-27 cacboxamit 3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit ứng dụng chủ yếu hai lĩnh vực a) Làm phẩm màu: tổng hợp phản ứng ghép đôi với muối điazo O X2 O X NH OH N N O X3 O OH NH NH X3 X NH N N X2 b) Làm chất nhuộm hóa học tế bào Chương THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất, thiết bị dụng cụ dùng nghiên cứu 2.2 Các phương pháp nghiên cứu sử dụng luận án - Phương pháp tổng hợp hữu truyền thống; - Phương pháp tổng hợp hữu sử dụng lị vi sóng; - Phương pháp Vật lý Hóa lý xác định cấu trúc; - Phương pháp kế hoạch hóa thực nghiệm thống kê xử lý số liệu; - Phương pháp nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào phương pháp FAB phân loại dòng tế bào; - Phương pháp tính tốn Hóa lượng tử Gaussian 2003 khảo sát mối tương quan định lượng hoạt tính cấu trúc Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Mục tiêu đề luận án thực việc nghiên cứu phương pháp tổng hợp chất 3-hiđroxi(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu đầu để điều chế chất 3-(N-thế)-naphtalen-2-yl-cacboxylat dùng nhuộm tế bào bạch cầu 3.1 Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2cacboxamit có cơng thức chung hình A trang 4, chia làm hai dãy: 1) Dãy 1: Naphtol AS-X R1 = X-C6H4; x; X = o- p-ankyl, o- p-Hal, o- pNO2 2) Dãy 2: R1 = xiclohexyl, phenyl, naphtyl, antraxyl, tổng hợp để nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng không gian lên phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu 3.1.1 Tổng hợp naphtol AS-X phương pháp truyền thống Đun hồi lưu hỗn hợp axit 3-hiđroxi-2-naphtoic, dẫn xuất anilin PCl3, theo tỷ lệ mol khác nhau, điều kiện không dung môi 120-1300C có dung mơi clobenzen 1350C, thời gian đến 2h Phản ứng xảy theo sơ đồ sau: COOH OH NH2 + X O C PCl3, T0C h = 40-70% OH Ia-l X NH X = o-CH3 (Ia), p-CH3 (Ib), o-Cl (Ic), p-Cl (Id), o-Br (Ie), p-Br (If), o-NO2 (Ig), p-NO2 (Ih), o-OCH3 (Ii), p-OCH3 (Ij), o-COOCH3 (Ik), p-COOCH3 (Il) Đã tìm điều kiện thích hợp là: tỷ lệ mol axit 3hiđroxi-2-naphtoic : dẫn xuất anilin : PCl3 = : : 0,3; dung môi clobenzen; nhiệt độ 1300C thời gian 2h Ở điều kiện hiệu suất naphtol AS-X đạt 40-70% 3.1.2 Tổng hợp naphtol AS-X sử dụng lò vi sóng Đã nghiên cứu sử dụng lị vi sóng để tổng hợp naphtol AS-X Q trình phản ứng mơ tả sơ đồ sau: COOH NH2 + OH O C Microwave X PCl3, Clobenzen NH OH I a-l Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tác nhân, thời gian, nhiệt độ, chất dung môi chế độ làm việc lị vi sóng lên hiệu suất sản phẩm Ia-l cho thấy, điều kiện thích hợp là: tỷ lệ mol axit 3-hiđroxi-2-naphtoic : dẫn xuất anilin : PCl3 = : : 0,3; thời gian 20 phút, nhiệt độ 1300C; dung mơi clobenzen; cơng suất lị 200w Trong điều kiện đó, hiệu suất naphtol AS-X Ia-l đạt 80 - 90% Kết tổng hợp, số số hóa lý kiện phổ đưa bảng 3.4 3.5 (xem toàn văn luận án) Trên phổ IR naphtol AS-X Ia-l có cực đại hấp thụ đặc trưng cho dao động hố trị nhóm hiđroxylνOH khoảng 3482 đến 3172 (liên kết hiđro) cm-1; nhóm 10 Naphtol AS-D -clopropionat Naphtol AS-D cloaxetat Naphtol AS-OL -clopropionat Naphtol AS-OL cloaxetat Hình 3.13 Kết nhuộm esteraza bạch cầu người chất naphtol AS-D naphtol AS-OL cloaxetat -clopropionat 3.4 Nghiên cứu mối tương quan hoạt tính cấu trúc chất phương pháp tính hóa lượng tử Sau tối ưu hóa cấu trúc hình học phân tử chất phần mềm Gaussian, sử dụng phương pháp tính tốn thống kê mối tương quan góc nhị diện (tạo liên kết quanh nhóm C=O este) điểm nhuộm tìm phương trình hồi quy: 41 Log(điểm nhuộm) = 0,303 x G1 – 0,5855 x G2 + 159,609 (3.1) Trong góc G1 G2 góc nhị diện tạo liên kết quanh nhóm C=O este Hình 3.14 Góc nhị diện nhóm cacboxylat Để kiểm tra độ xác phương trình hồi quy tính toán phần mềm Gaussian bốn chất VIa, b, d, e chất tương đồng mặt cấu trúc (đều este naphtol AS-D OL với gốc este mạch thẳng) so sánh với điểm nhuộm thực nghiệm Kết cho thấy, phương trình hồi quy mơ tả so với thực nghiệm 86,8% 3.5 Nghiên cứu sản xuất kít chất naphtol AS-OL -clopropionat (IVi) 42 Ứng dụng kết kế hoạch hóa thực nghiệm, tiến hành sản xuất kít chất naphtol AS-OL clopropionat (IVi): 3.5.1 Thành phần kít cho 50 tiêu nhuộm: Dung dịch cố định 50 ml ký hiệu R1; dung dịch đệm (Sörensen) pH=7,42 50 ml ký hiệu R4 dung dịch nhuộm nhân nuclear fast red 0,2% 50 ml ký hiệu R5 bảo quản nhiệt độ 250C Dung dịch chất ml ký hiệu R2 dung dịch muối điazo lọ ml ký hiệu R3, bảo quản nhiệt độ