Đang tải... (xem toàn văn)
Luận án tiến sỹ nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzym protease từ b.subtilis s5 Tài liệu tham khảo Luận án tiến sỹ sinh học " nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng...
D~I HOC Quac GIA TP.HO CHi MINH TRUONGD~I HOC KHOAHOCTV NHIEN YO NGOC B{n NGHIEN CUU QUA TRINH THUY PHAN PROTEIN CA BANG ENZYME PROTEASE TU B.5UBTILI5 55 Chuyen nganh: Hml sinh Mil s6: 1.05.10 TOM TAT LU!N ANTIEN si SINHHOC THANHPHO HO CHI MINH-2004 Cong tr'inh du(jc hoan thanh t~i: Tntong D<;tihQc Khoa hQc Tif nhien TP. H6 Chi Minh va Truong D<;tihQcThuy san Nha Trang. NguOi huang daD khoa hQc: 1. PGS.TS. D6ng Thi Thanh Thu Truong Dc~lihQc Khoa hQc Tif nhien, D<;ti hQc Qu6c gla TP.HCM 2. PGS. TS. Tr~n Thi Luye'n Truong D<;tihQc ThUy san Nha Trang. Philo bi~n 1: GS.TSKH. Nguy~n Van Thoa Philo bi~n 2: GS.TSKH. Nguy~n TrQngC~n Philo bi~n 3: PGS.TSKH. Ngo Ke'Sudng Lu~n an dii du<;1cbao v~ truoc HQid6ng cha'm lu~n an ca'p Nha nuoc hQp t<;tiTruong D<;tihQc Khoa hQc Tif nhien -D<;tihQc Qu6c gia TP. H6 Chi Minh Vao h6i 9 gio 00 ngay 15 thang 10Dam2004 Co th~ HIDhi~u luij.nan t~i: Thu vi~n Truong D<;tihQc Khoa hQcTif nhien - DHQGTP.HCM ho<\icthu vi~n Khoa hQcT6ng h<;1pTP.HCM. 1 Md DAU 1. Ti'nh dIp thie't ciia lu~n an Protease 1a mt)t nh6m enzyme du<;lcling d\mg trong nhi~u lInh vtfc nhu: Nong nghi~p, cong ngM Thtfc phffm Trong thai gian gh day mt)t s6 nha khoa hQcdii tie'n hanh nghien CUusit d\mg protease trong che'bie'n Thuy san. Nhung, cac cong trlnh nghien cUusit d\mg protease trong lInh vtfc nay chua dffydu va v§:ndn du<;lctie'pt\1Cnghien CUu.Bay la lInh vtfc con mai me nhUngco ra'tnhi~u tri~n vQngd nuac ta. Nguai ta co th~ thu nMn protease tit nhi~u ngu6n khac nhau nhu tit thtfc v~t, tit nt)i tl:lngdt)ng v~t hay tit vi sinh v~t. Trong do ngu6n protease tit vi sinh v~t nha't la tit vi khuffn Bacillus subtilis la huang nghien cUuco nhi~u tri~n vQngvi B.subtilis co kha nang san xua't protease co hol:lttinh cao va co nhi~u u'uthe'hon hh. Trong che' bie'n ThUy san, protease co th~ du<;lcsit d\1ngtrong cong ngM san xua't nuac mAmd~ rut ngAnthai gian che' bie'n ho~c sit d\1ngd~ san xua't bt)t dl:lmthuy phan tit ca tl:lp.Ca tl:lPla lol:lica kern gia tri kinh te', tinh rieng tI:liKhanh Hoa, theo s6 li~u th6ng ke cua sd ThUysan, san lu<;lngkhai thac ca m6i (mt)t lol:lica tl:lp)chie'm 20% -25% t6ng san lU<;lng khai thac. Ca m6i co co thit khOngsan chAcnen gia tri kinh te'tha'p, trong chuang trinh "chi biin cac san phdm co gia tri gia tang" cua Bt) ThUy san co huang nghien cUusit d\1ngh<;lp19cac ngu6n ca tl:lp.Mt)t trong cac huang "chi biin cac san phllm co gia tri gia tang" tit ca m6i do la sit d\1ngca m6i d~ san xua't bt)t dl:lmthuy phan. Vi v~y, d~ tai "Nghien CIlu qua trlnh thuy phtin protein ca bling enzyme protease ta B.subtilis S5" la cffnthie't trong lInh vtfcche'bie'nThUysan. 2. Ml}cdich ciia lu~n an Tham do cac di~u ki~n thich h<;lpd~ khai thac va thu nMn protease tit canh tru'ang nuoi ca'yvi khuffnB.subtilis S5. Sau do sit d\1ngprotease nay trong san xua't bt)t dl:lmthUyphan tit thit ca m6i thuang (Saurida tumbil) va thit nghi~m san xua't nuac mAm tit ca com thuang (Stolephorus commersonii). 