Báo cáo tốt nghiệp MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG SỐ LƯỢNG NỖN VÀ NI NỖN CHÍN TRÊN CHĨ GVHD: PGS TS TRẦN THỊ DÂN KS NGUYỄN VĂN ÚT SVTH : NGUYỄN BẢO KHÁNH Ngành : THÚ Y Khoá : 2002-2007 09/2007 Nội dun g ĐẶT VẤN ĐỀ NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ & THẢO LUẬN KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ Phần I   ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày phát triển, mức sống nhân dân tăng dần đời sống tinh thần trọng Mỗi người có nhu cầu giải trí, bầu bạn, tâm hết cần bảo vệ tính mạng tài sản Ở chó lồi vật ưa chuộng hàng đầu tính trung thành, thơng minh, lòng can đảm Mặt khác, đời sống người dân ngày cao nên mức độ thẩm mỹ sâu sắc Chó u thích nhà phải chó đẹp, giống quý, lạ mắt, mà phần lớn chó chó nhập từ nước ngồi với giá thành cao, thủ tục phức tạp    Đáp ứng nhu cầu trên, việc tạo chó từ phơi sản xuất in vitro khuyến khích với ưu điểm : Tham gia vào trình chọn lọc, nhân giống, lai tạo để đạt tính trạng mong muốn Tối ưu hóa khả sinh sản chó bố mẹ Sản xuất số lượng lớn phôi thời gian ngắn, giá thành hạ Tiền đề cho cơng nghệ sinh sản vơ tính tương lai Vì đề tài “Một số yếu tố ảnh hưởng số lượng nỗn ni nỗn chín chó” thực hiện, nhằm chuẩn bị bước đầu cho việc sản xuất phơi chó in vitro Mục tiêu: Cải thiện quy trình ni nỗn phịng thí nghiệm khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng noãn thu nhận phát triển in vitro noãn Phần I I NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NỘI DUNG KHẢO SÁT VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM  Thời gian Từ 05/03/2007 đến 20/07/2007  Địa điểm thực Phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hố, phịng Ni Cấy Tế Bào, khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM 2.2 NỘI DUNG KHẢO SÁT    Xác định mơi truờng ni nỗn chín So sánh số lượng nỗn thu tỉ lệ nỗn chín sau IVM dựa theo thời điểm thu hoạch buồng trứng, tuổi chó kích thước buồng trứng Đánh giá ảnh hưởng việc bổ sung βmercaptoethanol vào môi truờng nuôi in vitro đến tỉ lệ nỗn chín 2.3 VẬT LIỆU 2.3.1 Nguồn mẫu Buồng trứng chó từ chó lị mổ anh Phước, quận Thủ Đức, Tp Hồ Chí Minh 2.3.2 Thuật ngữ  IVM (in vitro maturation): trưởng thành ống nghiệm  GV (germinal vesicle): giai đoạn túi mầm  GVBD (germinal vesicle breakdown): giai đoạn vỡ túi mầm  MI (metaphase I): trung kỳ I  MII (metaphase II): trung kỳ II 2.3 VẬT LIỆU (t.t) 2.3.3 Các giai đoạn phát triển noãn GV MI GVBD MII (nỗn chín) 2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH 2.4.1 Bố trí khảo sát Khảo sát 1: Ảnh hưởng thời điểm thu hoạch buồng trứng lên số lượng noãn thu tỉ lệ nỗn chín sau IVM   Mục tiêu So sánh số lượng noãn thu tỉ lệ nỗn chín sau IVM thời điểm lấy mẫu khác  Cách thực Chia thời điểm thu hoạch buồng trứng theo giai đoạn khảo sát từ 05/03/2007 đến 28/03/2007 (lơ 1, có 20 chó), từ 01/04/2007 đến 27/04/2007 (lơ 2, có 26 chó), từ 02/05/2007 đến 31/05/2007 (lơ 3, có 17 chó) từ 01/06/2007 đến 16/06/2007 (lơ 4, 13 chó)  