1 Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới Vũ Thị Thanh Nhàn Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: CH.0900917 Người hướng dẫn: PGS. TS Đinh Duy Kháng Năm bảo vệ: Abstract: Tổng quan về virus cúm, vaccine phòng chống cúm và hệ thống biểu hiện Baculovirus. Nghiên cứu về vật liệu vector tách dòng, vector biểu hiện trong tế bào côn trùng, hóa chất và sinh phẩm. Trình bày phương pháp nghiên cứu: tách chiết RNA tổng số, kiểm tra RNA bằng quang phổ kế, tổng hợp cDNA, nhân gen M1 của virus cúm A/H1N1 bằng PCR, điện di trên gel agarose, tách dòng gen, biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli, Đưa ra kết quả và thảo luận: kết quả tách chiết RNA tổng số; thiết kế hộp gen M1 của virus cúm A/H1N1; tách dòng hộp gen M1 vào vector pCR2.1; tinh sạch các plasmid tái tổ hợp; thiết kế vector biểu hiện baculovirus mang hộp gen M1. Keywords: Sinh học thực nghiệm; Virut; Virus H1N1; Vaccine Content Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bệnh cúm A/ H1N1 là bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do virus cúm A/H1N1 thuộc họ Othomyxoviridae gây ra, xuất phát từ Mêxico, Hoa Kỳ, và một số quốc gia khác. Ban đầu chỉ thấy nhiễm trên lợn nhưng sau đó phát hiện loại virus này còn nhiễm trên nhiều đối tượng động vật khác. Các vaccine truyền thống tuy đã mang lại những kết quả hữu ích cho việc ngăn ngừa và chống dịch bệnh, tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và cơ chế hoạt động biến đổi của virus A/H1N1 trong tế bào vật chủ đã gây ra những hạn chế về tính hiệu quả của vaccine. Do vậy vấn đề cấp thiết là cần phải phát triển các công nghệ hiện đại để nhanh chóng tạo ra vaccine thế hệ mới nhằm đối phó với những hiểm họa cho cộng đồng trong tương lai. VLPs (Virus like particles) vaccine là một trong những hướng đi mới trong công nghệ sản xuất vaccine thế hệ mới có nhiều tính ưu việt so với vaccine thế hệ trước đây. Từ những yêu cầu cấp thiết từ thực tế, chúng tôi thực hiện đề tài : “Thiết kế vector 2 baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới”. Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm Bệnh cúm là bệnh của loài chim và động vật có vú do siêu vi trùng dạng RNA thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện, bao gồm 4 nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm C và nhóm Thogotovirus. Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hoặc hình khối đa diện, đôi khi cũng có dạng hình sợi, đường kính 80 – 120 nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da. Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-) ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt, mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (M1 và M2), NP, NS (NS1 và NS2), PA, PB1, PB1 - F2 và PB2. Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn α đối xứng, dài 50 – 100 nm, đường kính 9 – 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein có bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP). Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym polymerase chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus. Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo dạng vòm tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10kb – 15 kb (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa khoảng 13,5 kb thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn α bên trong vỏ virus. Bao bọc hạt virus là một lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được gắn protein màng của virus, đóng vai trò bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus. Bề mặt ngoài của vỏ được bao phủ bởi các glycoprotein phân bố dày đặc. Virus cúm có hai loại protein kháng nguyên đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Ngoài ra trên bề mặt vỏ còn có protein M2 nằm xuyên qua màng lipit kép và hoạt động như kênh vận chuyển ion. Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M1 (matrix). 3 1.1.2. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus Phân đoạn: Kích thƣớc (nt) Polypeptide(s) (protein) Chức năng 1 2341 PB2 Liên quan đến quá trình sao mã: gắn mũ. 2 2341 PB1 Liên quan đến quá trình sao mã: kéo dài. 3 2233 PA Liên quan đến quá trình sao mã. 4 1778 HA (Haemgglutinin) Liên kết với thụ thể trên tế bào chủ; gây ngưng kết hồng cầu. 5 1565 NP Nucleoprotein bám vào RNA, là thành phần trong phức hợp sao mã; vận chuyển ra vào nhân của vRNA. 6 1413 NA (Neuraminidase) Đóng vai trò quan trọng trong quá trình giải phóng của virut. 7 1027 M1 (Matrix protein) Protein nền; thành phần chính của virion và liên quan đến nhiều sự kiện quan trọng của virut. M2 Có vai trò là kênh ion 8 890 NS1 Protein không cấu trúc liên quan đến sự vận chuyển của RNA, ức chế interferon. NS2 Protein không cấu trúc; chức năng chưa được biết rõ. 1.1.3. Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus cúm trong tế bào vật chủ Virus cúm A/H1N1 thuộc dạng kí sinh nội bào bắt buộc. Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm, bắt đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng trên bề mặt các tế bào. Màng tế bào bị uốn dần vào trong, bao quanh hạt virus, đưa virus vào trong tế bào và tách ra tạo thành các khoang ẩm bào. pH trong các endosome giảm dần do tế bào tích cực bơm ion H + vào môi trường thủy phân các chất. Hoạt tính của kênh ion M2 được gia tăng để cho các ion tràn vào bên trong vi hạt, dẫn đến pH thấp. Do kết quả này, cầu nối HA - M1 bị nhiễu loạn, vi hạt mở ra và HA hòa với lớp màng trong của màng nội bào. Các ribonucleoprotein được phóng thích vào trong bào tương và được vận chuyển tới hân tế bào. Tại đây phức hợp bị phá vỡ và sự tổng hợp RNA virus bắt đầu. Quá trình cởi vỏ bọc hoàn tất chỉ trong vòng 20 – 30 phút kể từ khi virus gắn vào tế bào Trong nhân tế bào, virus lợi dụng bộ máy tổng hợp của tế bào vật chủ để tổng hợp nên mRNA từ RNA hệ gen virus. Các sợi mRNA được vận chuyển ra bào tương tham gia vào quá trình tổng hợp các protein virus. Các protein mới được tổng hợp được đưa trở lại 4 nhân tế bào tham gia vào quá trình tổng hợp các sợi RNA dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus. Từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA- polymerase. Các sợi này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein tạo thành phức hợp ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi. Khi đạt đủ nồng độ tại màng bào tương, các RNP và M1 kết tụ lại thành những vi hạt của virus. Nhờ hoạt tính của neuraminidase các hạt virus này được phóng thích ra khỏi tế bào và lại tiếp tục xâm nhiễm vào tế bào khác theo chu trình tương tự. 1.1.4 Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm 1. 