Thông tin tài liệu
Tách dòng và thit k vector biu hin gen mã
hóa cho th th neurokinin-1 i Vit Nam
Lê Hng Thu
i hc Khoa hc T nhiên
Luchuyên ngành: Sinh hc thc nghim; Mã s: 60 42 30
ng dn: PGS. TS. Võ Th
o v: 2012
Abstract: Tng quan v G protein; h tachykinin ng vt có vú; th th h tachykinin
và th th neurokinin-1; ng dng ca th th neurokinin-u tr bnh; vector
biu hin gen mã hóa cho th th neurokinin-1. Trình bày nguyên li
nghiên cu: Tách RNA tng s; phn c; phn ng PCR (Polymerase
Chain Reaction); Tinh sch DAN b n DNA
vào vector; k thut bin np; sàng lc khun l t ct s dng
enzyme gii hn; ký thun di; phân tích trình t cDnA ca cDNA-t
qu và tho lun: Tách dòng gen mã hóa cho th th neurokinin-1 t phi; thit k
vector biu hin gen mã hóa cho th th neurokinin-1.
Keywords: Sinh hc thc nghim; Gen mã hóa; i Vit Nam; Th th
neurokinin-1; Cu trúc protein
Content
M U
Th th neurokinin 1 thuc nhóm các th th xuyên màng liên kt vi G protein. Khi th th
i cu t gc hiu SP s dn truyn cn t vùng thn kinh
ngoi vi v n kinh, gây ra trng thái lo âu và các triu chng ging trm cm, mt
u hòa các phn ng min dch ca
.
nhng nghiên cu v cu trúc và cha th th neurokinin-c
ph gng tìm ra các chi vn vi th th neurokinin-1 nhm sn xut thuc gi
cho các bnh nhân b chu, thuc chng trm cm, thuc chng nôn cho các bnh
u v th th này i Vit Nam còn rt
ít hoc công b. Chính vì vy, vi mn cDNA hoàn chnh
mã hóa cho th th này i Vit Nam và biu hin chúng trên h thng t ng v có
th ch c ngun gen và các h thng sàng lc thuc t ngu c liu Vit Nam,
tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam” c thc hin ti Phòng thí nghim Sinh Y, Khoa Sinh
hc; Phòng Genomic thuc Phòng thí nghim Tr m Công ngh Enzyme - Protein và
Phòng Sinh hc Phân t thuc Trung tâm nghiên cu Khoa hc s si hc Khoa
hc T i hc Quc Gia Hà Ni.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN
1.1.1. G protein
G protein lc phát hin và mô t bi Alfred và Martin khi hai ông nghiên cu tác
ng ci vi t bào. Vi Nobel lý sinh y
h
nh v mt trong màng t c hot hóa nh th th liên kt vi G protein
(GPCRs) phân b trên b mt màng t bào.
1.1.2. Thụ thể liên kết với G protein
H th th liên kt vi G protein là nhng phân t c nh (350-500 acid amine)
c phân thành các phân h khác nhau d ng v trình t acid amine,
ch t vi các cu tn ra 367 th th
liên kt vi G protein c tìm thy vt chc
1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ
Tachykinin là mt trong nhng h neuropeptide ln nhc tìm th ca tt c
ng v c phân lp t ng vt không
ng [15, 45].
ha
ptide
1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1
1.3.1. Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin
Th th ca h tachykinin (TACR) thuc lp A trong h th th liên kt vi G protein (Hình 1).
th rhodopsin, TACR có cu trúc gc ni
vi nhau bi các vòng phía ngoài và phía trong màng sinh cht (exoloop và cytoloop). Nhng
vòng phía ngoài màng t bào ca th th liên kt vi G protein có cha chn cu t
gc hiu trong khi các vùng xuyên màng có ch nh hot tính ca th th.
i ta phân loi TACR da vào s sai khác trong các trình t này [45].