Chỉ tiêu quan sát Số lượng noãn thu tỉ lệ nỗn chín sau IVM với mơi trường NCSU 37 2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t) 2.4.2 Cách tiến hành (t.t)  Thu nhận noãn sau ni Chuyển nỗn sau ni vào đĩa chứa PBS – PVA Thêm 200 µl hyaluronidase 0,1% vào, để 15 phút Dùng pipette Pasteur làm bong lớp tế bào hạt tụ xung quanh noãn cách hút nhẹ nhàng noãn vào pipette Đánh giá phân loại noãn Chuyển qua phiến kính, nhuộm NST 2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t) 2.4.2 Cách tiến hành (t.t)  Đánh giá phân loại noãn  Noãn phân loại, đánh giá sau ni 72  Nỗn phân thành loại: nỗn xấu, nỗn tốt nỗn chín Nỗn xấu Nỗn tốt Nỗn chín - Gồm nỗn thối hố - Tế bào chất khơng đồng nhất, bị co cụm hay phân tán - Không xuất thể cực thứ - Là nỗn chưa chín - Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào - Không xuất thể cực thứ - Là noãn trưởng thành - Tế bào chất đồng   - Có xuất thể cực thứ 2.4 PHƯƠNG PHÁP TiẾN HÀNH (t.t) 2.4.2 Cách tiến hành (t.t)  Nhuộm noãn Chuyển noãn qua giọt PBS – PVA mới, rửa 15 phút, chuyển lên phiến kính Cố định hỗn hợp acetic acid: ethanol Trét silicon lên góc lamelle, đậy kính Ngâm hỗn hợp acetic acid: ethanol (1: v/v) 48 Rửa lại ethanol 100% Nhuộm dung dịch 1% aceto-orcein 15 phút Rửa dung dịch acetoglycerol đến màu, xem KHV x100 Phần I II KẾT QUẢ & THẢO LUẬN KHẢO SÁT KHẢO SÁT KHẢO SÁT THÍ NGHIỆM 3.1 KHẢO SÁT 1: Ảnh hưởng thời điểm thu hoạch buồng trứng lên số lượng noãn thu tỉ lệ nỗn chín sau IVM Bảng 3.1.1 Số lượng noãn thu tỉ lệ noãn phát triển tốt thời điểm Thời điểm thu hoạch Chỉ tiêu Tháng (1) Tháng (2) Tháng (3) Tháng (4) Số chó 20 26 17 13 Số nỗn thu / chó 22,8 ± 4,04a 27,19 ± 2,65b 40,06 ± 6,18b 37,38 ± 5,83b 0,025 Tỉ lệ noãn phát triển tốt (%) 20,8 ± 3,7 26,12 ± 3,32 22,27 ± 3,63 31,34 ± 7,68 0,324 P Bảng 3.1.2 Tỉ lệ noãn giai đoạn phát triển theo thời điểm năm Thời điểm thu hoạch Giai đoạn phát triển nỗn ni Tháng (1) Tháng (2) Tháng (3) Tháng (4) P GV (%) 37,07 ± 7,37 39,42 ± 4,33 42,89 ± 7,58 52 ± 8,79 0,433 GVBD (%) 6,41 ± 2,31 8,46 ± 2,45 7,32 ± 2,47 5,24 ± 1,95 0,817 MI (%) 4,49 ± 1,48 3,54 ± 1,4 5,95 ± 2,25 5,61 ± 2,31 0,746 MII (%) 1,2 ± 0,66 2,64 ± 1,17 3,06 ± 1,2 3,8 ± 2,23 0,58 Biểu đồ 3.1 Số lượng noãn thu tỉ lệ noãn phát triển thời điểm thu hoạch 3.2 KHẢO SÁT 2: Ảnh hưởng tuổi chó đến số lượng nỗn thu tỉ lệ nỗn chín sau IVM Bảng 3.2.1 Số lượng noãn thu tỉ lệ noãn phát triển tốt độ tuổi Tháng tuổi chó Chỉ tiêu – 12 (1) > 12 – 18 (2) > 18 – 24 (3) > 24 (4) Số chó 12 14 11 Số nỗn thu / chó 28,33 ± 3,85 40,36 ± 4,34 31,64 ± 4,07 38,25 ± 7,98 0,244 Tỉ lệ noãn phát triển tốt (%) 23,51 ± 3,4 29,42 ± 5,89 25,4 ± 5,78 22,5 ± 7,19 0,778 P Bảng 3.2.2 Tỉ lệ noãn giai đoạn phát triển theo tuổi chó Thời điểm thu hoạch Giai đoạn phát triển nỗn ni – 12 (1) > 12 – 18 (2) > 18 – 24 (3) > 24 (4) P GV (%) 54,13 ± 8,02 39,25 ± 5,31 47,5 ± 8,69 47,3 ± 12,6 0,48 GVBD (%) 5,16 ± 2,82 7,99 ± 3,04 6,21 ± 2,22 1,92 ± 1,92 0,522 MI (%) 4,52 ± 2,4 6,6 ± 2,45 3,56 ± 1,89 4,09 ± 3,14 0,804 MII (%) 1,67 ± 1,67 5,15 ± 1,79 2,42 ± 1,69 4,09 ± 3,14 0,559 Biểu đồ 3.2 Số lượng noãn thu tỉ lệ noãn phát triển độ tuổi 3.3 KHẢO SÁT 3: Ảnh hưởng kích thước buồng trứng lên số lượng nỗn thu tỉ lệ chín noãn Bảng 3.3.1 Số lượng noãn thu tỉ lệ nỗn phát triển tốt kích thước Kích thước buồng trứng (mm3) Chỉ tiêu ≤ 500 (1) > 500 – 1000 (2) > 1000 – 1500 (3) > 1500 (4) Số chó 11 24 Số nỗn thu / chó 24,09 ± 4,11a 43,71 ± 4,86b 32,13 ± 3,67b 24,33 ± 4,7b 0,036 Tỉ lệ noãn phát triển tốt (%) 18,88 ± 4,68a 32,19 ± 3,94a 20,1 ± 4,53a ± 5b 0,036 P Bảng 3.3.2 Tỉ lệ noãn giai đoạn phát triển theo tuổi chó Kích thước buồng trứng (mm3) Giai đoạn phát triển nỗn ni ≤ 500 (1) > 500 – 1000 (2) > 1000 – 1500 (3) > 1500 (4) P GV (%) 30,8 ± 7,71 57,13 ± 4,32 39,2 ± 11,2 22,2 ± 22,2 0,051 GVBD (%) 3,03 ± 2,03 9,02 ± 2,19 3,47 ± 2,33 0,136 MI (%) 2,64 ± 1,92 6,32 ± 1,8 5,97 ± 3,04 0,422 MII (%) 0,83 ± 0,83 5,97 ± 3,04 4,36 ± 1,46 0,245 Biểu đồ 3.3 Số lượng noãn thu tỉ lệ noãn phát triển kích thước buồng trứng 3.4 THÍ NGHIỆM 4: Ảnh hưởng β-mercaptoethanol đến tỉ lệ chín nỗn sau ni Bảng 3.4.1 Tỉ lệ nỗn giai đoạn phát triển theo nồng độ β-ME Nồng độ β-ME Chỉ tiêu µM (1) 50 µM (2) 100 µM (3) Số nỗn đem ni 249 259 255 GV (%) 33,81 ± 4,84a 49,64 ± 3,6b 42,16 ± 4,16b 0,045 GVBD (%) 8,95 ± 3,55 14,58 ± 3,62 14,28 ± 4,33 0,517 MI (%) 5,17 ± 2,33a 14,7 ± 2,24b 9,61 ± 2,52b 0,029 MII (%) 2,26 ± 1,57a 11,99 ± 3,56b 4,89 ± 2,65b 0,047 P Biểu đồ 3.4 Tỉ lệ nỗn trung bình giai đoạn phát triển nồng độ β-ME Phần I V KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Thu hoạch buồng trứng chó khoảng thời gian đầu tháng cho tỉ lệ noãn phát triển tốt tỉ lệ nỗn chín sau ni cấy cao tháng 3,  Chó độ tuổi từ 12 tháng đến 18 tháng có số lượng nỗn nhiều tỉ lệ nỗn chín sau ni cấy cao số chó khảo sát  Kích thước buồng trứng từ 500mm3 – 1000mm3 cho thấy đạt yêu cầu lấy mẫu để thu số lượng noãn lớn chất lượng noãn tốt  Việc bổ sung β-mercaptoethanol nồng độ 50 µM vào mơi trường ni cấy giúp tăng tỉ lệ nỗn phát triển đến giai đoạn metaphase II  4.2 ĐỀ NGHỊ  Bổ sung β-mercaptoethanol vào mơi trường ni cấy nỗn in vitro với nồng độ 50 µM  Ưu tiên chọn chó độ tuổi 12 – 18 tháng có kích thước buồng trứng từ 500mm3 – 1000mm3  Cần xác định xác tuổi giai đoạn động dục chó lấy mẫu  Khảo sát thêm thời điểm thu hoạch mẫu khác năm Xin Chân Thành Cảm Ơn Thầy Cô Các Bạn ... Số lượng noãn thu tỉ lệ noãn phát triển thời điểm thu hoạch 3.2 KHẢO SÁT 2: Ảnh hưởng tuổi chó đến số lượng nỗn thu tỉ lệ nỗn chín sau IVM Bảng 3.2.1 Số lượng noãn thu tỉ lệ noãn phát triển tốt... 3.2 Số lượng noãn thu tỉ lệ noãn phát triển độ tuổi 3.3 KHẢO SÁT 3: Ảnh hưởng kích thước buồng trứng lên số lượng nỗn thu tỉ lệ chín nỗn Bảng 3.3.1 Số lượng noãn thu tỉ lệ noãn phát triển tốt... chó bố mẹ Sản xuất số lượng lớn phôi thời gian ngắn, giá thành hạ Tiền đề cho công nghệ sinh sản vơ tính tương lai Vì đề tài ? ?Một số yếu tố ảnh hưởng số lượng nỗn ni nỗn chín chó? ?? thực hiện, nhằm