Đặc điểm phân tử của vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam từ năm 2006 – 2012 Nguyễn Vĩnh Đông Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS. ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn: TS.BS. Nguyễn Thị Kiều Anh Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tổng quan về vi rút dại ở Miền Bắc Việt Nam: Sơ lược lịch sử phát hiện vi rút dại; Virut dại; Dịch tễ học bệnh dại; Nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài; Chẩn đoán phòng thí nghiệm; Các kỹ thuật sinh học phân tử. Xác định và định týp các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 - 2012. Phân tích đặc điểm phân tử Nucleoprotein của các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 - 2012. Trình bày kết quả đạt được: Kết quả về xác định và định týp vi rút, Kết quả phân tích đặc điểm nucleoprotein vi rút dại. Keywords. Vi rút dại; Vi sinh vật học; Đặc điểm phân tử; Miền Bắc Việt Nam Content MỞ ĐẦU Bệnh dại là bệnh viêm não và màng não nguyên phát của động vật có vú, do vi rút dại thuộc họ Rhabdoviridae gây nên. Đây là một căn bệnh cổ xưa nhất của động vật và có thể truyền sang người khi tiếp xúc với vi rút dại qua niêm mạc và da bị tổn thương. Bệnh thường biểu hiện dưới hai thể lâm sàng là thể hung dữ (chiếm 80%) có các triệu chứng điển hình như tăng kích thích, sợ nước, sợ gió, sợ ánh sáng, tăng tiết đờm dãi, co thắt các cơ hô hấp và thể liệt (chiếm 20%). Khi đã lên cơn dại, 100% bệnh nhân tử vong. Ổ chứa vi rút dại rất đa dạng bao gồm các động vật máu nóng hoang dại và động vật gần người như chó, mèo, ngựa, trâu, bò, chồn, cáo, chó sói, dơi Cho đến nay, trên thế giới đã có tới 7 genotype thuộc giống Lyssavirus được ghi nhận là tác nhân gây bệnh dại và viêm não tủy giống bệnh dại. Vi rút dại cổ điển và các chủng vi rút sản xuất vắc-xin được xác định thuộc Lysssavirus genotype 1 [2]. Bệnh dại hiện nay được coi là một trong các bệnh bị lãng quên trên thế giới, nhưng lại tái nổi trội ở một số nước thuộc châu Á, châu Phi [1]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG), hằng năm có khoảng 55.000 ca tử vong do bệnh dại và hơn 10 triệu người bị động vật nghi dại cắn hoặc do tiếp xúc với nguồn truyền bệnh dại phải điều trị dự phòng bằng huyết thanh/vắc xin (VX) dại. Trong những năm gần đây, Việt Nam và một số nước trong khu vực như Phillipin, Lào, Cam Pu Chia và Trung Quốc đang phải đối mặt với vấn đề tăng nhanh các ca bệnh dại. Ở Việt Nam, đã có 560 trường hợp mắc bệnh dại trên người được báo cáo từ năm 2007-2011 và bệnh dại đã và đang diễn ra ở 25 – 27 tỉnh trên cả nước, nhưng tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc [3]. Nguồn lây chính của bệnh dại ở Việt Nam là chó và mèo, chưa thấy có ghi nhận các trường hợp mắc dại do tiếp xúc với các động vật khác. Việc triển khai công tác tiêm phòng vắc xin dại cho đàn chó mèo chưa được tốt, đặc biệt là ở các vùng nông thôn, vùng sâu, vùng xa. Hơn nữa việc kiểm soát xuất/nhập động vật giữa các vùng biên giới, các vùng có dịch bệnh dại ở động vật lưu hành và vùng không có dịch chưa được chặt chẽ, do vậy ổ chứa bệnh dại vẫn chưa thật sự được kiểm soát từ đó là nguồn lây bệnh cho người. Đứng trước tình hình bệnh dại gia tăng và diễn biến phức tạp, ngày 19/1/2009 thủ tướng chính phủ đã chính thức phê duyệt chương trình phòng chống bệnh dại Quốc Gia CV99/TTG – KTN. Để đánh giá hiệu quả của chương trình phòng chống bệnh dại, việc giám sát các ca bệnh dại ở người và động vật là quan trọng cũng như theo dõi đặc điểm phân tử của các chủng vi rút dại lưu hành giúp cho việc khẳng định hiệu quả của việc phòng chống bệnh dại trong từng giai đoạn cụ thể, trên cơ sở này có những đề xuất xác đáng cho việc thực hiện các hoạt động phòng chống bệnh dại hiệu quả ở các giai đoạn tiếp theo. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đặc điểm phân tử của vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006-2012“ với 2 mục tiêu: 1/ Xác định và định týp các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 - 2012. 2/ Phân tích đặc điểm phân tử Nucleoprotein của các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 - 2012. CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Sơ lƣợc lịch sử phát hiện vi rút dại Bệnh dại là bệnh viêm não tuỷ cấp và viêm màng não nguyên phát của động vật có vú. Bệnh có thể truyền sang người qua niêm mạc hoặc da bị tổn thương. Từ hàng nghìn năm trước công nguyên, những người thầy thuốc cổ phương Đông đã viết về căn bệnh tương tự bệnh dại – bệnh sợ nước, sợ gió mà chó và người mắc phải. Bệnh dại cũng được người da đỏ, người Ả rập và người Do Thái cổ đề cập trong y văn với 5 dấu hiệu bệnh dại ở chó: mõm há, chảy nước dãi, tai rủ, đuôi cụp, giọng khàn và khuyến cáo nếu gặp các con vật có biểu hiện này phải tiêu diệt ngay bằng cung tên. Ở Ai Cập, Hy Lạp, La mã người ta coi bệnh dại là sự trừng phạt của thượng đế vì sự bí mật của căn nguyên gây