1.4.1 Hemagglutinin (HA) HA là kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm và là đích để kháng thể trung hòa. Nó đóng vai trò gắn virus vào thụ thể tế bào vật chủ, hòa tan màng tế bào, giải phóng RNA hệ gen để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào cảm nhiễm. Có tới 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của virus. Mỗi phân tử có dạng hình trụ, dài khoảng 130 A o , cấu tạo gồm ba đơn phân. Mỗi đơn phân được tạo thành dưới hai đơn vị HA1 và HA2 liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide. Tiểu phần HA2 có dạng sợi, đóng vai trò gắn kháng nguyên vào màng virus. Phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi tiểu đơn vị HA1. Tiểu phần này có chứa những thụ thể đặc hiệu, đóng vai trò gắn virus vào màng tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm . Đoạn polypeptide liên kết giữa hai tiểu phần HA1 và HA2 là trình tự nhận biết của một số protease trong tế bào vật chủ. Đối với chủng virus thể độc lực cao, vị trí liên kết hai tiểu phần HA thường là một chuỗi amino acid kiềm, dễ dàng bị cắt bởi các protease thông thường có mặt trong nhiều loại mô tế bào và các cơ quan khác nhau trong cơ thể. Do đó, virus có thể nhân lên trong toàn bộ cơ thể, gây nguy hiểm tới tính mạng vật chủ. Các nhà khoa học đã phát hiện 17 loại HA gây bệnh ở gia cầm và vật nuôi, nhưng chỉ có 3 loại là có khả năng gây bệnh ở người (H1, H2 và H3). 1.1.4. 2 Neurominidase (NA) Men neuraminidase có dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt virus. Nó có một đầu gồm 4 tiểu đơn vị hình dạng gần hình cầu trên cùng mặt phẳng, và một vùng kị nước gắn vào bên trong màng virus. Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt 5 capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 50.10 3 Dal. Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau. Đặc trưng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng đột biến trượt-xóa một đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho độ dài vốn có trước đây của NA(N1) là 1410 bp còn 1350 bp. 1.1.4.3 Matrix protein ( M1) của virus cúm M1 là một loại protein nền bao quanh vRNP, liên kết vRNP với vỏ virus và kênh ion ( Hiện nay đã biết được trình tự acidamine từ 91 đến 116 và từ 165 đến 252 thực hiện chức năng này). M1 có trọng lượng khoảng 27.8 kDal. Đơn phân của M1 là các cấu trúc hình que dài khoảng 60A 0 Các nghiên cứu về protein M1 đã chỉ rằng M1 chứa hai cấu trúc cơ bản là α – Helicase ( được đánh dấu từ H1 đến H9) và cấu trúc cặp tóc – loop ( được đánh dấu từ L1 đến L8). Theo tính chất hóa sinh M1 được phân chia thành hai vùng acidamine tạo cấu trúc hình cầu. Vùng thứ nhất từ acidamine số 1 đến 164 và vùng thứ hai từ acidamine 165 đến 252. Hai vùng này được nối với nhau bởi vùng nhạy cảm với protease, do vậy trong quá trình tinh sạch và biểu hiện nếu có mặt của protease nó thường bị loại bỏ. Protein M1 không chỉ là thành phần cấu trúc của virion, mà nó còn thực hiện rất nhiều chức năng trong chu trình sống của virus, đó là:  Tương tác với vRNP và NS2 và vận chuyển vRNP ra vào nhân, M1 là yếu tố điều chỉnh quá trình xuất nhập này. Sau khi virus đi vào endoxom dưới tác dụng của pH thấp do sự vận chuyển của ion H + qua kênh ion M2 của virus và phức hợp M1 - vRNP bị phân tách hoàn toàn cho phép vRNP đi vào nhân. Ngược lại, khi các vRNP mới được tạo thành trong nhân thì M1 và NS2 sẽ đi vào nhân và kết hợp với vRNP cùng được vận chuyển ra khỏi nhân. Sự tương tác của M1 với vRNP đã được nghiên cứu khá rõ. Hai vùng trong M1 bám vào RNA được xác định ở hai vùng độc lập: ngón tay kẽm (a zinc finger motif, ở vị trí axit amin 148 tới 162) và một chuỗi axit amin KKLKR (ở vị trí axit amin 101 tới 105).  Điều hòa sao chép vRNP; vRNP chỉ được sao chép khi tách khỏi M1.  