Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim Lê Thị Thu Huyền Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS. ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Ngƣời hƣớng dẫn: GS.TS. Nguyễn Đình Quyến Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tổng quan về cấu trúc và tính chất của keratin, tình hình khai thác và sử dụng keratin hiện nay. Tiến hành nghiên cứu phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim. Trình bày các kết quả nghiên cứu đạt đƣợc: Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập đƣợc 6 chủng có hoạt tính keratinaza; Các chủng này đều có khả năng sử dụng lông gà nhƣ là nguồn cacbon và nitơ duy nhất; Cả 6 chủng này đều có một số đặc điểm giống chi Bacillus; Keratinaza từ 6 chủng phân lập đƣợc đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11 và trong khoảng nhiệt độ 30 - 600C; Chủng Kr2 có hoạt tính keratinaza cao nhất; pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của keratinaza của chủng này là pH = 9 và nhiệt độ 500C; Hoạt tính của keratinaza tăng khi trong môi trƣờng phản ứng có mặt của một số ion : Na+, Ca2+, K+, Mg2+, đặc biệt là ion Ca2+ , ở nồng độ 1 mM và 5 mM; và giảm hoạt tính khi trong môi trƣờng phản ứng có mặt một số ion nhƣ: Fe3+, Cu2+ ; Điều kiện nuôi tốt nhất cho khả năng sinh keratinaza của chủng Kr2 là môi trƣờng ban đầu có hàm lƣợng lông là 20 g/l, pH = 7-8, nhiệt độ khoảng 350C. Keywords. Vi sinh vật học; Vi khuẩn; Enzim; Hoạt tính Keratinaza Content MỞ ĐẦU Keratin là nhóm các protein tự nhiên, là thành phần chính cấu tạo nên các loại lông, tóc, móng, sừng,… Lông gà trƣởng thành chiếm 5 - 7% trọng lƣợng sống. Trên thế giới, mỗi năm có tới 24 tỉ con gà và khoảng 8,4 triệu tấn lông vũ đƣợc thải ra từ ngành công nghiệp gia cầm (31), mức tăng hàng năm cũng lên tới khoảng 4.5% (18). Hàm lƣợng protein trong lông vũ rất cao, chiếm tới trên 90%, nên có thể coi đây là một nguồn protein tiềm năng lớn có thể khai thác làm thức ăn cho chăn nuôi và nhiều ứng dụng khác. Tuy nhiên, keratin lại là loại protein rất bền nhờ có các liên kết disulfua trong phân tử. Vì vậy, chúng có tính ổn định cơ học cao, có khả năng chống chịu tốt với tác động vật lý, hoá học và sinh học, không bị phân huỷ bởi nƣớc và các proteaza thông thƣờng nhƣ: trypsin, papain và pepsin . Các nhà máy thuộc da, lông thú và các lò giết mổ gia súc, gia cầm vứt bỏ một lƣợng đáng kể các vật liệu chứa keratin: lông, len, sừng, móng,…. Ở Việt Nam, chỉ một phần rất nhỏ trong số chúng đƣợc sử dụng chủ yếu trong sản xuất một số sản phẩm thủ công, may mặc; phần lớn còn lại chỉ đƣợc loại bỏ và xử lý đơn giản nhƣ đốt, chôn hoặc chỉ là chất thành các đống rác lớn chƣa có phƣơng pháp xử lý gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng. Trên thế giới, trƣớc đây ngƣời ta áp dụng phƣơng pháp xử lý lông vũ bằng cách thuỷ phân trong môi trƣờng kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không chỉ phá huỷ một số axit amin ( nhƣ: metionin, lysin, histidin) mà còn tiêu thụ một lƣợng lớn năng lƣợng . Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phƣơng pháp thay thế đƣợc lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục đƣợc những hạn chế của các phƣơng pháp cũ. Ngoài ra, bên cạnh việc tạo ra nguồn protein bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi, xử lý đƣợc nguồn rác khó phân giải góp phần chống ô nhiễm môi trƣờng thì keratinaza đƣợc phân lập từ vi sinh vật cũng có thể đóng vai trò quan trọng trong các ứng dụng công nghệ sinh học khác nhƣ: loại bỏ lông trong ngành công nghiệp thuộc da , làm sạch các vật cản lông vũ trong các hệ thống nƣớc thải, phòng chống bệnh bò điên (21),… Tuy nhiên, một trong những hạn chế lớn ảnh hƣởng đến sự ổn định độ pH kiềm tính của các enzym này là có sự ổn định trong một phạm vi pH rộng nhƣng thƣờng không ổn nhiệt. Vì vậy, ngƣời ta mong muốn tìm kiếm các protease mới với những đặc tính mới lạ từ nhiều nguồn khác nhau (34). Trong những năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza, đặc điểm và ứng dụng của chúng, bƣớc đầu phục vụ cho phân huỷ lông vũ dùng làm thức ăn cho gia súc đã đem lại hiệu quả tốt (4, 10, 11, 14, 16, 23, 26, 27, 42). Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực này chƣa có nhiều và việc ứng dụng chúng còn rất hạn chế, hầu hết lông vũ từ các lò giết mổ chỉ đƣợc coi là rác thải; cùng với đó, việc xử lý rác thải chƣa đƣợc quan tâm nhiều. Đề tài "Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim" đƣợc thực hiện nhằm: - Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ các mẫu đất khác nhau và xác định đƣợc chủng có hoạt tính tốt nhất. - Một số điều kiện tối ƣu về hàm lƣợng lông, nhiệt độ và pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu cho nuôi chủng sinh keratinaza. - Một số đặc tính của enzim, nhƣ hoạt động tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ, pH và sự có mặt của những ion nào. Từ đó có thể ứng dụng vào thực tiễn góp phần xử lý rác thải lông vũ một cách hiệu quả, tận dụng một nguồn protein đang bị bỏ phí làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi và có thể mở rộng sang nhiều ứng dụng khác nếu đƣợc tiếp tục nghiên cứu. Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA KERATIN 1.1.1. Cấu trúc của keratin Keratin là nhóm các protein có cấu trúc dạng sợi với các đặc tính hoá lý cụ thể, là thành phần chính cấu tạo nên lông, tóc, móng, sừng, trong biểu mô của tế bào động vật có xƣơng sống… Trong số các loại axit amin tạo nên các phân tử keratin thì cystein là phổ biến nhất (có thể chiếm tới 24%), ngoài ra, keratin từ lông gia cầm còn chứa hàm lƣợng cao các axit amin nhƣ: glycin, alanin, serin và valin. Ngoài các liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử, keratin có hàm lƣợng lớn lƣu huỳnh có chứa trong cystein, tạo ra các cầu disunfua cho keratin. Keratin đƣợc tạo ra bởi các tế bào sừng - các tế bào sống tạo nên phần lớn của lông, tóc, móng, da,…Sau đó, các tế bào này chết và bao phủ bên ngoài có tác dụng bảo vệ. Keratin đƣợc phân loại cụ thể theo cấu trúc phân tử của chúng, đặc điểm hóa lý , các tế bào biểu mô sản xuất và loại biểu mô có chứa các tế bào sản xuất keratin. Theo cấu tạo, keratin có 2 loại chính: -keratin -keratin 1.1.2. Tính chất của keratin Keratin là protein rất bền. Do có axit amin cystein chứa lƣu huỳnh có khả năng tạo liên kết với nhau bằng các cầu disunfua, tạo ra một dạng xoắn cực kì chặt chẽ, khiến keratin khá cứng chắc, bền nhiệt và rất khó hoà tan. Keratin cũng khó bị phân giải bởi các proteaza thông thƣờng nhƣ: trypsin, papain và pepsin. Keratin không bị hòa tan trong dung dịch muối nhƣng những protein này có thể hoà tan trong các dung dịch có chứa các chất biến tính, chẳng hạn nhƣ urê. Keratin trong dung dịch có thể lắp ráp lại sợi trung gian. Tuỳ thuộc vào hàm lƣợng cystein và các cầu disunfua mà tạo ra các tế bào chứa keratin rất cứng nhƣ trong móng, guốc hoặc có thể linh hoạt hơn nhƣ trong da. Hầu hết các tế bào chứa nhiều keratin mà ta gặp là các tế bào đã chết và có thể đƣợc rụng ra hoặc bị các tế bào mới đẩy lên. Nếu các tế bào đã chết này đƣợc lƣu giữ trong tình trạng tốt, chúng sẽ có tác dụng nhƣ 1 lớp cách điện, cách nhiệt, không thấm nƣớc,… bảo vệ các tế bào phía dƣới. 1.1.3. Các nguồn keratin Keratin tự nhiên đƣợc tạo ra từ các tế bào sừng của cơ thể. Trong tự nhiên, keratin là thành phần chính cấu tạo nên các cấu trúc nhƣ lông, tóc, móng guốc, sừng, da,… của động vật. Ở gà trƣởng thành, lông chiếm 5 - 7 % khối lƣợng cơ thể; trong đó, keratin lại là thành phần chủ yếu. Trên thế giới có tới vài triệu tấn lông vũ đƣợc tạo ra hàng năm từ ngành chế biến gia cầm và tỉ lệ tăng hàng năm là khoảng 4,5% (18). Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển của các ngành chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm đã tạo ra một lƣợng lớn keratin thô cần đƣợc xử lý. 1.2. TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ SỬ DỤNG KERATIN HIỆN NAY 1.2.1. Tình hình khai thác và sử dụng keratin trên thế giới Mặc dù nguồn keratin tự nhiên khá dồi dào, hàm lƣợng protein trong lông, tóc, móng,… rất cao; tuy nhiên, do tính bền vững mà keratin hầu nhƣ chƣa đƣợc khai thác và sử dụng nhiều. Chỉ một phần rất nhỏ lông, tóc, móng,… đƣợc sử dụng để làm các sản phẩm thủ công mĩ nghệ, làm chăn ga gối, áo, Ngành công nghệ sinh vi sinh trên thế giới đã và đang tìm kiếm các môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật với chất lƣợng cao và giá rẻ. Việc sử dụng lông từ công nghiệp gia cầm làm cơ chất lên men là lựa chọn không tốn kém để sản xuất enzyme, protein…bằng công nghệ vi sinh nếu áp dụng hiệu quả. Trong công nghiệp, ngƣời ta nấu phần lớn lông thải ra dƣới nhiệt độ và áp suất cao, sau đó sử dụng làm nguồn protein bổ sung trong thức ăn gia cầm. Rất nhiều đánh giá hiệu quả của sản phẩm này đã cho thấy chúng không dễ tiêu hoá và do quá trình xử lý nhiệt độ và áp suất phá huỷ một số axit amin, làm tăng sự mất cân bằng các axit amin thiết yếu. Do đó, cần có các phƣơng pháp xử lý lông khác, tăng cƣờng chất lƣợng dinh dƣỡng của lông và phát triển các phụ phẩm hữu dụng. Một trong các phƣơng pháp hiệu quả cao sử dụng vi sinh vật. Vi sinh vật làm biến đổi cấu trúc keratin, thay đổi tính kháng các enzyme trong bộ máy tiêu hoá. Một số nơi trên thế giới đã nghiên cứu và sử dụng sản phẩm phân huỷ lông gà làm thức ăn bổ sung protein cho chăn nuôi gia súc. Sử dụng cách thuỷ phân bột lông bằng vi khuẩn có thể tạo ra sản phẩm thay thế đến 15% protein trong thức ăn gia cầm. Keratinaza và các sản phẩm liên quan có nhiều ứng dụng (18). Ví dụ, lông thủy phân bởi Bacillus licheniformis PWD-1 và Vibrio sp Bacillus licheniformis chủng kr2 (16, 42) có thể đƣợc sử dụng nhƣ phụ gia thức ăn, trong khi keratinaza từ Bacillus subtilis 168M tái tổ hợp có khả năng cạo lông đáng kể (1). Hơn nữa, keratinaza từ B. licheniformis PWD-1 có thể làm giảm hình thức lây nhiễm của prion, PrP SC , trong sự có mặt của chất tẩy rửa và xử lý nhiệt (21). Tuy nhiên trong thực tế, những ứng dụng này còn ít. Phần lớn lông gia cầm từ các lò giết mổ bị coi là rác thải và chƣa đƣợc xử lý triệt để, gây ô nhiễm môi trƣờng và lãng phí một nguồn protein tốt. 1.2.2. Tình hình khai thác và sử dụng keratin ở Việt Nam Ở nƣớc ta, cũng nhƣ trên thế giới, nguồn keratin thô vẫn chƣa đƣợc khai thác và sử dụng đáng kể; đặc biệt là lông gia cầm; phần lớn thải ra từ các lò giết mổ đều chƣa đƣợc khai thác và xử lý hiệu quả. Chúng thƣờng bị tập trung lại thành các đống lớn; một số đƣợc chôn lấp, một số bị đốt, còn lại chƣa đƣợc xử lý, gây ô nhiễm nghiêm trọng môi trƣờng xung quanh các lò giết mổ. Hiện nay, ở nƣớc ta cũng chƣa có nhiều nghiên cứu nhằm sử dụng sản phẩm phân huỷ sinh học lông gia cầm làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi; vì vậy hầu nhƣ chƣa có ứng dụng nào trong thực tiễn nhằm xử lý theo hƣớng này. 1.3. SỰ PHÂN HUỶ KERATIN TRONG TỰ NHIÊN Thời gian cần thiết để lông gà thực sự bị phân huỷ tự nhiên là 5 - 7 năm. Trong tự nhiên, những vi sinh vật có enzim keratinaza có khả năng phân huỷ keratin gồm nhiều nhóm: nấm ( Aspergillus, Onygena, Absidia, Rhyzomucor, Alternaria radicina, Trichurus spiralis, Stachybotrys atra,…), xạ khuẩn, vi khuẩn (7, 10, 13, 20, 22, 24, 25, 29, 30, 31, 35, 39, 43, 44, 45). 1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN HUỶ KERATIN 1.4.1. Phƣơng pháp lý hoá Keratin có thể bị phân huỷ bởi các phƣơng pháp lý hoá nhƣ thuỷ phân trong môi trƣờng axit, môi trƣờng kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao. Nghiên cứu đầu tiên của việc sử dụng nhiệt để cải thiện giá trị dinh dƣỡng từ thức ăn phân huỷ lông vũ là của Draper (1944). Kể từ đó, nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện nhằm bổ sung thông tin nhằm nâng cao giá trị dinh dƣỡng từ thức ăn lông vũ thuỷ phân (23). Điều kiện chế biến có ảnh hƣởng rõ rệt đến giá trị dinh dƣỡng của thức ăn từ lông thuỷ phân. Ở áp suất thấp và thời gian thuỷ phân dài có thể nâng giá trị dinh dƣỡng và cải thiện khả năng tiêu hoá của động vật sử dụng thức ăn đó; tuy nhiên hiệu quả phân giải thấp. Thông thƣờng, lông đƣợc thuỷ phân bằng cách đun trong một nồi áp lực từ 30 đến 45 pounds/square/inch trong 30 đến 60 phút. Hiệu quả thuỷ phân có thể đạt 80 đến 85%. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không chỉ phá huỷ một số axit amin (methionin, lysin, histidin), sản sinh một số chất độc, nên khó sử dụng sản phẩm phân huỷ theo cách này để làm thức ăn cho chăn nuôi hay tận dụng nguồn protein cho các mục đích khác. Bên cạnh đó, phân huỷ lông vũ theo phƣơng pháp này còn tiêu thụ một lƣợng lớn năng lƣợng. Nhiều nơi, keratin thô bị xử lý bằng cách đốt. Phƣơng pháp này tạo ra một số khí gây ô nhiễm môi trƣờng đồng thời lãng phí nguồn protein từ keratin. 1.4.2. Phƣơng pháp sinh học Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phƣơng pháp thay thế đƣợc lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục đƣợc những hạn chế của các phƣơng pháp lý hoá. Ngƣời ta đã tiến hành phân lập đƣợc các vi sinh vật bao gồm cả nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn với nhiều chủng có hoạt tính keratinaza cao đƣợc sử dụng trong việc phân huỷ lông vũ và sử dụng sản phẩm phân huỷ đó làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi. Chúng là loài chung của nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn nhƣ: Doratomyces microsporus, Aspergillus sp, Alternaria radicina, Trichurus spiralis, Stachybotrys atra, Onygena sp, Absidia sp, Rhizomucor sp , Streptomyces pactum, S. albs, S. thermoviolaceus, S. fradiae , S.thermonitrificans , Flavobacterium pennavorans, Bacillus sp , Stenotrophomonas sp , Bacillus licheniformis và B. pumilus và Vibrio sp. Những vi sinh vật này tiết keratinaza ngoại bào khi môi trƣờng có keratin - phân huỷ keratin thành các axit amin hoặc các peptit ngắn, những chất này đƣợc vi sinh vật sử dụng làm nguồn cacbon và nitơ. 1.5. ĐẶC ĐIỂM CỦA KERATINAZA Keratinaza là enzim thuỷ phân protein ngoại bào trong tự nhiên. Keratinaza có tên IUB là EC 3.4.99, có trọng lƣợng phân tử từ hàng chục đến vài trăm kDa. Keratinaza chủ yếu đƣợc xếp vào nhóm proteaza serin do có đến 97% cấu trúc giống với cấu trúc của proteaza serin và cũng bị ức chế bởi các chất ức chế proteaza serin (7, 40). Hầu hết các keratinaza đã phát hiện đƣợc cho đến nay là serin proteaza (5, 7, 12, 22), và một vài Metallo proteaza (6). Hầu nhƣ tất cả các keratinaza là enzim cảm ứng và các vật liệu có chứa keratin khác nhau nhƣ lông, tóc và lông cừu có thể đƣợc sử dụng làm chất nền cho keratinaza sản xuất (17). Trong đó, lông là chất nền chủ yếu đƣợc sử dụng. Keratinaza ở vi sinh vật chỉ đƣợc tạo thành khi môi trƣờng có mặt keratin. Các keratinaza của vi sinh vật có vai trò sinh học rất quan trọng đối với mục tiêu thuỷ phân các liên kết ngang disulfua bền vững của các hợp chất keratin. Nó chủ yếu tấn công vào các liên kết -S-S- của phân tử keratin. Cơ chế phân giải phức tạp của chúng liên quan đến sự hoạt động đồng thời của hệ thống phân giải sunfua và phân giải protein. Keratinaza hoạt động ở khoảng nhiệt độ và pH tƣơng đối rộng nhƣng tốt hơn điều kiện môi trƣờng hơi kiềm và là loại enzim ƣa nhiệt. Thức ăn thuỷ phân Sản xuất thuốc Phân bón Chất tẩy rửa KERATINAZA Công nghiệp da Sản xuất khí Công nghiệp dệt sinh học may Thuỷ phân prion * Ứng dụng làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi Thí nghiệm trên gà, ngƣời ta nhận thấy rằng lông thuỷ phân đƣợc cân bằng về một số axit amin, có thể thay thế đậu nành nhƣ là một nguồn protein chiếm tới 70% trong khẩu phần. Gần đây hơn, sản phẩm Keratinaza đƣợc thử nghiệm nhƣ là một enzim cho ăn trực tiếp trong thức ăn của gà. Khi gà thiếu nhiều protein trong khẩu phần (80% nhu cầu) thì Keratinaza trong khẩu phần có thể cải thiện sinh trƣởng của gà. Trong 3 tuần đầu tiên, tỷ lệ biến đổi thức ăn là 2,03 đối với khẩu phần đƣợc bổ sung Keratinase. Tỉ lệ biến đổi thức ăn đối với