1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH
T nhng hiu bit v cha th th neurokinin 1 ha h ng hiu
qu u tr mt s c
nhiên khi nhic phm ln tp trung nghiên cu v th th tachykinin nhm tìm ra các
chi vn c ng du tr bnh: làm thuc ging lo âu, trm
cm, cha các bng hô h phát hin ra các chi vn vi th th
mt mt xích quan trng trong viu tr trong via chng bun nôn
và s nôn ma do tác dng ca hóa tr lin nay các nghiên cu v chi vn
vi th th tachykinin v c kt qu i và gp rt nhi
c s dng th th ng ca thuc vn là mt bài tóan hay và khó cho
nhiu nhà nghiên c các nghiên cu ch yu tp trung vào nhng phân t không có
bn cht peptide có kh m xuyên qua màng t bào tht này
ha hn s u tr bnh liên quan ti chng nghi
1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1
Gen mã hóa cho th th liên kt v c dung hp vào nhiu h vector và
nhiu dòng t biu hin chúng trên c t trên t
bào nhân thc. Tuy nhiên, do th th liên kt vc bii sau dch mã
bng cách gn thêm carbonhydrate hoc biu hin trên h thng t bào nhân
ng không cho kt qu n.
Theo các nghiên c c biu hin trong vector pCDNA [24],
pMAM- các chng t bào HEK293, COS-7,
u cho kt qu kh quan. Mt nghiên cu ga Farahdiba và cng s
khi nghiên cu truyn tin ca th th -n hành dung hp gen mã hóa cho th th
này vi gen mã hóa cho NK1 và biu hin chúng trong hai h vector pCDNA3.1 và pEGFP-N1
t qu t cho chúng tôi la chn và thit k vector biu hin pCDNA3
và pEGFP- tài.
pCDNA3 và pEGFP-N1 là vector biu hin t ng vt vc trình bày
trong ph lc.
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
Mu phi b c cung cp bi Vin Quân Y 103 (kí hiu H211 ly
ngày 25/1/2011).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
cDNA
-NK1
-NK1
Tách -NK1
-NK1
Hình 5 nghiên cu tách dòng và thit k vector biu hin cDNA mã hóa cho
th th neurokinin 1 phi Vit Nam.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI
RNA tng s t mu phc tách chit bng kit AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit
c tng hp nh phn c s dng RNA tng s và
mi hexamer. Thành phu kin ca phn ng tng hc trình bày trong Bng
9.
Bảng 9: Thành phu kin phn ng tng hp cDNA ca gen neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
13.0
0
1.5
dNTPs (10 mM)
2.5
5.0
-
0
trong 10 phút
AMV RTase
3.0
- Kéo dài: 37
0
trong 90 phút
- 85
0
trong 5 phút
Tổng
25.0
Sn phc bo qun 4
o
s dng cho các thí nghim tip theo.
--1
n cDNA mã hóa cho th th NK1 s -NK1 và
- c ni v to nên cDNA hoàn ch
Hình 6.
Hình 6: khu-NK1 ca gen mã hóa cho neurokinin-1
khu-NK1, chúng tôi s dc tng hp t phn ng phiên
làm khuôn cho phn ng PCR vi cp mc hiu NK1 F/ NK1 R1. Thành phn
u kin ca phn c trình bày trong Bng 10.
Bảng 10: Thành phu kin phn ng PCR khu-NK1 ca cDNA mã hóa
cho th th neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
10.4
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 45 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
2
20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F (2 µM)
0.5
NK1 R1 (2 µM)
0.5
Pfu polymerase
0.1
cDNA
1.0
Tổng
15.0
NK1 F
NK1 R
NK1 R1
NK1 F1
94 bp
76 bp
94 bp
Đoạn 5’–NK1 (788 bp)
CCCGG
G
76 bp
CCCGG
G
Đoạn 3’- NK1 (728 bp)
72
0
C, 10 phút
Sn phn di trên gel agarose. Kt qu n di cho mc
xp x -NK1.
Hình 7: n di sn phm PCR khu -NK1 ca cDNA mã hóa cho th th
neurokinin-1. Gii chng âm không có cDNA; Gin phm PCR khui
-NK1; Ging M: thang chun SY-500.
Sn phc tinh sch bng High Pure PCR Product Purificati
chun b cho phn -NK1 ca cDNA.
3.1.3. --1
i v-NK1, chúng tôi s dng cDNA làm khuôn cho phn ng
PCR vi cp mi NK1 F1/ NK1 R khu-NK1 ca cDNA mã hóa cho th th
neurokinin-1. Tuy nhiên, sn phm PCR gc hi
DNA vi (Hình 8).