Tương tác với protein vỏ của virus HA, NA, M2 trong quá trình nảy chồi.  Huy động các thành phần của virus với vị trí lắp ráp và khởi đầu nảy chồi. 6  M1 là yếu tố trung tâm trong việc lắp ráp các thành phần của virus phân tử M1 liên kết với vRNP, màng tế bào qua các đuôi hướng tế bào chất của cả hai glicoprotein là HA, NA, một số phân tử M1 khác thì tạo thành một lớp dưới vỏ bọc của virus. Liên kết của M1 với màng dựa vào sự tổ hợp của cả hai tương tác tĩnh điện và kỵ nước cũng như sự tương tác của protein đặc hiệu với protein vỏ.  Huy động các thành phần của tế bào chủ cho việc hoàn thiện nảy chồi và sự giải phóng virus.  Tỷ lệ M1/NP của phân tử virus ảnh hướng đến hình thái của virion và sự lan truyền của virus khi được giải phóng. 1.2 Vaccine phòng chống cúm 1.2.1 Đại cƣơng về vaccine Mỗi khi dịch cúm bùng phát, các quốc gia thường có những biện pháp kiểm soát vệ sinh như đeo khẩu trang, rửa tay bằng xà phòng đặc biệt là sau khi ho, hắt hơi. Đồng thời tiến hành tiêu hủy gia súc bị nhiễm bệnh hoặc nghi là bị nhiễm tại khu vực có dịch. Tuy nhiên, việc làm này là chưa đủ để ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh, đặc biệt là những khu đông dân cư và có mật độ động vật nuôi cao vì virus cúm A/H1N1 có thể tồn tại hàng giờ ở ngoại cảnh, đặc biệt khi thời tiết lạnh. Trên thực tế, thế giới đã sử dụng phổ biến một số loại thuốc dùng trong điều trị cúm A như:  Amantadine và Rimantadine  Leptomycine B  Zanamivir ( Relenza) và Tamiflu (Oseltmavir) Việc tiêm phòng được xem là lựa chọn đầu tiên để chống lại sự xâm nhiễm và lây lan của dịch cúm. Trên thế giới có nhiều quốc gia tham gia vào việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng cúm , chủ yếu tập trung ở những nước phát triển như: Mỹ, Pháp, Đức, Hà Lan, …. Với mỗi loại vaccine, yêu cầu cơ bản là phải có tính miễn dịch bảo hộ, tính kháng nguyên, tính đặc hiệu và tính không độc. Việt Nam đang trong giai đoạn tập duyệt sản xuất vaccine để phòng cúm H1N1. Các vắc-xin ngừa bệnh cúm mùa trước đây không có hiệu quả đối với cúm A /H1N1 mới. Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới. 1.2.2. Tổng quan về VLPs Về mặt cấu tạo VLPs được gọi là hạt giả virus vì hình thái cấu trúc của nó tương tự như một virus tự nhiên. Phía ngoài là lớp vỏ chứa thành phần chủ yếu là lớp kép 7 photpholipid của tế bào vật chủ và các loại protein đặc trưng của từng chủng virus. Tuy vậy bên trong của VLPs lại không có lõi chứa vật liệu di truyền. Về phần kỹ thuật, VLPs là phương pháp cloning trình tự DNA của các siêu vi để tạo protein tái tổ hợp làm kháng nguyên cho vaccine. Điểm đặc biệt là các protein kháng nguyên này có hình dạng và kích thước giống một virus nhưng không có DNA/RNA của virus. Các ưu điểm của VLPs vaccine bao gồm:  Độ an toàn rất cao  Khả năng tạo kháng thể mạnh và chuyên biệt  Sản xuất nhanh để đáp ứng khi dịch bệnh bộc phát.  Giá sản xuất thấp và khả thi ở Việt Nam. . Để khai triển ứng dụng kết quả nghiên cứu vaccine VLP - H1N1, trước hết biểu hiện 3 loại protein tương ứng của gen NA, HA, M1 của virus H1N1, sau đó VLPs được tạo ra bằng việc tổ hợp của ba loại protein, đồng thời cần thiết lập những thử nghiệm lâm sàng để minh chứng độ an toàn và hữu hiệu trong cộng đồng 1.3 Hệ thống biểu hiện Baculovirus Baculovirus là nhóm virus kí sinh ở hơn 600 loài côn trùng khác nhau. Cái tên Baculovirus bắt nguồn từ chữ baculum trong tiếng Latinh - có nghĩa là hình que, mô tả hình dạng của virus. Khi những côn trùng bị nhiễm độc baculovirus sẽ gây biến tính cấu trúc keo, đặc biệt đối với các polyhedrin protein. Trong môi trường sống của virus, polyhedrin protein có chức năng bảo vệ virus khỏi tia cực tím. Tế bào côn trùng có thể thực hiện nhiều sửa đổi hợp lý đối với các hoạt động sinh học của các protein phức tạp như quá trình đường hóa, sự hình thành mối liên kết disulfua, và sự photphoryl hóa. Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Chủng virus cúm A/H1N1 đã được bất hoạt trong dung dịch Trizol được lưu giữ tại phòng Vi sinh phân tử - Viện Công nghệ sinh học. 2.2. Vật liệu 2.2.1 Vector tách dòng Chúng tôi đã sử dụng vector pCR2.1 (Invitrogen, Mỹ) để tách dòng gen M1 trong tế bào E. coli chủng DH5α. . 8 2.2.2. Vector biểu hiện trong tế bào côn trùng Vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO được sử dụng để biểu hiện gen M1 trong tế bào côn trùng. Vector có ưu điểm nổi bật là sử dụng promoter polyhedrin của virus đa nhân (AcMNPV -Autographa californica Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus) để biểu hiện các gen mong muốn ở mức độ cao (Crawford, Miller, 1998). 2.2.3. Hóa chất và sinh phẩm Sinh phẩm: Bộ Kit tách dòng – TA cloning Kit (Invitrogen, Kit tinh sạch plasmid – S.N.A.P. TM (Invitrogen), Kit thôi gel – S.N.A.P free UV (Invitrogen), Kit tinh sạch sản phẩm PCR (Fermentas, Đức). Hóa chất dùng cho nghiên cứu được cung cấp từ các hãng BioRad, Invitrogen, New EnglDNA Biolabs, Sigma (Mỹ), Fermentas, Merck (Đức): cao nấm men, trypton, agar, Amp, X- gal, EDTA, MgCl 2 , SDS 10%, ethanol, NaCl, SolI, Sol II, Sol III. Các enzym giới hạn BamH I và Hind III (New EnglDNA Biolabs, Mỹ), T 4 DNA ligase (Invitrogen, Mỹ). 2.2.4. Trang thiết bị: Lò vi sóng (Samsung), Máy lắc ổn nhiệt 37°C (Multitron-Đức), Máy khuấy từ (Rotolab,Osi), Máy ly tâm (microcentrifuge-sorvall,Mỹ), Tủ lạnh sâu (Sanyo), Máy khuấy trộn vortex (rotolab,osi), Máy soi ảnh gel (BIO-RAD), Cân phân tích (mettle toledo) , Tủ cấy vô trùng (Sanyo), Nồi khử trùng (Nhật Bản), Máy ly tâm lạnh (sorvall biofuge fresco) , Bộ điện đi DNA, Máy xác định trình tự DNA tự động (ABI 3100, applied biosystems-Mỹ), Máy PCR (MJ Research-Mỹ); pipettman các loại (gilson). 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu: 2.3.1. Tách chiết RNA tổng số 2.3.2 Kiểm tra RNA bằng quang phổ kế. 2.3.3 Tổng hợp cDNA 2.3.4. Nhân gen M1 của virus cúm A/H1N1 bằng PCR 2.3.5. Điện di trên gel agarose 2.3.6 Tách dòng gen 2.3.7. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli 2.3.8. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli 2.3.9. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn 2.3.10. Thu đoạn DNA từ gel agarose 9 Phần 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số Việc tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh nhiễm RNase từ môi trường ngoài vào mẫu vì RNA trong nghiên cứu sinh học đòi hỏi phải có độ tinh sạch cao (không lẫn protein, DNA). Để đo nồng độ và độ tinh sạch RNA cần dùng cho việc tạo cDNA chúng tôi sử dụng phương pháp quang phổ kế xác đinh độ hấp phụ tại bước sóng 260nm (A 260 ). Kết quả trình bày tại bảng dưới: A 260 (độ pha loãng 20 X) Công thức tính Tỷ lệ A 260 /A 280 Nồng độ RNA 0,13 0,13 x 40 x 20 1,87 104 μg/ml Ở bảng trên cho thấy, ước tính có 104 ng trong 1 µl dung dịch RNA đã tách chiết. RNA có độ tinh sạch cao đủ điều kiện cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2. Thiết kế hộp gen M1 của virus cúm A/H1N1. RNA tổng số tinh sạch