Nghiên cng di truyn ngun gen bông c (Gossypium arboreum L.) phc v lp b gen kháng bnh xanh lùn Nguyn Thanh Quân i hc Khoa hc T nhiên, Khoa Sinh hc LuChuyên ngành: Sinh hc Thc nghim; Mã s: 60 42 30 ng dn: TS. Nguyn Th Thanh Thy o v: 2011 Abstract: Thu thp mt s ging bông c có tit cao, cht   t và mt s dòng bông kháng b      kháng bnh xanh lùn và mt s c tính nông sinh hc chính ca các ging p. S dng ch th phân t  phân tích mi quan h di truyn phân t gia các ging bông cnh cp ging bông vi kháng bnh và ging bông không kháng bt v ng si làm vt liu lai to qun th, phc v lp b phân t gen kháng bnh xanh lùn Keywords: Sinh hc thc nghim; ng di truyn; Gen; Bông c; Bnh xanh lùn Content Cây bông (Gossypium L .)             ,            n khí hu nhi   cn nhi  .            n cho hàng tri               .            p dt may. Tuy nhiên,            . Hi   20         bnh xanh lùn hay còn gnh xanh lá (cotton blue disease)               (Correae et al., 2005).                  n nay chính là vi                       bông kháng bnh xanh lùn.   , : Nghiên cƣ ́ u đa da ̣ ng di truyê ̀ n nguô ̀ n gen bông co ̉ (Gossypium arboreum L.) phục vụ lập ba ̉ n đô ̀ gen kháng bnh xanh lùn. 1.1. Mục tiêu của đề tài Thu th         p n     ng kháng/     ,                 (SSR),                nh. 1.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài 1. Thu thp mt s ging bông c có tit cao, cht và mt s dòng bông kháng bnh xanh lùn. nh xanh lùn và mt s c tính nông sinh hc chính ca các gip. 3. S dng ch th phân t  phân tích mi quan h di truyn phân t gia các ging bông c.   nh cp ging bông vi kháng bnh và ging bông không kháng bnh t v ng si làm vt liu lai to qun th, phc v lp b phân t gen kháng bnh xanh lùn. Phần 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc triển khai đề tài 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Vật liệu thực vật 30 ging bông c (Gossypium arboreum L.) nhp nc chn lc t ngun gen có sn ca Vin nghiên cu Bông và PTNN Nha H và nhng ging c thu thp t c Vit Nam, ng 2.1). Bảng 2.1. Tên và nguồn gốc của 30 giống bông cỏ thu thập đƣợc TT MS TĐ Tên giống Nguồn gốc TT MS TĐ Tên Giống Nguồn gốc 1 2 C Thanh Hóa Vit Nam 16 77 91-B-16  2 3  Vit Nam 17 78 91-B-36  3 5 C Phú Khánh Vit Nam 18 79 BAA (bar x arb)  4 6 C Ngh An Vit Nam 19 80 BAA (bar x arb)  5 7 C Bc Ái Vit Nam 20 81 BAA (bar x arb)  6 15 AK-235  21 82 BAA (bar x arb)  7 18 Lc Ngn Vit Nam 22 83 BAA (bar x arb)  8 34 B2III4  23 85 BAA (bar x arb)  9 35 B2IV10  24 86 BAA (bar x arb)  10 42 Akola  25 87 BAA (bar x arb)  11 43 Tka 283  26 92 BAA (bar x arb)  12 44 Tka 188  27 93 BAA (bar x arb)  13 46 Ava Liên Xô 28 94 BAA (bar x arb)  14 75 B10  29 100 Không tên  15 76 91-L1-2  30 101 Không tên  * Chú thích Mã s t 2.1.2. Các cặp mồi SSR 50 cp mi SSR cho cây bông, bao gm 6 nhóm mi khác nhau: BNL (Brookhaven National Laboratory, 2007), MUCS (Mauricio Ulloa, 2005), MUSS (Mauricio Ulloa, 2005), NAU (Nanjing Agricultural University, 2007), STV (Taliercio E, Scheffler J. 2006), TM (John Yu, 2002) (Bng 2.2). Bảng 2.2. Các nhóm mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu TT Nhóm mồi Nguồn gốc Số cặp mồi sử dụng 1 BNL Brookhaven National Laboratory, 2007 20 2 MUCS Mauricio Ulloa, 2005 6 3 MUSS Mauricio Ulloa, 2005 4 4 NAU Nanjing Agricultural University, 2007 10 5 STV Taliercio E, Scheffler J. 2006 4 6 TM John Yu, 2002 6 Tổng số 50 2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT SỬ DỤNG 2.2.1. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn c tin hành da trên m biu hin bnh xanh lùn theo 4 cp cc ghi nh + Cp 0: Không nhim bnh + C bin dng nh + Cm và b bin dng d nhn thy + Cp 3: Lá có màu xanh nht, b bin dng nhiu và gân lá vàng m kháng/nhim: Cây có bnh c bnh 1-m. 2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc tính nông sinh học của các giống bông  c tính nông sinh hc ca các ging bông c da trên 3 nhóm ch tiêu chính: (1) Nhóm ch tiêu v ng: Thời gian sinh trưởng (ngày); Chiều cao cây (cm); Số cành đực/cây; Số cành quả/cây; Vị trí cành quả 1 (đốt). (2) Nhóm ch tiêu v t và các yu t ct: Khối lượng quả (g); Số quả/cây; Năng suất lý thuyết (tạ/ha); Khối lượng 100 hạt (g); Tỷ lệ xơ (%); Năng suất bông hạt (tạ/ha); Năng suất bông xơ (tạ/ha). (3) Nhóm ch tiêu v ht, t l : Chiều dài xơ (mm); Độ đều xơ (%); Độ mịn xơ (mix); Độ chín xơ (%); Độ bền xơ (g/tex). S liu theo dõi v các ch c tính nông sinh hc các ging c nhp vào phn mm thng kê IRRISTAT v.4.0 (IRRI, 1998)  x lý. 2.2.3. Phương pháp phân tích đa hình di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR 2.2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số và quy trình chạy phản ứng PCR a) Tách chit ADN tng s ADN c tách chit và tinh sa Doyle, J.J. và cs. (1987). Quy trình tách chit ADN tng s: - Mc nghin mng trong ng eppendorf 2ml - Thêm 1ml dung dm chit -  65  C trong 90 phút, c 15 phút lu mt ln. - Cho 500µl chloroform:isoamyl alcohol (24:1), lc nh  tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút. - Chuyn phn dch phía trên sang ng eppendorf m t thu kt ta. - Ra kt ta b  thu ta. - Tip tc ra b  thu ta. -   - Kh ARN bng cách thêm 4µl RNAse/eppendorf trong t m 370C trong 3h. Kim tra ADN tng s: Chng và n ADN tng s c kim tra trên gel agarose 0.8%. N  Nanodrop. b) K thut PCR Phn   c tin hành trên máy chu k nhit Veriti 96well Thermal cycler. Tng dung dch phn ng là 15 µl bao gm 50ng ADN tng s, 0.15µM mi, 0.2 mM dNTPs, 1X d Taq TaKaRa. Bảng 2.1. Chƣơng trình chạy phản ứng PCR Các bƣớc Nhit độ ( o C) Thời gian Số chu kỳ Tác dụng 1 95 7 phút 1 Bin tính 2 94 55 15 giây 30 giây 40 Bin tính Gn mi 72 2 phút Tng hp 3 72 7 phút 1 Tng hp 4 4 Bo qun 2.2.3.2. Phân tích số liệu đa hình di truyền      ,    ,  allen cá bit,  (Polymorphism Information Content )           ng  (1)  %             . (2) Allen cá bi                     1          . (3)        (Botstein,1980)         : n s xut hin ca alen th ng vi mi i. Giá tr PIC càng ln tc là m a locus do mi i khui càng ln, tc là càng nhic sinh ra. - H s ng di truyn S: phn ánh m ging nhau và khác nhau gia các gi  tính toán h s  2 xy xy N S NN   S là h s ng; Nxy: là s  trí ca mu x và y; Nx, Ny: là s a mu x và y. - Khong cách di truyn d: d = 1 – S                           , trong  cùng mt v trí.      -      . ,                          UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages) Phần 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 ging bông c nhp nc tring rung ti Vin Nghiên cu Bông và PTNN Nha H i ca Vin (hình 3.1b). Mu lá non ca tng ging bông riêng bic thu thp m ca B môn Sinh hc phân t, Vin Di truyn Nông nghip  tách chit ADN tng s, phc v phân tích ch th phân t ng di truyn. Hình 3.1. Gieo trồng ngoài đồng (a) để duy trì và trong nhà lƣới (b,c) để lấy mẫu lá. 3.1. ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG CỦA CÁC GIỐNG BÔNG CỎ (G.arboreum L.) Kt qu nghiên cu cho thy, trong 30 ging bông c nh, ging bông c Ngh An là ging duy nht có biu hin kháng vi bnh xanh lùn, các ging còn lu có biu hin nhim bnh.  n hành chi vi tính kháng bnh xanh lùn trên ging bông c Ngh An, kt qu n lc 6 dòng biu hin tính kháng b -00-02, KXL-00-03, KXL-00-04, KXL-00-05 (bng 3.1). Nh làm vt li lai vi các dòng ging bông vi khác, to qun th con lai lp b gen kháng bnh xanh lùn. a b c Bảng 3.1. Kết quả chọn lọc các dòng kháng bnh xanh lùn của bông Ngh An. TT Dòng Tổng số cây Tỷ l bnh (%) Thời gian ủ bnh trung bình (ngày) 1 KXL-00-01 23 4,3 25,0 2 KXL-00-02 32 0 0 3 KXL-00-03 29 0 0 4 KXL-00-04 22 0 0 5 KXL-00-05 22 0 0 6 KXL-00-06 27 3,7 30,0 3.2. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC GIỐNG BÔNG CỎ NGHIÊN CỨU c tính nông sinh hc t 30 ging bông nghiên cu trê tài c 14 ging mang nht nht da trên các ch tiêu chính v     /ha) và ch     bn-g/tex). Nhng ging có phm cht tc trình bày  bng 3.2  Bảng 3.2. Một số giống bông cỏ tiềm năng đạt năng suất cao và chất lƣợng tốt TT MS TĐ Tên giống Thời gian sinh trƣởng (ngày) Năng suất bông xơ (tạ/ha) Độ bền (g/tex) 1 7 C Bc Ái 97,0 4,9 17,6 2 15 AK-235 100,0 5,7 20,6 3 18 C Lc Ngn 97,0 4,0 18,1 4 42 Akola 103,0 6,2 21,1 5 43 Tka 283 104,0 5,9 20,0 6 44 Tka188 102,0 5,3 19,2 7 46 Ava 99,0 5,6 19,6 8 75 B10 107,0 8,0 17,5 9 77 91-B-16 107,0 11,3 17,5 10 79 BAA(bar x arb) 107,0 4,3 20,5 11 80 BAA(bar x arb) 106,0 7,4 18,5 12 82 BAA(bar x arb) 106,0 5,9 17,5 13 86 BAA(bar x arb) 99,0 4,0 21,1 14 101 Không tên 106,0 5,1 22,8 Max 107,0 11,3 22,8 Min 97,0 4,0 17,5 Trung bình 102,9 5,9 19,4 14 ging bông c có tit cao và chng tt trên s  cho vic chn ra các ging b/m  lai vi các dòng kháng bnh to qun th F1 phc v cho vic lp b gen kháng bnh xanh lùn trên cây bông. 3.3. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG BÔNG NGHIÊN CỨU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR 3.3.1. Tách chiết ADN tổng số của các giống bông phục vụ phân tích SSR Mu lá non ca 30 ging bông c và 1 dòng bông kháng (KXL-00-02) sau khi c tách chit ADN tng s c n khá cao, t 200  1.500ng/µl. [...]... cho quá trình l p bản đồ gen kháng bệnh xanh l n ở cây bông 3.4 CHỌN CẶP LAI TRIỂN VỌNG TẠO QUẦN THỂ F1 PHỤC VỤ L P BẢN ĐỒ GEN KHÁNG BỆNH XANH L N Từ các kết quả nghiên cứu về những đặc tính nông sinh học của các giống bông nghiên cứu, đề tài đã chọn l c được 14 giống bông có tiềm năng năng suất tốt, chất l ợng cao (bảng 3. 2) Tuy nhiên, để chọn được những cặp lai triển vọng nhất để lai tạo F1, với... thế hệ F2 phục vụ việc l p bản đồ gen kháng bệnh xanh l n ở cây bông cỏ Nghệ An Bảng 3.6 Danh sách các giống bố mẹ dùng cho lai tạo quần thể F1 Giống mẹ Giống bố (giống nhận gen) (giống cho gen) Tương đồng di truyền với dòng KXL TT Mã số 1 7 Cỏ Bắc Ái Việt Nam 0,47 2 15 AK-235 Ấn Độ 0,35 3 42 Akola Ấn Độ 0,38 4 44 Tka188 Ấn Độ 0,41 5 46 Ava Nguồn gốc Liên Xô 0,50 TT Tên giống Nguồn gốc 1 KXL-0002 Nghệ... nhóm di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR với những thông tin nổi trội về đặc tính nông sinh học của tập đoàn bông nghiên cứu, đề tài đã chọn l c được một số dòng/giống bông đại di n cho các nhóm di truyền đồng thời có nguồn gốc khác nhau, xa cách về hệ số tương đồng di truyền Những giống này sẽ l nguồn vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo về tạo l p cơ sở dữ liệu nguồn gen cây bông nhằm phục vụ cho... tích đa hình di truyền cây bông 3.3.3 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống bông nghiên cứu Số liệu phân tích SSR với các giống bông tiếp tục được đưa vào xử l bằng phần mềm NTSYS pc2.1 để phân tích mức độ tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa các giống bông nghiên cứu Kết quả thu được ở bảng 3.5 và hình 3.5 Bảng 3.5 Mối quan hệ di truyền giữa 31 giống bông cỏ trong nghiên. .. với bệnh xanh l n l : KXL-00-02, KXL-00-03, KXL-00-04, KXL-00-05 2 Kết quả đánh giá các đặc tính nông sinh học đã sàng l c được 14 giống bông cho năng suất trên 4,0 tạ/ha và độ bền xơ trên 17,5g/tex phục vụ cho việc lai tạo quần thể F1 3 Kết quả phân tích đa dạng di truyền 31 dòng/giống bông với 15 chỉ thị phân tử SSR đã thu được được tổng số 34 allen, với trung bình 2,3 allen/locus Tần số allen... blue disease, cotton leafroll dwarf virus, confirms that it is a new member of the genus Polerovirus”, Archives of Virology, 155(1 1), pp 1849-1854 26 Dyck J.M (197 9), “Lamadie bleue de contonnier an Tchad (Blue disease of cotton in Chad)”, Cotton et Fibres Tropicales, 34( 2), pp 299-238 27 Diqiu Liu, Xiaoping Guo, Zhongxu Lin, Yichun Nie and Xianlong Zhang (200 5), “Genetic diversity of Asian cotton (Gossypium. .. kiểu gen của các giống bông đã xác định được các tổ hợp lai tiềm năng cho việc lai tạo quần thể l p bản đồ gen kháng bệnh xanh l n References Tiếng Việt 1 Nguyễn Thi ̣ Thanh Binh (199 9), Nghiên cứu bê ̣nh xanh lùn bông ở phía Nam và mộ t ̀ số biê ̣n pháp phòng tr ừ, Luâ ̣n án tiế n sỹ Nông nghiê ̣p , Viện Khoa học Nông nghiệp Việt NamViệt Nam, Hà Nội 2 Thái Thị L Hằng (200 8), Nghiên cứu ứng... nghiên cứu Hình 3.5 Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của các giống bông cỏ trong nghiên cứu Kết quả cho thấy độ tương đồng di truyền giữa các giống bông nghiên cứu dao động từ 0,26 đến 0,97 với giá trị trung bình l 0,61, điều đó cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về mặt di truyền giữa các giống bông nghiên cứu khá cao Hai giống bông cỏ nguồn gốc Ấn Độ, BC93 và BC94 (ký hiệu các giống bông. .. Virol, 150, pp 1357-1367 21 Costa A.S (195 7), “Anthocyanosis, a virus disease in cotton in Brazil”, Phythopathologische Zeitschrift, 28, pp 167-186 22 Candida H.C de Magalhaes Bertini, Ivan Schuster, Tocio Sediyama, Everaldo Goncalves de Barros and Maurilio Alves Moreira (200 6), “Characterization and genetic diversity analysis of cotton cultivars using microsatellites”, Genetics and Molecular Biology,... SS, Cheung F, Lee JJ, Ha M, Wei NE, Sze SH, Stelly DM,Thaxton P, Triplett B, Town CD, et al (200 6), “Accumulation of genome-specific transcripts, transcription factors and phytohormonal regulators during early stages of fiber cell development in allotetraploid cotton”, Plant J, 47, PP 761–775 39 Zhao XP, Si Y, Hanson RE, Crane CF, Price HJ, Stelly DM, Wendel JF, Paterson AH (199 8), “Dispersed repetitive . đa da ̣ ng di truyê ̀ n nguô ̀ n gen bông co ̉ (Gossypium arboreum L. ) phục vụ l p ba ̉ n đô ̀ gen kháng bnh xanh l n. 1.1. Mục tiêu của đề tài Thu. TẠO QUẦN THỂ F1 PHỤC VỤ L P BẢN ĐỒ GEN KHÁNG BỆNH XANH L N. T các kt qu nghiên cu v nhc tính nông sinh hc ca các ging bông nghiên c