khầu phần đối chứng đủ protein là 1,83. Nhiều thí nghiệm đang đƣợc nghiên cứu để thiết lập giá trị dinh dƣỡng của Keratinaza (23). * Ứng dụng trong điều trị bệnh bò điên Keratinaza phân huỷ lông và PrP SC có cấu trúc tƣơng tự nhau, cả hai đều có cấu trúc protein B và có sức đề kháng với hầu hết proteaza. Một thí nghiệm gần đây đã đƣợc tiến hành ở ID-Lelystad, Hà Lan. Tế bào não BSE đƣợc xử lý và chẩn đoán bằng phƣơng pháp chuẩn, ngoại trừ là các mô đồng nhất đƣợc nấu trƣớc và đƣợc tiêu hoá bởi PWD-1 Keratinase. Rất là thú vị, PrP SC đƣợc coi là hoàn toàn tự phân huỷ hay tự thuỷ phân bởi enzyme . Khám phá đầu tiên này cho thấy có thể phát triển một quá trình enzim, sử dụng keratinaza từ chủng Bacillus subtilis PWD-1, để khử các dụng cụ y tế truyền nhiễm và các sản phẩm gia súc. * Ứng dụng trong công nghệ thuộc da Công nghệ tẩy lông thông thƣờng sử dụng vôi và natri sulphua, đây là nguồn ô nhiễm lớn. Sử dụng keratinaza để tẩy lông trong thuộc da rút ngắn thời gian xử lý, giảm chi phí sản xuất, nâng cao chất lƣợng sản phẩm. Proteaza kiềm có trong chế phẩm đã thuỷ phân các protein không phải là colagen nhƣ albumin, glubulin và keratin mềm, không tác động lên colagen ở lớp cật. Với chế phẩm enzim có hoạt độ proteaza 3000 U/g (hoạt độ keratinaza 700 U/g), lƣợng enzim bổ sung với nồng độ 2% (khối lƣợng da), thời gian ngâm là 6 - 7 giờ, hiệu quả tẩy lông đạt 90 - 93% (1). * Ứng dụng trong công nghiệp dệt Keratinza đƣợc sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo đƣợc tạo ra bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi đƣợc bóng, dễ nhuộm. Keratinaza có tác dụng thủy phân lớp protein serin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lƣợng hoá chất để tẩy trắng. * Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn đƣợc sản xuất vào năm 1956 với tên BIO- 40 đƣợc thu nhận từ Bacillus subtilis. Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dƣới tên thƣơng mại là BIOTEX đƣợc chiết xuất từ Bacillus licheniformis. Và đến gần đây, tất cả các proteaza bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trƣờng đều là proteaza serine đƣợc sản xuất từ các chủng Bacillus , và chủ yếu là từ Bacillus subtilis (1). Trên thế giới, mỗi năm ngƣời ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lƣợng enzim proteaza (17). Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ 2.1.1. Vật liệu - Các mẫu đất chôn lông gà từ 1 đến 6 tháng thu thập từ các vị trí khác nhau tại các huyện Thanh Hà, Ninh Giang tỉnh Hải Dƣơng; quận Hà Đông thành phố Hà Nội. Các mẫu đất này đƣợc sử dụng để phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza. Các mẫu đất được sử dụng trong nghiên cứu: Mẫu A: Đất vƣờn, đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại xã Thanh Hồng, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dƣơng. Mẫu B : Đất vƣờn, đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại xã Hợp Đức, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dƣơng. Mẫu C: Đất ở nơi thải lông của cơ sở giết mổ gia cầm tƣ nhân, thị trấn Thanh Hà, huyện Thanh Hà, Hải Dƣơng. Mẫu D: Đất vƣờn, đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại huyện Ninh Giang, tỉnh Hải Dƣơng. Mẫu E: Đất đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại quận Hà Đông, Hà Nội. - Lông gà, tóc, 2.1.2. Hoá chất Các hoá chất đƣợc sử dụng nghiên cứu hầu hết là các hoá chất đƣợc nhập ngoại của các hãng Sigma, Merc, Aldrich,… 2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ đất 2.2.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào và khả năng sinh bào tử của các chủng sinh keratinaza để phân loại chúng 2.2.3. So sánh khả năng sinh keratinaza của các chủng vi khuẩn 2.2.4. Xác định một số điều kiện tối ƣu hoá môi trƣờng nuôi cấy 2.2.4.1. Xác định ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy 2.2.4.2. Xác định ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu 2.2.4.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu 2.2.5. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và một số ion kim loại đến hoạt tính keratinaza 2.2.5.1. Xác định hoạt tính keratinaza 2.2.5.2. Xác định ảnh hưởng của pH 2.2.5.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ 2.2.5.4. Xác định ảnh hưởng của một số ion kim loại Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. SỰ PHÂN RÃ CỦA LÔNG GÀ KHI ĐƢỢC SỬ DỤNG LÀM NGUỒN CACBON VÀ NITƠ DUY NHẤT ĐỂ NUÔI CẤY VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập đƣợc 13 chủng vi khuẩn dựa trên sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc (phụ lục 1). Các chủng sau khi đƣợc kiểm tra hoạt tính keratinaza bằng cách nuôi lắc trong môi trƣờng phân lập, tuyển chọn giống vi khuẩn có hoạt tính keratinaza nói trên ở 37 0 C, 150 vòng / phút trong 6 ngày, chủng có hoạt tính keratinaza đã làm phân rã lông gà có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng. Trong nghiên cứu này đã phân lập đƣợc 6 chủng có hoạt tính keratinaza. Những chủng này có thể sinh trƣởng, phát triển trên môi trƣờng chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất. 3.2. PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA Sau khi nhuộm Gram, quan sát dƣới kính hiển vi, hình dạng tế bào các chủng đƣợc mô tả nhƣ bảng 3.1: Bảng 3.1: Hình thái tế bào các chủng sinh keratinaza Chủng Hình thái tế bào Kr 1 Gram dƣơng, tế bào hình que, tạo thành chuỗi. Kr2 Gram dƣơng, tế bào hình que tƣơng đối đồng đều, ở 2 đầu vuông, tạo thành chuỗi 2 - 4 tế bào. Kr3 Gram dƣơng, tế bào xếp thành từng đôi hay từng chuỗi , số ít phân tán hoặc tập trung thành đám. Kr4 Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, các tế bào dạng đơn hoặc xếp đôi, 2 đầu hơi tròn. Tế bào già tròn và hơi nhẵn hơn, đôi khi có hình thoi tù 2 đầu. Kr5 Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, tạo thành chuỗi. Kr6 Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, đơn lẻ hoặc xếp đôi, ít khi dạng chuỗi. Tiến hành đun dịch nuôi pha loãng của chúng ở 80 0 C trong thời gian 15 phút, để nguội rồi cấy trải trên môi trƣờng NA, ủ ở 37 0 C trong 24h thấy đều mọc thành các khuẩn lạc; chứng tỏ đây là các chủng sinh nội bào tử. Hình thái khuẩn lạc quan sát đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc các chủng có hoạt tính keratinaza Chủng Đặc điểm khuẩn lạc Kr1 Tạo khóm lớn màu trắng sữa, bề mặt nhăn nheo, xù xì Kr2 Tròn, to, ở giữa có núm lồi lên có màu trắng ngả vàng nhạt, hơi bóng, nhớt. Kr3 Tròn, bờ riềm không đều, có màu vàng nhạt chuyển dần sang xám, xù xì, khô, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn và có núm lồi ở giữa. Kr4 Khuẩn lạc hình tròn đều, hơi lƣợn sóng, nhẵn, thƣờng có các vòng tròn đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa chuyển sang màu kem, có khi nâu nhạt có ánh mờ đục. Kr5 Khô, hình tròn, màu trắng, có vòng tròn màu trắng trên bề mặt, không nhăn. Kr6 Tròn, rất bóng và nhớt, ngả vàng Từ các thí nghiệm trên có thể khẳng định các chủng sinh keratinaza trên đều thuộc chi Bacillus. 3.3. XÁC ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA MẠNH NHẤT Từ 6 chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza đã phân lập đƣợc, tiến hành mức độ hoạt động của enzim bằng 2 cách sau: - Nuôi lắc trong môi trƣờng chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất, 150 vòng / phút ở 37 0 C trong 10 ngày. Sau đó, so sánh tốc độ phân huỷ lông gà của các chủng sinh keratinaza theo phƣơng pháp Saville (1958) Bảng 3.3: Hoạt tính keratinaza của 6 chủng sinh keratinaza Chủng Phần trăm lông gà bị phân huỷ Kr1 58,5 Kr2 70 Kr3 60,5 Kr4 55,5 Kr5 60 Kr6 50 - Đánh giá hoạt tính keratinaza của các chủng bằng cách: Đục giếng thạch có đƣờng kính 10 mm trên các đĩa thạch có cơ chất là sữa gầy; nhỏ 0,15 ml dịch enzim thô vào các giếng thạch; giữ ở 4 0 C trong tủ lạnh 12h rồi mang ra ngoài khoảng 15 phút sau đó đƣa vào tủ ấm 37 0 C ủ trong 24h. Hoạt tính của keratinaza đƣợc xác định bằng đƣờng kính vòng phân huỷ trong suốt xung quanh giếng thạch, tính bằng