được sử dụng để tạo cDNA sử dụng bộ kit tổng hợp cDNA của Invitrogen (Mỹ). Nguồn cDNA thu được sau đó được sử dụng làm khuôn để khuếch đại gen mã hóa protein M1 bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu M1pBac-F và M1pBac-R. Để gen M1 có thể biểu hiện tốt trong tế bào côn trùng chúng tôi đưa thêm trình tự Kozak, trình tự đóng vai trò quan trọng trong việc khởi đầu quá trình dịch mã ở sinh vật nhân chuẩn (Kozak, 1987) vào đầu 5’ của gen ngay trước mã mở đầu ATG của mồi xuôi. Sản phẩm PCR (hộp gen M1) được kiểm tra trên gel agarose 1% (hình 3.1). Kết quả cho thấy có một băng DNA duy nhất với kích thước khoảng 780 bp tương đương với kích thước gen M1 có gắn thêm các trình tự thiết yếu theo tính toán lý thuyết. Như vậy có thể sơ bộ kết luận hộp gen M1 của virus cúm A/H1N1 đã được khuếch đại đặc hiệu. 10 Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen M1 trên gel agarose 1%. 1: thang DNA 1kb chuẩn (fermentas, Đức) 2: sản phẩm PCR 3.3. Tách dòng hộp gen M1 vào vector pCR2.1 Trước khi đưa vào vector biểu hiện baculovirus, sản phẩm PCR của gen M1 được tinh sạch qua kit tinh sạch PCR (Fermentas, Đức), sau đó được đưa vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen, Mỹ). Việc tách dòng được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1 sau đó biến nạp vào E.coli rồi tách chiết lại plasmid để chọn lọc vector tái tổ hợp. Các vector chứa gen M1 được kí hiệu là pCRM1. 3.3.1. Gắn sản phẩm PCR chứa hộp gen M1 vào vector pCR2.1 Quá trình gắn dựa vào đặc tính xúc tác hình thành liên kết nối hai đoạn DNA của enzym T4 DNA ligase. Chúng tôi sử dụng enzym T4 DNA ligase có nguồn gốc từ phage T 4 xâm nhiễm E.coli. Mẫu được ủ ở 14°C trong 16 giờ. Đây là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzym T4 DNA ligase hoạt động. Vector tái tổ hợp mong muốn sẽ là vector gắn với sản phẩm PCR mang gen mã hóa protein M1. 3.3.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli chủng DH5α Plasmid tái tổ hợp thu được từ phản ứng gắn trên được biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau khi biến nạp, thể biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp, IPTG, và X-gal. Sau đó nuôi trong tủ ấm 37 0 C qua đêm. Kết quả thu được hai loại khuẩn lạc có màu xanh, trắng (hình 3.2). 1 2 2 750 bp ~780 bp [...]... để tạo vaccine VLP virus cúm A/H1N1 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1 Đã thiết kế được hộp gen M1 của virus cúm A/H1N1 mang đầy đủ các thành phần cần thiết cho sự biểu hiện của gen trong hệ thống tế bào côn trùng bao gồm trình tự Kozak, mã khởi đầu và mã kết thúc 2 Đã tạo dòng và xác đinh trình tự hộp gen mã hóa protein M1 của virus cúm A/H1N1 3 Đã phân tích được trình tự đoạn gen mã hóa protein M1. .. gen M1 của virus cúm A/H1N1 So sánh trình tự đoạn gen M1 phân lập từ virus cúm ở Việt Nam với trình tự đã công bố trong ngân hàng dữ liệu gen quốc tế cho thấy, trình tự đoạn gen mã hóa kháng nguyên M1 của 14 virut cúm phân lập ở Việt Nam có độ tương đồng cao so với các chủng lưu hành trên thế giới, đạt từ 99,5 -100% 3.6 Thiết kế vector biểu hiện baculovirus mang hộp gen M1 3.6.1 Thu nhận hộp gen M1 từ... chúng tôi đã thiết kế thành công vector baculovirus mang hộp gen M1 của virus cúm A/H1N1 Các plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp mang hộp gen M1 kí hiệu là pBluBacM1 Tuy nhiên để biết gen đó được gắn đúng chiều hay không 3 dòng plasmid pBluBacM1 được kiểm tra lại bằng PCR với cặp mồi “lai” với mồi