Hình 8n di sn phm PCR khu-NK1 ca cDNA mã hóa cho th th
neurokinin-1. Gin phm PCR khu-NK1; Ging M: thang chun SY-500.
Lp li phn ng nhiu l u kin v n cDNA, nhi gn m
chúng tôi vn. Vì vy, chúng tôi quynh thc hin phn
c vi m tng hp li cDNA t RNA tng s. Thành phu
kin ca phn c thc hing 11, ch i mi hexamer
bng mc s dng làm khuôn cho phn ng PCR khui
-NK1 bng cp mc hiu NK1 F1/ NK1 R. Thành phu kin ca phn ng
c trình bày trong Bng 11.
Bảng 11: Thành phu kin phn ng PCR khu-NK1 ca cDNA mã hóa
cho th th neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
10.4
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 45 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút
(MgCl
2
20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F1 (2 µM)
0.5
NK1 R (2 µM)
0.5
Pfu polymerase
0.1
cDNA
1.0
Tổng
15.0
Sn phn di trên gel agarose (Hình 9). Kt qu cho thy bên c
c hit hic lp vc
NK1. S dng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chúng tôi tinh sch
-NK1.
Hình 9n di sn phm PCR dùng khuôn cDNA tng hp t mi oligo T khui
-NK1. Ging n phm PCR khu-NK1, Ging M: thang chun SY-
100.
---1
ch, t--ng
phn ng ni s dng kit Gene JET
TM
PCR Cloning Kit (Fermentas). Thành phn ca phn ng
nc trình bày trong Bng 12.
Bảng 12: Thành phn phn ng n-NK1 (ho-NK1) ca cDNA mã hóa cho th th
neurokinin-1 vào vector pJET1.2
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
-NK1
(ho
8.0
Hn hp ni 16
0
m 2x
10.0
pJET 1.2 (50 ng/µl)
1.0
T4 ligase (5 u/ µl)
1.0
Tổng
20.0
ng hn hp nc bin np vào dòng t bào kh bin E.coli i m
ng thch cha sàng lc các khun lc nhn plasmid tái t hp, chúng tôi chn
8 khun l kin chèn bng phn ng PCR vi cp mc hiu.
ki-NK1, chúng tôi s dng trc tip khun lc làm khuôn cho phn ng
PCR vi cp mi NK1 F/NK1 R1. Thành phu kin phn c trình bày trong
Bng 13.
Bảng 13: Thành phu kin phn ng PCR sàng lc khun l-NK1
ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl)
Điều kiện
H
2
O
10.0
- Thi gian biu tiên:
94
o
C, 5 phút
- Lp li 40 chu kì:
+Biến tính: 94
0
C, 30 giây
+Gắn mồi : 60
0
C, 30 giây
+Tổng hợp: 72
0
C, 150 giây
- Thi gian tng hp sau cùng:
72
0
C, 10 phút
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F (2 µM)
0.5
NK1 R1 (2 µM)
0.5
Taq DNA polymerase (1 u/µl)
0.5
Khuôn
1.0
Tổng
15.0
Sn phn di trên gel agarose (Hình 10). Kt qu cho thy 7 trong 8 khun
lu cho mc phù hp v-y, chúng
NK1 ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1. Chúng tôi kí hiu by
khun lc này lt t -NK1--NK1-7.