bệnh cũng như sự khủng khiếp của các triệu chứng lâm sàng [10, 16, 47]. Một trăm năm sau công nguyên, Celse đã biết rằng độc tố đã được truyền từ chó sang người và muốn loại bỏ độc tố này cần phải đốt vết thương bằng que sắt nung đỏ [46]. Hai trăm năm sau công nguyên, Galien đã đề ra phương pháp phẫu thuật cắt bỏ phần cơ thể bị vết cắn để ngăn ngừa sự phát bệnh dại [47]. Đầu thế kỷ 19, Zinke đã chứng minh được tính lây nhiễm có trong nước dãi của chó dại. Tại viện Lion, Galtier đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm trên thỏ và thử nghiệm gây miễn dịch cho cừu bằng cách tiêm nước bọt của con vật bị bệnh dại vào tĩnh mạch con vật lành. Năm 1884, Louis Pasteur đã thành công trong việc nghiền não tuỷ của chó mắc bệnh dại sau đó gây nhiễm dưới màng cứng não thỏ. Tiếp tục nghiền não thỏ đã gây nhiễm truyền cho thỏ tiếp theo và cứ tiếp tục như vậy sau hơn 100 lần tiêm truyền liên tiếp trên não thỏ ông đã thu được chủng vi rút có thời gian ủ bệnh thu ngắn và cố định 6 - 7 ngày, ông gọi đó là “vi rút dại cố định” [29, 45, 47]. Pasteur cũng đã phát minh ra phương pháp bất hoạt vi rút dại gây nhiễm não tuỷ thỏ bằng cách làm khô dưới KOH tinh thể. Ông đã dùng não tuỷ thỏ bất hoạt này tiêm cho chó, sau đó dùng vi rút dại sống thử thách cho những con chó này và kết quả thí nghiệm đã giúp Pasteur tìm ra cách sản xuất vắc xin dại. Ngày 6 tháng 7 năm 1885, lần đầu tiên Pasteur đã dùng vắc xin não thỏ bất hoạt tiêm cho cậu bé 9 tuổi Joseph Meister, bị một con chó lên cơn dại cắn nhiều vết. Sau khi được tiêm 13 mũi vắc xin dại của Pasteur, cậu bé đã được cứu thoát khỏi bệnh dại [24]. Trong vòng một năm sau đó có khoảng 2.500 người bệnh đã được điều trị bằng vắc xin này và chỉ có 12 người bị chết [45]. Năm 1963, dưới kính hiển vi điện tử Atanasiu cùng cộng sự đã nghiên cứu cấu trúc, hính thái của vi rút dại trên động vật thí nghiệm và trên nuôi cấy tế bào [6]. Vào những năm 80, ứng dụng tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử và sự phát triển của công nghệ sinh học người ta đã sử dụng kỹ thuật kháng thể đơn dòng để chẩn đoán các chủng vi rút dại gây bệnh ở người và động vật. Bằng kỹ thuật PCR, sequencing người ta đã có thêm nhiều hiểu biết về trật tự sắp xếp các gien và trình tự nucleotide của vi rút dại. Nhờ vào sinh học phân tử đã mang lại nhiều tiến bộ cho việc sản xuất vắc xin dại tái tổ hợp [29]. 1.2. Vi rút dại 1.2.1. Phân loại: 1.3. Dịch tễ học bệnh dại 1.3.1. Tình hình bệnh dại trên thế giới và Việt Nam 1.3.2. Ổ chứa, nguồn truyền bệnh 1.3.3. Các biện pháp phòng chống bệnh dại Ở các nước phát triển biện pháp phòng chống bệnh dại chủ yếu hướng tới các yếu tố truyền bệnh, ổ chứa virus dại ở các động vật máu nóng hoang dại như chồn, cáo, chó sói. Những chiến dịch chủng ngừa bằng mồi có chứa thức ăn trộn lẫn vaccine được rải vào các cánh rừng để gây miễn dịch cho động vật hoang dại, góp phần làm giảm nguy cơ truyền bệnh dại cho người [2]. Ở các nước đang phát triển, biện pháp phòng chống chủ yếu tập trung vào việc tăng cường sản xuất và nâng cao chất lượng vaccine, huyết thanh phòng bệnh dại, đẩy mạnh công tác tuyên truyền và giáo dục nhân dân về việc hạn chế nuôi chó, tiêm chủng thường xuyên cho chó, mèo, cách xử lý khi bị súc vật nghi dại cắn. Tăng cường công tác giám sát dịch tễ học bệnh dại để biết chính xác dịch tễ học bệnh dại và thực hiện tiêm phòng cho các đối tượng có nguy cơ phơi nhiễm. Đối với bệnh dại ở súc vật: thiết lập hệ thống giám sát trung tâm có trang thiết bị phòng thí nghiệm chẩn đoán, có đội ngũ chuyên gia theo dõi. Thành lập chương trình kiểm soát và hạn chế đàn chó lang thang, thực hiện tiêm phòng thường kỳ cho đàn chó. Thực hiện giám sát kiểm dịch Quốc tế khi xuất nhập các súc vật qua biên giới. Tăng cường hợp tác khoa học giữa các nước và khu vực có bệnh dại lưu hành [2]. 1.3.4. Các loại vắc xin tế bào phòng bệnh dại sản xuất trên thế giới  này có độ an toàn và hiệu lực cao, được sản xuất và sử dụng tại Nhật Bản từ 1965.  Vaccine trên tế bào thường trực Vero (Verorab): sử dụng chủng PM thích nghi trên tế bào thường trực vero đời 137, vaccine được bất hoạt, cô đặc và tinh chế sau đó đông khô, vaccine có độ an toàn và tính sinh miễn dịch cao. Được sản xuất tại Pháp từ 1984. 