xuôi PFSP-F bám vào vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO và mồi ngược M1pBac-R bám vào hộp gen M1 Bằng cặp... hộp gen M1có thêm các yếu tố cần thiết Ở hình 3.6 thể hiện trình tự hộp gen mã hóa protein M1có gắn các trình tự cần thiết (trình tự kozak, mã khởi đầu – trình tự in đậm) cho sự biều hiện của gen M1 trong tế bào côn trùng được đưa vào trong quá trình thiết kế mồi và phản ứng PCR Phân tích tiếp bằng phần mềm tìm kiếm BLAST và Fasta3 chúng tôi khẳng định chắc chắn đoạn gen được tách dòng chính là gen M1. .. protein M1 phục vụ công tác nghiên cứu về protein M1 Qua đó kết luận trình tự gen mã hóa protein M1 đã tạo dòng có độ tương đồng cao (99,5% đến 100%) với các trình tự đã công bố 4 Thiết kế thành công vector biểu hiện baculovirus (pBluBac4.5/V5-His-TOPO) mang hộp gen M1 KIẾN NGHỊ Được tiếp tục hướng nghiên cứu của đề tài để tiến tới phát triển được vaccine VLP cúm A/H1N1 ở Việt Nam References tiếng... 775 bp (hộp gen M1) và một băng có kích thước khoảng 5000 bp (vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO mở vòng) ở các đường chạy tương ứng (hình 3.9) 1 2 3 5000bp 775bp 755bp Hình 3.9: Kiểm tra gen M1 và vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO đã được xử lý bằng BamH I và Hind III sau tinh sạch trên gel agarose 1% 1: thang DNA chuẩn 1kb (fermentas) 2: gen M1 3: vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO 3.6.2 Thiết kế vector biểu hiện... pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp mang hộp gen M1 gắn đúng chiều sẽ cho sản phẩm PCR đặc hiệu có kích thước theo tính toán khoảng 900bp (780bp của gen M1 và 120bp của vector) 1 2 3 4 5 6 8 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17 5000bp 900bp 775bp A B Hình 3.10: Điện di plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp kiểm tra khả năng mang gen M1 A: Đường chạy 1-6 plasmid tách từ đĩa biến nạp sản phẩm lai gen M1 và plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO... 3.6.1 Thu nhận hộp gen M1 từ pCRM1 và chuẩn bị vector pBluBac4.5/V5-HisTOPO Vector pCRM1 và vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO được xử lý bằng 2 enzym giới hạn BamH I và Hind III Sản phẩm cắt được điện di phân tách trên gel agarose 1% Cắt lấy phần gel mang hộp gen M1 và vector mở vòng, tinh sạch lại nhờ kit thôi gel của Fermentas (Đức) sau đó điện di kiểm tra trên gel agarose 1% Kết quả điện di cho thấy, hai... đích giải trình tự gen 3.5 Kết quả xác đinh trình tự Bộ sinh phẩm BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của Applied Biosystems được sử dụng để xác định trình tự DNA Qúa trình giải trình tự được thực hiện trên máy giải trình tự tự động ABI3100 (Applied Biosystems) Sau khi giải trình, trình tự gen mã hóa protein M1 của virus H1N1 được phân tích bằng phần mềm PC – Gen (hình 3.6) ID M1- PCR PRELIMINARY;... được gắn tương ứng ở đầu 5’ và 3’ của gen Ba dòng plasmid có kích thước lớn hơn plasmid gốc được chọn để phân tích tiếp bằng phản ứng cắt với hai enzym giới hạn BamH I và Hind III Sau đó kiểm tra điện di trên gel agarose 1% (hình 3.4) 1 2 3 4 M 3000bp 780bp 750bp Hình 3.4: Kiểm tra các dòng vector tái tổ hợp mang hộp gen M1 bằng điện di trên gel agarose 1% 1: Sản phẩm PCR gen M1 (dùng làm đối chứng) . 1 Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới Vũ Thị Thanh Nhàn Trường. chúng tôi thực hiện đề tài : Thiết kế vector 2 baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới . Đề tài được thực hiện tại