mm. Kết quả nhƣ sau: Bảng 3.4: Hoạt tính keratinaza của dịch nuôi 6 chủng sinh keratinaza Chủng Đƣờng kính vòng phân huỷ (cm) Kr1 1,8 Kr2 2,2 Kr3 2,0 Kr4 1,7 Kr5 1,9 Kr6 1,5 Kết quả ở bảng 2 cho thấy chủng Kr2 thể hiện hoạt tính keratinaza mạnh nhất. Chủng này đƣợc tìm thấy ở mẫu đất A. 3.4. MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU HOÁ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY 3.4.1. Ảnh hƣởng của lƣợng lông đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất là Kr2 đƣợc nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 30 0 C, pH = 7 trong các môi trƣờng có hàm lƣợng lông khác nhau, cụ thể là 5, 10, 15, 20, 25 g / l trong môi trƣờng cơ bản, tỉ lệ lông bị phân giải nhƣ sau: Bảng 5: Ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy Hàm lƣợng lông (g/l) Tỉ lệ lông bị phân giải (%) 5 20,5 10 34 15 41 20 50 25 32 Nhƣ vậy, khả năng sinh keratinaza phụ thuộc vào hàm lƣợng lông đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Kết quả cho thấy, ở nồng độ lông vũ là 20 g/l cho hiệu quả phân giải cao nhất. Ở hàm lƣợng thấp hơn, hiệu quả phân giải lông vũ cũng thấp hơn. Tuy nhiên, ở hàm lƣợng cao hơn, hiệu quả phân giải cũng giảm. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Cheng et al. (1995) cho rằng hàm lƣợng lông cao làm tăng độ nhớt của môi trƣờng, có thể dẫn đến hạn chế oxy cho vi khuẩn phát triển. 3.4.2. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu Chủng Kr2 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 30 0 C trong các môi trƣờng có pH khác nhau, cụ thể là pH 6, 7, 8, 9, 10 trong môi trƣờng cơ bản, tỉ lệ lông bị phân giải nhƣ sau: Bảng 6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu đến khả năng sinh keratinaza pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu Tỉ lệ lông bị phân giải (%) 6 27,5 7 34 8 33 9 28 10 18,5 Nhƣ vậy, pH tối ƣu cho nuôi cấy chủng Kr2 để cho hiệu quả sinh keratinaza phân giải lông vũ là khoảng 7 - 8. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với một số báo cáo trƣớc đây về keratinaza mà thuộc về proteaza kiềm (Altalo và Gashe, 1993; Cheng et al, 1995), cho rằng keratinaza sản xuất bởi các loài vi khuẩn Bacillus hoạt động tích cực nhất trong môi trƣờng trung tính hoặc hơi kiềm. 3.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy ban đầu Chủng Kr2 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng / phút, pH = 8 trong các môi trƣờng có nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 25 0 C, 30 0 C, 35 0 C, 40 0 C, 45 0 C trong môi trƣờng cơ bản, dựa vào tỉ lệ lông bị phân giải cho thấy nhiệt độ tốt nhất cho nuôi cấy chủng Kr2 là 35 0 C. 3.5. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KERATINAZA 3.5.1. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính keratinaza Tiến hành thí nghiệm so sánh hoạt tính keratinaza của 6 chủng nói trên ở các pH khác nhau kết quả nhƣ sau: Hình 3.1: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính keratinaza Kết quả ở hình 3.1 cho thấy keratinaza từ 6 chủng đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11. Ở vùng pH nhỏ hơn 7, hoạt tính keratinaza bị giảm còn dƣới 60%. Trong 6 chủng nói trên, chủng có hoạt tính keratinaza tốt nhất là Kr2 có pH tối ƣu cho hoạt động của keratinaza là 9. Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2 pH U/ml 6 26,9 7 33,9 8 36,5 9 44,0 10 37,4 11 34,3 [...]... Kr2 có hoạt tính keratinaza cao nhất pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của keratinaza của chủng này là pH = 9 và nhiệt độ 500C 5 Hoạt tính của keratinaza tăng khi trong môi trƣờng phản ứng có mặt của một số ion : Na+, Ca2+, K+, Mg2+, đặc biệt là ion Ca2+ , ở nồng độ 5 mM; và giảm hoạt tính khi trong môi trƣờng phản ứng có mặt một số ion nhƣ: Fe3+, Cu2+ 6 Điều kiện nuôi tốt nhất cho khả năng sinh keratinaza. .. thấp, chúng có tác dụng hoạt hoá keratinaza (1) Một số ion nhƣ: Fe3+, Cu2+ lại làm giảm hoạt tính của keratinaza KẾT LUẬN 1 Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập đƣợc 6 chủng có hoạt tính keratinaza Các chủng này đều có khả năng sử dụng lông gà nhƣ là nguồn cacbon và nitơ duy nhất 2 Cả 6 chủng này đều thuộc chi Bacillus 3 Keratinaza từ 6 chủng phân lập đƣợc đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11 và trong... 3.9: Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2 Ion Enzim ban đầu Na+ Ca2+ K+ Mg2+ Fe3+ Cu2+ Hoạt độ tƣơng đối (%) 1mM 5mM 100 100 110 118 132,5 122 102,5 105 105 104 45,5 42 17,5 14,5 Hoạt tính keratinaza tăng khi có mặt của một số ion nhƣ: Na+, Ca2+, K+, Mg2+, đặc biệt là ion Ca2+ , do trong cấu tạo của phân tử keratinaza có mặt của 2 ion Ca2+ ; do vậy, khi có mặt trong... hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza Tiến hành thí nghiệm so sánh hoạt tính keratinaza của 6 chủng nói trên, kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza Kết quả ở hình 2 cho thấy keratinaza từ 6 chủng đều hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 30 - 600C Trong 6 chủng nói trên, chủng có hoạt tính keratinaza tốt nhất là Kr2 có nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của. .. ƣu cho hoạt động của keratinaza là 500C Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2 Nhiệt độ (0C) 30 40 U/ml 38,0 44,5 50 60 54,3 48,8 3.5.3 Ảnh hƣởng của một số ion kim loại Keratinaza thu đƣợc từ các chủng sẽ chịu ảnh hƣởng của các ion kim loại lên hoạt tính ở các mức độ khác nhau Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của một số ion kim loại lên hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2... năng sinh keratinaza của chủng Kr2 là môi trƣờng ban đầu có hàm lƣợng lông là 20 g/l, pH = 7-8, nhiệt độ khoảng 350C KIẾN NGHỊ 1 Tiếp tục nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn sinh keratinaza ứng dụng vào phân huỷ lông gia cầm làm thức ăn bổ sung cho chăn nuôi và một số ứng dụng khác 2 Ngoài các chủng sinh keratinaza tự nhiên, có thể tiếp tục nghiên cứu tạo các chủng tái tổ hợp sinh keratinaza cao hơn 3... thông số kĩ thuật cho lên men sinh tổng hợp keratinaza của chủng có khả năng sinh keratinaza cao nhất, tiến tới sản xuất ở quy mô công nghiệp: nhiệt độ lên men, pH môi trƣờng, mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng, thời điểm thu hồi keratinaza 4 Thu nhận và tinh chế keratinaza có độ tinh khiết cao References Tiếng Vi t 1 Nguyễn Văn Hiếu (2012), Nghiên cứu thu nhận protease kiềm tái tổ hợp có hoạt tính. .. keratinase từ vi khuẩn và ứng dụng trong công nghiệp thuộc da, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Bách khoa Hà Nội 2 Ngô Tự Thành (2001), Sự phân bố, sinh trƣởng và sinh tổng hợp proteaza ngoại bào của Bacillus ở vùng Hà Nội, Tạp chí Sinh học, số 23 (3a), tr.153-157 3 Võ Thị Thứ (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của một số chủng thuộc chi Bacillus, Luận án Tiến sĩ Khoa học, Vi n CNSH,... microbial keratinase Animal Feed Science and Technology, 126, 135–144 17 Gupta, R., & Ramnani, P (2006) Microbial keratinases and their prospective applications: An overview Applied Microbiology and Biotechnology, 70,21–33 18 Guvin Govinden , Daneshwar Puchooa (2012) Isolation and characterization of feather degrading bacteria from Mauritian soil African Journal of Biotechnology Vol 11(71), pp 13591-13600... keratinolytic activity of dermatophytes in vitro Mycopathologia, 114, 1-8 42 Williams, C.M.; Lee, C.G.; Garlich, J.D.; Shih, J.C.H (1991) Evaluation of a bacterial feather fermentation product, feather lysate, as a feed protein Poultry Science, 70, 85-94 43 Wojciech Łaba, Anna Rodziewicz (2010) Keratinolytic Potential of Feather-Degrading Bacillus polymyxa and Bacillus cereus.Polish J of Environ Stud Vol . tình hình khai thác và sử dụng keratin hiện nay. Tiến hành nghiên cứu phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim. Trình bày. cùng với đó, vi c xử lý rác thải chƣa đƣợc quan tâm nhiều. Đề tài " ;Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim& quot; đƣợc