1.4. Nghiên cứu trong nƣớc liên quan đến đề tài Trước đây đã có nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của bệnh dại tại Việt Nam do tác giả Yamagata và cộng sự (2007) [52], đã tiến hành phân lập vi rút dại từ chó tại Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh miền Nam Việt Nam. Kết quả của đề tài là đã so sánh trình tự nucleotide của gien N vi rút dại với một số chủng từ các nước Châu Á khác, và kiến nghị rằng có sự liên hệ chặt chẽ về mặt tiến hóa giữa các chủng tại Miền Nam Việt Nam với các chủng từ Thái Lan và có thể có cùng chung một nguồn gốc. 1.5. Chẩn đoán phòng thí nghiệm Chẩn đoán xác định bệnh dại trong phòng thí nghiệm dựa vào các phương pháp sau: - Xác định kháng nguyên của vi rút bằng kỹ thuật FA hoặc ELISA - Phân lập và xác định vi rút: phân lập trên tế bào hoặc trên chuột. - Xác định vật liệu di truyền của vi rút bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. - Nhận dạng vi rút bằng kháng thể đơn dòng - Các kỹ thuật huyết thanh học; ELISA, RFFIT, FAVN 1.5.1. Chẩn đoán bệnh dại ở người 1.5.1.1. Khi bệnh nhân đang sống  Kỹ thuật phân lập vi rút Mẫu bệnh phẩm là nước bọt, nước tiểu, dịch não tuỷ. Phân lập vi rút trên não chuột ổ nhắt trắng 1 – 2 ngày tuổi, sau tiêm 3 – 4 ngày mổ lấy não chuột và xác định vi rút bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang. Phân lập vi rút trên tế bào NA (C1300) Neuroblastoma của chuột. Khoảng 20 – 24 giờ sau khi gây nhiễm, nhuộm tế bào bằng kháng thể kháng dại gắn huỳnh quang sau đó soi trên kính hiển vi huỳnh quang. Mẫu bệnh phẩm dương tính khi quan sát thấy có hình ảnh phát quang màu xanh trong bào tương của tế bào. Phân lập vi rút dại trên nuôi cấy tế bào cho phép phát hiện được lượng vi rút rất ít trong bệnh phẩm và cho kết quả sau 20 – 24 giờ. Phương pháp phân lập vi rút trên tế bào có độ đặc hiệu cao (99%), độ nhạy 94-97%. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, tốn kém.  Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang Là một kỹ thuật đáng tin cậy, được sử dụng từ năm 1979, cho đến nay đây vẫn là kỹ thuật vàng trong việc chẩn đoán xác định vi rút dại. Mẫu bệnh phẩm là giác mạc bệnh nhân hoặc lấy từ sinh thiết da vùng gáy. Lấy mẫu bệnh phẩm phết lên lam kính, nhuộm huỳnh quang với kháng thể kháng dại, sau đó soi trên kính hiển vi huỳnh quang. Các mẫu dương tính sẽ thấy xuất hiện các tế bào phát quang, các mẫu âm tính sẽ không thấy hiện tượng phát quang. Kỹ thuật này có độ đặc hiệu 99,9% và độ nhạy 99,99%. Cho kết quả nhanh sau 2 – 3 giờ [16].  Các kỹ thuật huyết thanh học Các kỹ thuật huyết thanh học ít được sử dụng để chẩn đoán mà chủ yếu dùng để định lượng nồng độ kháng thể kháng dại có trong huyết thanh của người hoặc động vật sau khi tiêm phòng vắc xin để đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin. Chuẩn độ kháng thể trung hoà có trong huyết thanh của người sau khi tiêm vắc xin bằng thử nghiệm trung hoà huyết thanh trên chuột (MNT) hoặc thử nghiệm ức chế tạo đám miễn dịch huỳnh quang (RFFIT) hoặc FAVN. Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA), sử dụng glycoprotein dại tinh khiết để xác định hiệu giá kháng thể trung hoà có trong huyết thanh người và động vật. Thử nghiệm cho kết quả nhanh nhưng giá thành đắt [16].  Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định ARN của vi rút dại Mẫu bệnh phẩm là nước bọt, nước tiểu, dịch não tuỷ. Phát hiện axit nucleic của vi rút bằng kỹ thuật RT – PCR, nested RT – PCR, real time PCR, từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh chóng. 1.5.1.2. Sau khi bệnh nhân tử vong Não tử thi ở các vùng khác nhau như dưới đồi, nhân não, chất xám, tiểu não. Các kỹ thuật chẩn đoán trên não tử thi cũng tương tự như các kỹ thuật chẩn đoán trên lâm sàng, nhưng có thêm kỹ thuật xác định tiểu thể Nergi ở tế bào thần kinh trong mô não tử thi.  Kỹ thuật xác định tiểu thể Negri Não được phết lên lam kính, nhuộm theo phương pháp Seller hay Mann, soi lên kính hiển vi tìm tiểu thể Negri thường khu trú trong tế bào thần kinh sừng Amon có kích thước khoảng 0,25 – 25 m, bắt màu hồng Eosin. Phương pháp này cho kết quả nhanh, sau khoảng 1 giờ. 1.5.2. Chẩn đoán trên động vật Bệnh phẩm là não động vật nghi dại. Lấy não vùng sừng Amon hai bên, vùng dưới đồi, cuống não, nhân não, chất xám. Các kỹ thuật chẩn đoán áp dụng như trên bệnh phẩm não tử thi. 1.6. Các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán và nghiên cứu vi rút dại 1.6.1. Các phương pháp định týp và nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút Dại Phương pháp miễn dịch: Sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các chủng đại diện của các kiểu gien để định týp các vi rút dại hoang dại phân lập được. Phương pháp đòi hỏi phải phân lập được vi rút và phải có hệ thống huyết thanh chuẩn của từng týp huyết thanh. Phương pháp sinh học phân tử: Phân tích, so sánh trình tự nucleotide của vi rút dại cần xác định kiểu gien so với các chủng đại diện của các kiểu gien. Hầu hết các công trình nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của vi rút dại sử dụng gien N để phân tích kiểu gien và sự tiến hóa của vi rút dại. Tại khu vực Đông Nam Á (Thái Lan, Philipine, Trung Quốc) cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về dịch tễ học phân tử, nghiên cứu sâu về cấu trúc di truyền của các chủng vi rút dại, phân tích sự tiến hóa của chủng vi rút lưu hành [3, 20, 51], các công trình nghiên cứu này cũng sử dụng gien N để phân tích đặc điểm di truyền, tiến hóa của vi rút do gien này có các đặc tính sau: Gien N bao gồm 450 axit amin, tương ứng với 1350 nucleotide, N protein có tính bảo tồn nhất trong các protein của Lyssavirus, trình tự nucleotide của gien mã hóa cho N protein có độ tương đồng cao trong cùng một kiểu gien, nhưng lại rất khác nhau giữa các kiểu gien. Độ tương đồng ở mức độ axit amin của N protein giữa các chủng vi rút trong cùng một kiểu gien đạt tới 98-99,5%, trong khi mức độ tương đồng nucleotide chỉ đạt dưới 80% đối với các vi rút thuộc các kiểu gien khác nhau, [42, 46]. Các công trình nghiên cứu khoa học đó cho thấy khi phân tích trình tự cách quãng 200 nucleotide của gien N sẽ thu được kết quả tương tự như khi phân tích toàn bộ trình tự gien N (Smith và CS, 1992; Kissi và CS, 1995) hoặc một đoạn gien khoảng 200 – 300 nucleotide (Conzelmann và CS, 1990; Bourhy và CS, 1993; Kissi và CS, 1995; Smith và CS, 1992; Nadine – David và CS, 1994; Kissi và CS, 1995; Nishizono và CS, 2002). Chính vì vậy gien N được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh dại bằng các kỹ thuật sinh học phân tử; phân loại kiểu gien (genotyping), xây dựng bản đồ dịch tễ học phân tử và nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút dại so với các vi rút gây bệnh dại thuộc nhóm Lyssavirus [22, 23, 28, 39, 46, 51]. Ngoài ra trong hệ gien của vi rút dại còn có gien mã hóa cho P protein cũng là gien khá bảo tồn trong các gien của vi rút dại, có tới 97% sự tương đồng nucleotide của các chủng vi rút thuộc genotype 1 [46]. Vùng được bảo tồn nhất trong gien P chính là vùng ưa nước, nằm ở vị trí axit amin 139 – 170 [46] được sử dụng để thiết kế mồi cho các kỹ thuật chẩn đoán vi rút dại bằng các phương pháp sinh học phân tử và gien P cũng được sử dụng để nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút dại trong một kiểu gien, nhưng hiệu quả phân loại kiểu gien bằng gien P tỏ ra không hiệu quả bằng gien N và phải giải trình tự toàn bộ gien P thì khả năng phân loại genotype mới chính xác. 1.6.2. Kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 1.6.3. RT - Realtime PCR 1.6.4. RT - LAMP 1.6.5. Kỹ thuật sequencing các vạch này giải được trình tự của đoạn ADN [14]. 1.6.5.1. Giải trình tự bằng máy tự động Các phòng thí nghiệm hiện nay hầu hết giải trình tự gien bằng phương pháp enzyme, sử dụng máy tự động chứ không dùng kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây. Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch ADN đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính yếu, đó là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn ADN. CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu - 102 mẫu bệnh phẩm dịch não tuỷ, nước bọt được lấy từ 63 bệnh nhân nghi dại điều trị tại viện Các Bệnh Truyền Nhiễm và Nhiệt Đới Quốc Gia; khoa truyền nhiễm, bệnh viện Bạch Mai. Các bệnh nhân này tới từ các tỉnh miền Bắc Việt Nam, sau khi được chẩn đoán lâm sàng tại các trung tâm y tế của tỉnh được chuyển lên tuyến trên để điều trị và lấy mẫu. - 150 con chó ở lò mổ của huyện Hoài Đức, Hà Nội (Hà Tây cũ) và các tỉnh lân cận. Chó có một trong các triệu chứng như bỏ ăn, kích thích, chảy nước dãi được mổ sọ lấy não vùng đồi thị và tiểu não. - 6 mẫu não từ chó nghi dại có các triệu chứng như thay đổi hành vi, cắn nhiều người, cắn động vật khác, tìm chỗ tối chỗ vắng nằm trong bóng tối thu thập được từ một số tỉnh miền núi phía Bắc là Lào Cai, Sơn La và Yên Bái. - 4 chủng vi rút dại hoang dại phân lập được từ chó mắc dại tại Việt Nam từ năm 2006 – 2012. - Tất cả các mẫu bệnh phẩm phải được đóng gói theo tiêu chuẩn đóng gói mẫu bệnh phẩm loại A, đảm bảo 3 lớp và bảo quản trong lạnh khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Chủng vi rút Chủng chuẩn vi rút dại CVS: Phòng thí nghiệm Vắc xin và sinh phẩm thực nghiệm, Viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp. Chủng vi rút này được nhân trên tế bào (để làm chứng dương cho kỹ thuật tách chiết ARN từ dịch) và cấy truyền trên chuột (để làm chứng dương cho kỹ thuật tách chiết ARN từ mô) trong chẩn đoán dại bằng kỹ thuật RT – PCR. 2.2.2. Trình tự gien Trình tự nucleotide của gien N của các chủng vi rút được tham khảo tại ngân hàng gien thế giới (GenBank) tại địa chỉ website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ với các mã gien đăng ký và tên chủng như sau: - 7 chủng đại diện cho 7 genotype thuộc Lysavirus: X03673 - PV; D42112 - CVS; U22848 - Duvenhage virus; EU822500 - European bat Lyssavirus 1 ; EU293114 - European bat Lyssavirus 2; AY573964 - Australian bat Lyssavirus; U22842 - Lagos bat virus; MVU22843 - Mokola virus; - 8 chủng vi rút ở Miền Nam và Tây nguyên Việt Nam: AB614375; AB614376; AB628213; AB614373; AB614374; AB628211; AB614377; AB614378. - Một số chủng vi rút dại lưu hành trên thế giới như Pháp, Nga, Ba Lan, Nam Phi, Mexico, Brazil…: U22477, ME9126; U22627, EGY8692; U22637, ETH8807; U22641, GUI9024; U22633, AFS8721; U22656, RUS9141; U22474, FRA9147; U22840, POL8618; U22479, BRAZIL. - Một số chủng vi rút dại lưu hành ở khu vực lân cận như Trung Quốc, Malaysia, Philippines, Nepal: U22918, 94260NEP; U22653, 8738THA; U22916, 8677MAL; AB070817PHI; EF555106, SDJNCN01; EF555102, CQQJDN06; EF555112, GDZQDN45; EF555098, CQQJDN02; EF555099, CQQJDN03; EF555100, CQQJDN04; EF555101, CQQJDN05; AB299032, AB299033, AB299034, AB299035, AB299036, AB299037, AB299038, AB299039 VN. 2.2.3. Sinh phẩm, hóa chất  Các sinh phẩm, hóa chất và vật liệu cần thiết khác để thực hiện kỹ thuật RT – PCR và sequencing. 2.2.4. Trang thiết bị, dụng cụ 2.2.5. Xác định và định týp vi rút 2.2.5.1. Xác định vi rút bằng kỹ thuật RT-PCR 2.2.5.2. Xác định týp vi rút  là 50cm. Thì mỗi lần chạy đọc được 4 giếng theo chiều dọc của đĩa từ A đến H và mất 2 giờ 30 phút cho mỗi lần chạy.  Trình tự nucleotide được phân tích theo các thông số của phần mềm đi kèm theo máy giải trình tự (chất lượng đọc các nucleotide, phát hiện SNP là trạng thái đa dạng kiểu nucleotide tại một vị trí trên gien ) b/ Xác định týp vi rút dại Sử dụng các phần mềm tin-sinh học trong nghiên cứu, bao gồm các chương trình Chromas, BioEdit, Lasergene, và MEGA4.0, để thu nhận, xử lý, phân tích các chuỗi nucleotide, axit amin và các đặc điểm sinh học phân tử gien N của vi rút dại và xây dựng mối quan hệ phả hệ định týp các chủng vi rút dại phân lập tại Việt Nam. Các chủng vi rút dại thuộc đại diện cho các genotype khác nhau như chủng PV (Pasteur Virus) và CVS (chủng vi rút thử thách) thuộc genotype 1, chủng vi rút dơi Lagos thuộc genotype 2, chủng vi rút Mokola thuộc genotype 3, chủng vi rút Duvenhage thuộc genotype 4, chủng vi rút European bat lyssavirus 1 thuộc genotype 5, chủng vi rút European bat lyssavirus 2 thuộc genotype 6 và chủng vi rút Australian bat lyssavirus thuộc genotype 7 được sử dụng làm đại diện để xác định týp của các chủng vi rút dại phân lập tại Việt Nam. CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả xác định và định týp vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006 - 2012 3.1.1. Kết quả xác định vi rút dại lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006-2012 3.1.1.1. Kết quả chẩn đoán xác định bệnh dại trên ngƣời a. Kết quả thu thập và chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm lâm sàng của bệnh nhân nghi dại Trong tổng số 63 bệnh nhân nghi dại điều trị tại viện Các bệnh truyền nhiễm và nhiệt đới Quốc gia và bệnh viện Bạch Mai thu thập được 102 mẫu bệnh phẩm. Trong đó có 14 bệnh nhân chỉ thu thập được dịch não tủy (DNT), 8 bệnh nhân lấy được nước bọt (NB) và 41 bệnh nhân có đầy đủ cả dịch não tủy và nước bọt. Kiểm tra sự có mặt ARN của vi rút dại trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật RT – PCR đã khẳng định 29/63 bệnh nhân bị nhiễm vi rút dại, tỷ lệ dương tính với vi rút dại là 46,03%. 3.1.1.2 Kết quả chẩn đoán xác định bệnh dại ở động vật 3.1.1.3 Sự phân bố các chủng vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc Việt Nam theo địa dƣ Bảng 3.3 cho thấy bệnh dại lưu hành ở nhiều vùng địa lý khác nhau, tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền núi, trung du. Đặc biệt tỷ lệ bệnh nhân mắc dại ở Hà Tây và Phú Thọ cao hơn các tỉnh khác thuộc khu vực miền Bắc, đây là hai tỉnh nổi trội về tình hình bệnh dại trên người trong những năm gần đây ở các tỉnh miền Bắc Bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy 31 chủng vi rút dại xác định được trên người (23 chủng) và chó (8 chủng) tại miền Bắc, chủ yếu tập trung ở các tỉnh Hà Nội, Phú Thọ, Hòa Bình, Yên Bái, Sơn La, Lào Cai, Tuyên Quang. Kết quả chẩn đoán phòng thí nghiệm vi rút dại trên người và động vật cho thấy vi rút lưu hành tại 9 tỉnh miền Bắc: Hà Nội, Tuyên Quang, Hòa Bình, Phú Thọ, Sơn La, Thái Bình, Lạng Sơn, Yên Bái, Lào Cai phù hợp với số liệu báo cáo thống kê của chương trình phòng chống bệnh dại Quốc Gia, Bộ Y tế, 2006 – 2011. Đây chính là 10-11 tỉnh trọng điểm có bệnh nhân tử vong vì bệnh dại cao nhất trên toàn quốc (Nguyễn Thị Thanh Hương, 2012). Việc khẳng định phòng thí nghiệm là có sự lưu hành vi rút dại ở chó cho thấy nguồn truyền bệnh dại chủ yếu cho người chính là đàn chó bị nhiễm dại tại địa phương. Do tập quán thích nuôi chó, nuôi chó thả rông và tỷ lệ tiêm phòng cho chó ở khu vực nông thôn phía Bắc chỉ đạt 15 – 30%, thậm chí ở những vùng sâu, vùng xa không tổ chức tiêm phòng cho đàn chó mèo [1,3]. Đây chính là nguyên nhân chính gây ra bùng phát dịch tại địa phương và lan rộng ra vùng xung quanh. Do vậy, cần phải có chiến lược kiểm soát bệnh dại ở động vật như tiêu hủy đàn chó nhiễm bệnh, tổ chức chiến dịch tiêm phòng cho chó để đạt được tỷ lệ tiêm phòng vắc xin > 80% và giám sát phòng thí nghiệm vi rút dại ở động vật nhằm phát hiện sớm các ổ dịch để có biện pháp can thiệp kịp thời cũng như đánh giá hiệu quả các biện pháp phòng chống dại ở động vật. 3.1.2. Kết quả định týp các chủng vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc, Việt Nam 2006 – 2012 3.1.2.1. Kết quả định týp các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012. Trình tự nucleotide gien N của 47 chủng vi rút dại được đưa vào phân tích, trong đó có:  31 chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc, 2006 – 2012 (kết quả từ đề tài nghiên cứu);  8 chủng vi rút dại lưu hành ở miền Nam, Tây Nguyên, 2006 – 2009 (tham khảo tại ngân hàng gien);  8 chủng vi rút dại đại diện cho 7 genotype của Lyssavirus và chủng vi rút sản xuất vắc xin. Hiện nay, để xác định được genotype của vi rút dại có hai phương pháp phổ biến là phương pháp huyết thanh học và phương pháp sinh học phân tử. Phương pháp huyết thanh học cần sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các kiểu gien để định týp các vi rút dại hoang dại phân lập được. Phương pháp này đòi hỏi phải phân lập được vi rút, mà việc phân lập vi rút trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng của người trong giai đoạn bệnh nhân vẫn còn sống (dịch não tủy, nước bọt) là vô cùng khó khăn và phải có hệ thống huyết thanh chuẩn của từng týp huyết thanh. Do đó mất nhiều thời gian và kém hiệu quả so với kỹ thuật sinh học phân tử. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gien (sequencing) N, so sánh trình tự gien N của các chủng vi rút dại lưu hành ở Việt Nam với các chủng vi rút đại diện cho 7 genotype của lyssavirus để xác định kiểu gien của vi rút dại hoang dại lưu hành ở Việt Nam. Kỹ thuật sequencing cho phép xác định kiểu gien nhanh, có độ chính xác cao, tránh được những nhầm lẫn giữa các kiểu gien khác nhau [22, 23, 27, 39]. 3.1.2.2. Mối liên hệ của các chủng vi rút dại lưu hành ở Việt Nam và một số nước lân cận Bản đồ lưu hành các nhóm vi rút dại ở miền Bắc Việt Nam (hình 3.6) cho thấy sự có sự lưu hành của vi rút thuộc nhóm 1 ở 5 tỉnh/thành phố thuộc miền Bắc. Có tới 4 tỉnh đồng thời có sự lưu hành của vi rút thuộc nhóm 1 và nhóm 2 là các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Phú Thọ và Hà Nội. So sánh bản đồ lưu hành vi rút dại tại miền Bắc 2006 – 2012 (Hình 3.6) và bản đồ sự lưu hành vi rút dại 2006 – 2009 (hình 3.7) cho thấy có sự mở rộng địa lý lưu hành vi rút sang các tỉnh Thái Bình, Lào Cai so với giai đoạn 2006 – 2009 (Nguyễn Thị Kiều Anh và CS) và đồng thời giai đoạn 2010 – 2012 thấy có sự xâm nhập vi rút nhóm 1 vào các tỉnh Sơn La, Phú Thọ. Đây có thể là do có sự xâm nhập vi rút dại giữa các vùng lân cận, phải chăng là do sự di chuyển của đàn chó dại sang các vùng xung quanh một cách tự nhiên hoặc thông qua việc vận chuyển chó trong thời kỳ ủ bệnh từ vùng này sang vùng khác làm lây lan bệnh dại. Do vậy, cần phải có biện pháp phòng chống hữu hiệu như tiêu hủy toàn bộ đàn chó mắc bệnh và có nguy cơ mắc bệnh tại vùng công bố dịch, tiêm phòng vắc xin cho đàn chó ở các khu vực lân cận, nghiêm cấm vận chuyển chó bị bệnh, chó chưa được tiêm phòng từ vùng này sang vùng khác 3.2. Kết quả phân tích đặc điểm phân tử nucleoprotein của các chủng vi rút dại lƣu hành tại Việt Nam, 2006-2012. 3.2.1. Đặc điểm chung về phân tử nucleoprotein của vi rút dại Protein N của vi rút dại (chủng PV) gồm có 450 axit amin (một số vi rút có 451 axit amin), một trong số chúng được phosphoryl hóa, và có trọng lượng phân tử khoảng 57 kDa. Trình tự axit amin của protein N là bảo tồn nhất trong số các protein của vi rút dại ở cả 7 genotype. Do đặc tính tự nhiên được bảo tồn của gien N, nên có một mức độ đa dạng di truyền tương đối cao trong các đoạn ngắn của gien N giữa các genotype (Conzelmann và cộng sự., 1990; Bourhy và cộng sự., 1993, 1999; Kissi và cộng sự., 1995; Kuzmin và cộng sự., 2005). Một nguyên nhân quan trọng về mức độ bảo tồn cao của trình tự axit amin, đặc biệt ở những vùng đặc hiệu của gien N, có thể là do chúng giữ các chức năng quan trọng. Mặt khác, những khác biệt về axit amin có thể là do các epitope chuyên biệt genotype trên gien N có khả năng phân loại các vi rút thành các genotype khác nhau dựa trên cơ sở các kiểu hoạt tính của chúng (đặc tính kháng nguyên) nhờ một bộ mẫu chuẩn các kháng thể đơn dòng kháng N (Mabs) (Flamand và cộng sự., 1980a; Dietzschold và cộng sự., 1987a; Smith, 1989). Sự đa dạng về chất lượng trong gien N cũng được khai thác ở mức độ nucleotide bằng kỹ thuật PCR (Sacramento và cộng sự, 1991; Bourhy và cộng sự, 1993; Kuzmin và cộng sự, 2003). Vị trí gắn trên gien N để giúp chúng có khả năng tương tác với ARN của vi rút được đặt trên một vùng gien N từ axit amin 298 đến 352 (Kouznetzoff và cộng sự, I998). Sau khi gắn vào ARN của vi rút, gien N thực hiện việc thay đổi cấu tạo thì cần một số epitop, mà một trong số chúng cho phép axit amin serine (S) tồn dư ở vị trí 389 trên gien N được phosphoryl hóa (Dietzschold và cộng sự, 1987a; Anzai và cộng sự., 1997; Kawai và cộng sự., 1999; Toriumi và Kawai, 2004). Trong quá trình sao chép ARN ở tế bào nhiễm bệnh, có ý kiến cho rằng việc tạo vỏ capsid của ARN vi rút mới là do