2 3. D6i tu(jng va ph~m vi nghien CUll 3.1. D6i tu(jng nghien CUll B.subtilis 55 la chUngvi khu~n co kha nang san xua'tprotease voi ho1;tt tinh cao du<Jcphan l~p ttt ttf nhien. Ca m6i thuC1ng(5aurida tumbil) va ca cdm thuC1ng(5tolephorus commersonii) du<Jcdaub bift t1;tivung bi€n Khanh Hoa. 3.2. Ph~m vi nghien CUll:g6m 3 phh 1) Nghien cUuthu nMn che' ph~m protease ttt canh truC1ngnuoi ca'y vi khu~n B.subtilis 55 va xac dinh m(}tso'd~c tinh cua enzyme nay. 2) Nghien cUuung d\mg protease B.subtilis 55 vao san xua't b(}td1;tm thuy phan ttt ca m6i thuC1ng(5aurida tumbil). 3) Nghien CUu qua trlnh thUy phan ca cdm thuC1ng(5tolephorus commersonii) b~ng protease B.subtilis 55 va d~ xua't huang ung d\mg enzyme nay trong che' bie'n nuoc mifm. 4. Phudng phap nghien CUll Lu~n an sil'd\mg cac phudng phap nghien CUucd ban cua Hoa sinh hQc co stf h6 tr<Jcua cac 19thuye't loan hQCd€ phat hi~n ra cac tinh cha't moi, cac m6i quail M gifi'acac d1;tilu<Jngva ki€m chung cac gia thuye't. 5. Cac dong gop mdi v~ mijt khoa hQc -L~n dh lien nghien cUu m(}tcach hoan chlnh v~ cac d~c tinh cua protease du<Jcsan xua't ttt chUng B.subtilis 55 phan l~p t1;tiVi~t Nam. Ke't qua cua lu~n an gap ph~n lam phong phu them nhfi'ng hi€u bie't v~ protease ttt vi khu~n B.subtilis 55. . - Dffnghien CUllsil'd\mg che' ph~m protease ttt B.subtilis 55 trong thuy phan thit ca m6i d€ san xua't b(}td1;tmthuy phan. Ke't qua nghien CUucua lu~n an khi du<Jcap d\mg trong san xua't se gap ph~n vao chudng trlnh "chi biln cae san phdm co giLltrj gia tang" m(}ttrong b6n chudng trlnh Ion cua B(}ThUysan. - Ke'tqua cua lu~n an la nhfi'ngdftn li~u moi v~ vi~c sil'd\mg protease B.subtilis 55 d€ rut ngifn thC1igian che' bie'n nuoc mifm. Ke't qua nay la cd sd d€ cac doanh nghi~p san xua't nuoc mifm cai tie'n qui trlnh cong ngh~ rut ngifn thC1igian che' bie'n. 3 6. Ke't dIU cua Iu~n an Lu~n an g6m 156 trang, 88 trang ph\11\1c,14 trang li~t ke 142 tai Ii~u tham khao. NQidung lu~n an g6m 3 ch11'dng,trong do co 30 bang va 70 d6 thi, hinh anh. ~ 'A Chddng 1. TONG QUAN TAl LI~U 1.1. MQt s6 nghien cUu v~ protease Protease la cac enzyme xuc lac s\f tMy phan lien ke't peptid (- CO - NH -). Trong cac protease thi nhom protease lieu boa d11'c,1cnghien CUll sdm va nhi€u hdn ca. Tit nam 1950 trd l<;tiday tren the' gWi co hang lo<;tt protease dQng v~t, th\fc v~t va vi sinh v~t d11'c,1ctach chie't nghien CUll. Trong thai gian g~n day cac nha khoa hQctren the' gidi t~p trung nghien CUllv€ cac protease vi sinh v~t va dfi d<;ttd11'c,1cnhi€u thanh t\!Uto 1(1nv€ nnh v\fc nay. Hi~n nay, s6111'c,1ngcac enzyme d11'c,1csan xua't hang nam tren the' gWi, d cac n11'dcpMt tri~n cM ye'u la cMu Au, My va Nh~t Ban VaGkhoang 300.000 ta'n vdi doanh thu tit san xua't enzyme 11'dctinh VaG khoang 500 tri~u USD. Trong do co khoang 600 ta'n protease tinh khie't d11'c,1csan xua't tit vi sinh v~t baa g6m khoang 500 ta'n tit vi khua'n va 100 ta'n tit na'm m6c. Nhfi'ng n11'dcco cong ngM san xua't va ung d\1ng protease lien tie'n tren the' gidi la: Dan M<;tch,Nh~t Ban, My, Anh, PMp, Ha Lan, Trung Qu6c, Duc, Ao. Cac n11'dcnay dfi d~u t11'thich dang cho cong lac nghien CUll,san xua't va ung d\mg protease tit vi sinh v~t. