1 Antiinflammatory studies of soot and theformer plant through TLR4 receptors Nguyen Thi Tuoi Hanoi University of Science, VNU; Faculty of Biology Major: Biochemical; Code:60.42.30 Supervisors: Dr. Trinh Tat Cuong Date of Presenting Thesis: 2012 Abstract u ngi c n xut cytokine tiu t c hiu ca TLR4,   d c ch cu ngi cnh c ch yu t t -activated protein  c ch cu ngi c o phn u t c hiu TLR4,    dng LPS. Keywords. Sinh hc thc nghi ni cu; Th th; Ch Thc vt  Content I. Lý do chọn đề tài: ng t   chng lnh t ng  ngoc bi bnh. Kt qu ci b hoc triu kiy, u thi gian tn t chuyn t n cng hu qu . Nh i phi k i loi cht, n hong c n dn suy gim cha th 2 Do vu tr m bng bt li ci v  ht sc quan trng hic biu tr b  bic chn g yc tng hi thu    ng ph n. S dng thuc n gc thc v gii quyt nhng lo ng hiu qu p. n nay, vit chn gc t thc vc i nhng hiu qu chim Tr i hc Khoa hc T  c  t ch  Wedelolactone t  nt vu khc kh ng         “Nghiên cứu khả năng chống viêm của cây nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ thể TLR4”. II. Mục tiêu đề tài c chu ngi cu trong t  th TLR4. c kh i cu trong t  th TLR4. III.Nội dung nghiên cứu 3  u ngi cn xut cytokine tiu t c hiu ca TLR4,   dng LPS. 2 c ch cu ngi cc ch yu t t MAPK ( mitogen-activated protein kinase).  c ch cu ngi co phn u t c hiu TLR4,   dng LPS. IV. Phương pháp nghiên cứu 1.Tách chiết macrophage từ tủy xương của chuột T i th a chuc  c b ng u ki        u t   -CSF (macrophage-specific              5 M 2-mercaptoethanol. 2.Đánh giá hoạt tính độc tố của Wedelolactone tới khả năng sống của BMDM bằng kít CCK-8 Kh  ng ca t     ng s dng Cell Counting Kit-8 (CCK-8,      c  c  c Dexamethasone (Dex) trong mt s thi gian nha dung dch CCK-c  i Wedelolactone trong 1 gi. Kh p th c  n hp th  450nm ca mi m      l ph   i m  c x  i Wedelolactone ho ng). 3. Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSor  mt k thu  m. Hin c s dng r c bi kin phm sinh hc. 4 c hi-  m   c gt b mt  - antibody bic "ra" qua b m c gn kt vi enzyme t; enzyme s bi c 4. Phương pháp Western blot  nh mt loi protein trong mu sinh hc b    SDS-page (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), c thc hin theo c g d   c min d     c g  th  n dch (immunoblotting) 6,3. t k thup thc hi                      n di s c chuy c  vi mt dung dch ch c hiu vc  s gng   bng phn ng enzyme hi c v    t s  c dm mn s t ca mt hoc mt s lo cn nghiu trong hn hp phc tp. 5. Phân tích ức chế của Wedelolactone trong quá trình tạo phản ứng oxy hóa[17] c s i Laminarin hoi c  vi Wedelolacto t c  vi DHE (Fluorescent Dyes (dihydroethidium) - cht hu   2 . Nhng t  c kim tra bng laser-scanning confocal  nh m u cc x  5 6.Phân tích thống kế i v lic ly t t qu c lc th hi -u chnh Bonferroni hoc Ai vi nhi   c ch ng P< 0.05. V. Kết quả nghiên cứu 1. Khả năng sống của tế bào không bị ảnh hưởng bởi Wedelolactone Hình 12. Biểu đồ Wedelolactone không gây độc đối với tế bào BMDM 0 50 75 100 DM 10 20 30 (µg/ml ) Kh  sng ca t  6 BMDMi m  5 t ng. Sau 3- c x  i Wedelolactone   l  bm t  liu ch ra s sai s cc lp. 2. LPS kích thích tế bào BMDM sinh cytokine Hình 13: Biểu đồ LPS kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm. BMDMs t chuc  vi LPS 100 (ng/ml). Dch t c  vi LPS   nhau l gi, 4 gi, 8 gi, 18 gi, 48 gi s i vn xut cytokine bt qu c biu hin sai s c lp. TNF-α 0 5000 10000 15000 0 4 8 18 48 (h) 0 500 0 1000 0 1500 0 0 4 8 18 48 (h) 0 50 0 100 0 150 0 0 4 8 18 48 (h) 0 200 0 400 0 600 0 800 0 0 4 8 18 48 (h) IL-6 INF-ү IL-10 Quá trình tiết của cytok ine (pg/ ml) Quá trình tiết của cytoki ne (pg/m l) 7 3. Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine thông qua thụ thể TLR4 kích thích bằng LPS Hình 14: Biểu đồ Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM được kích thích bằng LPS. BMDMs t chuc  i Wedelolactone    hoi chc khi  vi vi LPS 100 (ng/ml). Dch sau khi t c  vi LPS 18 gi s i vn xut cytokine bng t qu c biu hin sai s c li chng; W: Wedelolactone). DM 2.5 5 10 20 (µg/ml ) 0 500 0 10000 15000 DM 2.5 5 10 20(µg/ml ) TNF-α IL-6 0 5000 10000 15000 DM 2.5 5 10 20(µg/ml ) 0 500 100 0 150 0 DM 2.5 5 10 20 (µg/ml ) INF-ү 0 2000 4000 6000 8000 IL-10 8 4. Wedelolactone ức chế quá trình phospho của yếu tố tự phân bào bằng LPS kích thích thông qua thụ TLR4 Hình 16. Wedelolactone đã ức chế quá trình phospho của ERK1/2 và p38 trong BMDM c  i Wedelolactone (20 c Dexamethasone (100nM) trong 45  p tc  vi LPS (100ng/ml) trong 18 gi  nh            i chng: SD; Wedelolactone: W; Dexamethasone: Dex). 5. LPS kích thích hoạt động p47 phox trong quá trình tạo ra ROS p47phox-ser345 p47phox Hình 18. LPS kích thích quá trình phospho hóa của p47phox trong BMDM. ERK p38 M SD W SD Dex P-ERK P-p38 LPS 0 5 15 30 60 120 (min) LPS 9 c  vi LPS (100ng/ml) ti m t  t  nh    6. Dầu ngải cứu không gây độc đối với BMDM VI. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. c ch n xut cytokine tic ch  i n  th  bng cu t c hiu LPS. 2.   c ch     a yu t t     (extracellular-signal-regulated kinases 3.        ng c ch     a p47phox. 4. Tinh du ngi c c ch n xut cytokine h th u t c hiu LPS. 25 50 75 100 TỶ LỆ TẾ BÀO SÔNG (%) ĐC 10 20 40 (µg/ml ) 10 KIẾN NGHỊ 1. Tit cht thuc cu t ca th th Glucocorticoid. 2.  u tr chut b nhim khun b chut vi LPS ca Wedelolactone. References Tài liệu tiếng Việt 1.       , ,     , ,    (2009),                  (Premna corymbosa Rotteneen)     , Tp ch Dưc hc, 48(389), tr. 22-24. 2. ng Dim Hn, Nguyn Trng u kh  rong to bin ViTp ch Hoá hc, 46(5A), tr. 81-90. 3.    di truyn h   i Hc Qui. 4.  Tt Li (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y hi. 5.  Tt Li (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Namt bn khoa h k thui. 6.    Kỹ thuật di truyền và ứng dụng i Hc Qui. 7.  ,   ,        ,      ,  (2010),                    (Sapium sebiferum)     , Tp ch Dưc hc, 50(411), tr. 36-39. 8. , ,     ,     ,  (2010),                  (Clerodendrum Chinese var. simplex (Mold) SL Chen)     , Tp ch Dưc hc, 50(414), tr. 20- 23. [...]... Pharmcodynamic Therapy, 165, pp 294-301 22 Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, Takeda Y, Takeda K, and Akira S (1999), “Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4) -deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the LPS gen product”, Journal Immunology, 162, pp 3749–3752 23 Huang N, Hauck C, Yum MY, Rizshsky L, Widrlechner MP, Mccoy JA, Dixon PM, Nikolau BJ, Birt DF... Research in Ayurveda & Pharmacy, 1, pp 206-211 28 Kurt-Jones EA, Popova L, Kwinn L, Haynes LM, Jones LP, Tripp RA, Walsh EE, Freeman MW, Golenbock DT, Anderson LJ (2000), “Pattern recognition receptors TLR4 and CD14 mediate response to respiratory syncytial virus”, Nature Immunology, 1, pp 398–401 29 Lee S, Shin S, Kim H, Han S, Kim K, Kwon J, Kwak J H, Lee C K, Ha N J, Yim D, Kim K (2011), “Anti-inflammatory .    Nghiên cứu khả năng chống viêm của cây nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ thể TLR4 . II. Mục tiêu đề tài c. tiết của cytok ine (pg/ ml) Quá trình tiết của cytoki ne (pg/m l) 7 3. Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine thông qua thụ thể TLR4