gien N tạo ra một hình dáng giống vỏ capsid làm thay đổi gien N từ đó tạo ra tồn dư S389 cần thiết cho quá trình phosphoryl hóa (Kawai và cộng sự., 1999). Sau đó quá trình phosphoryl hóa gien N củng cố mối tương tác giữa gien N và P trong phức hợp RNP của vi rút dại (Toriumi và Kawai, 2004). Từ đó suy luận rằng quá trình phosphoryl hóa của gien N sau khi tạo vỏ capsid ARN là rất quan trọng trong việc điều chỉnh việc sao chép và dịch mã ARN của vi rút (Yang và cộng sự., 1999; Wu và cộng sự., 2002; Liu và cộng sự., 2004). Mức độ đồng nhất nucleotide khi phân tích trình tự nucleotide của gien N gồm 500 nucleotide – Nu của các chủng vi rút dại lưu hành tại miền Bắc, Việt Nam, 2006 – 2012 với các chủng vi rút dại lưu hành tại miền Nam 2006 – 2009 và một số nước lân cận cho thấy có độ đồng nhất cao và cao nhất với nhóm chủng phân lập ở miền Nam, Việt Nam (87,7% - 99,2%) , tiếp đó tới nhóm chủng phân lập ở Philippines (87,5% - 100%), Trung Quốc – Guangxi (82,2% - 92,8%) và thấp nhất là các chủng phân lập tại Tây Á (81,8% – 88,6%). Độ đồng nhất nucleotide ở đoạn gien N phân tích của các chủng vi rút phân lập ở Việt Nam so với các chủng vi rút sản xuất vắc xin dại dại Fuenzalida (chủng PV); Verorab (chủng PM) và chủng Vnukovo – 32 là 84,5% - 96,9%. năm 2008; 1 chủng trên người vào năm 2012; 3 chủng phân lập trên chó tại Yên Bái vào năm 2012 và chủng hoang dại có nguồn gốc từ một con bò dại ở Trung Quốc đăng ký trên ngân hàng gien năm 2007. Điều đó có thể do sự xâm nhập vi rút vào các tỉnh biên giới Việt Nam từ các tỉnh miền Nam Trung Quốc, nơi đang là điểm nóng của bệnh dại tại Trung Quốc trong những năm gần đây [51] hoặc ngược lại thông qua sự di chuyển tự nhiên của các con vật bị dại hoặc thông qua việc buôn bán động vật nhiễm dại qua con đường tiểu ngạch mà không được kiểm soát. Sự xuất hiện aa đặc trưng ở vị trí D110 ở hầu hết các chủng vi rút phân lập được trên người và chó tại các tỉnh Hà Nội, Tuyên Quang, Thái Bình, Hòa Bình, Phú Thọ và một số chủng vi rút ở Trung Quốc cho thấy chắc chắn có sự nhiễm chéo vi rút ở các vùng biên giới giữa hai nước, từ đó vi rút phát tán sang các vùng lân cận. Điều đó giúp cho xây dựng chiến lược phòng chống bệnh dại phải bao gồm việc kiểm soát sự xuất nhập khẩu động vật qua biên giới và truyền thông người dân không buôn bán động vật qua con đường tiểu nghạch mà không được kiểm soát bệnh dại. Các aa đặc trưng tìm được sẽ giúp chúng ta theo dõi đặc điểm vi rút học cũng như sự lưu hành của các chủng vi rút hoang dại trên quần thể ổ chứa, vector và người để có những biện pháp can thiệp hữu hiệu nhằm giảm thiểu sự phát tán vi rút từ ổ chứa, vector và lây truyền sang người. Đồng thời việc giám sát dịch tễ học phân tử vi rút dại thường xuyên là cần thiết để đưa ra chiến lược đúng đắn cho phòng chống bệnh dại, đặc biệt là kiểm soát bệnh dại ở những vùng biên giới, đồng thời đánh giá kết quả khống chế, phòng chống bệnh dại ở động vật và người trong từng quốc gia cũng như trong khu vực. Qua phân tích đặc điểm nucleotide và axit amin của các chủng vi rút dại lưu hành tại miền Bắc Việt Nam chưa phát hiện được sự thay đổi các aa hoặc SNP liên quan đến chức năng độc lực, sinh miễn dịch của gien N đã được công bố trong các nghiên cứu trước đây [22, 23, 27, 39]. KẾT LUẬN 1. Xác định và định týp vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012.  Các chủng vi rút dại lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006 - 2012 đều thuộc genotype 1 của Lysavirus và được chia làm 2 nhóm.  Cả hai nhóm vi rút dại đều có các nhánh được tạo thành từ các chủng vi rút phân lập ở miền Bắc Việt Nam và một số chủng vi rút dại lưu hành tại Trung Quốc. 2. Đặc điểm nucleoprotein của vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012.  Mức độ tương đồng axit amin và nucleotide của các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam năm 2006 - 2012 so với các chủng sản xuất vắc xin (PM, PV và Vnukovo) là 92,2 – 97,1% và 84,5 – 96,9%.  Xuất hiện các chủng vi rút mang đa hình đơn nucleotide đặc trưng ở vị trí T124 và C330 trên trình tự nucleotide của gien N của vi rút dại lưu hành tại miền Bắc Việt Nam và một số chủng lưu hành ở Trung Quốc.  Các đa hình đơn nucleotide xuất hiện tạo nên các axít amin đặc trưng tại vị trí S42 (Serin 42) và D110 (Aspartic 110) trên gien N của vi rút dại lưu hành tại miền Bắc Việt Nam và một số chủng lưu hành ở Trung Quốc . KIẾN NGHỊ 1. Cần phải tăng cường giám sát phòng thí nghiệm vi rút dại và nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi rút để hiểu rõ về nguồn gốc các vụ dịch bùng phát, góp phần xây dựng chiến lược phòng chống bệnh dại hiệu quả trong tương lai. 2. Cần thực hiện các biện pháp truyền thông cho những đối tượng có nguy cơ như người làm nghề giết mổ chó, mèo, nhân viên thú y cần phải tiêm phòng vắc xin dại trước phơi nhiễm. 