788 bp
[...]... cho thụ thể neurokinin- 1 từ mẫu phổi người Việt Nam 3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ- 1 3.2 .1 Thiết kế mồi Để biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 ở người, chúng tôi sử dụng hai vector biểu hiện ở tế bào động vật là pCDNA3 và pEGFP-N1 Bước đầu tiên cần chuyển đoạn cDNA đã tách dòng trong vector pJET1.2 sang hai hệ thống vector biểu hiện Khi lựa chọn enzyme cắt giới... dữ liệu (Mã số trên NCBI: M 817 97 .1) Điều này chứng tỏ rằng sự khác biệt giữa trình tự nucleotide trong gen mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 của người Việt Nam với trình tự nucleotide trong ngân hàng dữ liệu là do tính đa hình của gen mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 ở người Như vậy, từ kết quả giải trình tự cho thấy chúng tôi đã tách dòng thành công cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 từ mẫu... đoạn chèn 3’-NK1 bằng cặp mồi NK1 F1/ NK1 R Giếng 1- 8 lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm không có khuôn; M: thang chuẩn SY-500 3 .1. 5 Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin- 1 Quá trình tách dòng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 được trình bày trong Hình 12 Hình 12 Sơ đồ tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin- 1 Đầu tiên chúng... chọn hai khuẩn lạc 11 A và 5E Các vector tái tổ hợp của hai khuẩn lạc này được kí hiệu là pCDNA3-NK1 -11 và pEGFP-N1-NK1-5 Chúng tôi tách chiết hai loại plasmid tái tổ hợp để giải trình tự 3.2.3 Giải trình tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 trong vector biểu hiện Để khẳng định sự có mặt của cDNA-NK1 trong các vector biểu hiện, hai vector biể u hiê ̣n pCDNA3-NK1 -11 và peGFP -N1-NK1-5 được giải trình... cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 ở người Việt Nam KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với những kết quả thu được chúng tôi đưa ra những kết luận sau: 1 Tách dòng thành công cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam cDNA-NK1 có kích thước 13 38 bp trong đó có 5 nucleotide (ở các vị trí 18 4, 333, 370, 6 41, 996) không giống với trình tự cDNA-NK1 trong ngân hang dữ liệu,... của vector pEGFP-N1 và pCDNA3 thỏa mãn điều kiện cắt văng ra đoạn cDNA hoàn chỉnh từ vector tái tổ hợp pJET1.2-NK1 Vì vậy, chúng tôi đã thiết kế mồi NK1 F3/ NK1 R3 để chuyển cDNA-NK1 từ pNK1-3 sang vector biểu hiện Trình tự cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 được thiết kế dựa vào trình tự cDNA hoàn chỉnh tách dòng từ phổi người Việt Nam Trong đó ở đầu 5’ của mồi NK1 F3 được thiết kế mang trình tự nhận biết cho. .. chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 Đồng thời đoạn DNA mới được nhân bản có mang vị trí nhận biết của cặp enzyme HindIII/ BamHI ở hai đầu 5’ và 3’ Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit High Pure Product purification kit (Roche) và được kí hiệu là eNK1 (expression NK1) 3.2.2 Tách dòng vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin -1 Chúng tôi tách chiết và tinh sạch hai loại plasmid pCDNA3 và. .. sạch, eNK1 được đưa vào từng vector pCDNA 3 và pEGFP -N1 với thành phần được trình bày trong Bảng 22 Bảng 22: Thành phần và điều kiện của phản ứng nối cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 vào vector pCDNA3 và pEGFP-N1 Thành phần Thể tích(µl) Thành phần Thể tích (µl) Đệm 10 x 2.0 Đệm 10 x 2.0 eNK1cắt 8.5 eNK1 cắt 10 .0 Plasmid pCDNA3 cắt 8.5 Plasmid pEGFP-N1 cắt 7.0 T4 ligase 1. 0 T4 ligase 1. 0 Tổng 20.0 Tổng... (ở các vị trí 18 4, 333, 370, 6 41, 996) không giống với trình tự cDNA-NK1 trong ngân hang dữ liệu, chứng tỏ sự đa hình của gen mã cho thụ thể NK1 ở người Việt Nam 2 Thiết kế thành công vector biểu hiện pCDNA3 và pEGFP-N1 mang cDNA mã cho thụ thể NK1 phân lập từ phổi của người Việt Nam ... chọn khuẩn lạc 5’-NK1-2 và 3’-NK1-6 để tách chiết các plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn tương ứng 5’-NK1 và 3’-NK1 Plasmid này được kí hiệu p5’-NK1-2 và p3’NK1-6 Sử dụng p5’-NK1-2 làm khuôn cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn 5’-NK1 với mồi NK1 R1 đặc hiệu cho NK1 và mồi pJET R của vector pJET 1. 2 Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 15 Bảng 15 : Thành phần và điều kiện phản . c liu Vit Nam,
tài Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam c.
1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1
Gen mã hóa cho th th liên kt v c dung hp vào nhiu h vector và
nhiu dòng
Ngày đăng: 10/02/2014, 20:48
Xem thêm: Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin 1 ở người việt nam, Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin 1 ở người việt nam