3. Thúc đẩy việc thực thi nghị định 05 của Chính Phủ về kiểm soát bệnh dại ở động vật như nuôi chó phải đăng ký và tiêm phòng cho chó; không giết mổ động vật nghi dại; thực hiện đúng nguyên tắc xuất, nhập khẩu động vật; tiêu hủy động vật bị dại và xử lý ổ dịch đúng quy định. [...]... học, Vi n Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội 3 Nguyễn Thị Kiều Anh, Nguyễn Vĩnh Đông, Nguyễn Tuyết Thu, Ngô Châu Giang, Satoshi Inoue, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2011), " Đặc điểm phân tử nucleoprotein của một số chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Vi t Nam, 2010 - 2011", Tạp chí nghiên cứu Y học tập 85, số 5-6/2011, tr.40 – 45, 4 Lê Huy Chính và cộng sự (2003), Vi Sinh Y học” Đại học y Hà Nội, tr: 264 –. .. 81-87 15 Tạ Thành Văn (2009), "Nguyên lý ứng dụng của PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử" : tr tr:10-12 16 Vi n Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương (2010), "Virus y học": tr tr.139-156 17 Đinh Kim Xuyến, Trần Văn Tiến (1996), “Một số nhận xét về tình hình bệnh dại ở Vi t Nam trong 5 năm 1991 – 1995” Tạp chí Vệ Sinh Phòng Dịch, IV, tr 19 – 20 18 Đinh Kim Xuyến (2001), “Bệnh dại ở Vi t Nam Tập san của Hội nghị...References Tiếng Vi t 1 Nguyễn Thị Kiều Anh, Nguyễn Vĩnh Đông, Ngô Châu Giang, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Phạm Hồng Nhung (2009), "Đặc điểm genotype của các chủng virus dại lưu hành ở một số tỉnh miền Bắc Vi t Nam trong năm 2007 – 2008”, Tạp chí nghiên cứu Y học tập 60, số 1- 2/2009, tr.25 – 30, 2 Nguyễn Thị Kiều Anh (2010), "Thích nghi chủng vaccine dại Vnukovo-32 trên tế bào Vero và... bệnh dại ở châu á” lần IV, HN 3/ 2001, tr:19 – 20 19 Đinh Kim Xuyến (2007), "Tình hình bệnh dại ở Vi t Nam từ 1994 – 2007" Tiếng Anh 20 Anh K.T Nguyen, Dong V Nguyen, Giang C Ngo, Thu T Nguyen, Satoshi Inoue, Akio Yamada, Xuyen D Kim, Dung V Nguyen, Thao X Phan, Bao Q Pham, Hien T Nguyen, and Hanh T H Nguyen (2011), "Molecular of rabies virus in Vietnam, 2006 – 2009", Jpn, J Infect Dis., 64, pp 391 –. .. nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SAD B19", Virology 175(2), pp 485-99 Dietzschold B., Koprowski H et al (1996), “Rhabdoviruses”, Fields Virology, 3rd Edition, 38, pp 1145-1151 Dinh Kim Xuyen & Et Al (2004), "Rabies situation in Viet Nam" , Proceedings of the 2nd Vietnam – Laos – Cambodia symposium, July 2004, Hanoi, Vietnam Dong-Kun Yang, Young -Nam Park, Gyeong-Soo Hong, Hee-Kyung Kang,Yoon-I... 9 Nguyễn Thị Hạnh (1975), "Hỏi và đáp về bệnh dại" , NXB Y học: tr tr: 5-11 10 Hoàng Minh Hiền (2001), "Nghiên cứu vắc xin mẫu chuẩn quốc gia phòng bệnh dại" , Luận án Tiến sĩ Y học 11 Nghị định số 05/ 2007/ NĐ - CP (1/2007), “Chương III: Chống dịch bệnh dại ở động vật”, tr: 3 – 4 12 Lê Duy Thành và CS (2008), “Cơ sở sinh học phân tử NXB Giáo Dục, tr: 134 – 153 13 Phạm Hùng Vân (2009), "PCR và realtime... “Bệnh dại, biện pháp phòng chống” Bộ y Tế, tr: 1 – 10 6 Ngô Châu Giang (2011), " Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật RT -LAMP trong chẩn đoán vi rút dại ", Luận văn thạc sỹ Y học, Đại học Y, Hà Nội 7 Vũ Thị Hà (2009), "Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán bệnh dại" , Khóa luận tốt nghiệp cử nhân y khoa: tr 21-23 8 Thái Hà, “Chết vì bệnh dại từ chó mèo gia tăng” Báo Sức Khoẻ Đời Sống, số ra 14/ 8/ 2006. .. in Vietnam”, The second international rabies in Asia conference (RIACON) proceeding, Hanoi, Vietnam Sep 2009 Jackson (2002), "Human Disease", Rabies: tr 219 - 244 James E Childs (2002), "Rabies: Routes of rabies virus transmission to humans", Academic press, pp 125 – 126 Kissi, B., Tordo, N and Bourhy, H (1995), "Genetic polymorphism in the rabies virus nucleoprotein gen", Virology, 209, pp 526 – 537... control and prevention in Vietnam”, ASEAN + 3 conference on sharing information on rabies and prevention, Halong, Vietnam Apr 2007 Mcevoy Gerald K (2005), "Rabies Vaccine", AHFS Drug Information: tr 3303 3310 National Institute of Hygiene Epidemiology (2012) , "Rabies conference for 10 main point rabies provinces", held in ThaiNguyen, June, 2012 N Mori, Y Motegi, Y Shimamura, T Ezaki, (2006) , "Development... epidemiology of rabies in Guangxi Province, south of China", Journal of Clinical Virology, 39, pp 29 5–3 03 Tordo N (1996), "Characteristic and molecular biology of the rabies virus", Laboratory Techniques in rabies, 4th edition: pp 28 – 50 Selimov M A (1982), "Rabies", Moscow Medistina: tr 182 - 185 Wagner RR., (1990), “Rhabdoviridae and their replication”, Field BN, Knipe DM,eds.Virology NewYork, Raven Press, . phân tử của vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Vi t Nam, 2006- 2012 với 2 mục tiêu: 1/ Xác định và định týp các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Vi t Nam, . chủng vi rút dại lƣu hành tại miền Bắc, Vi t Nam 2006 – 2012 3.1.2.1. Kết quả định týp các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Vi t Nam, 2006 – 2012.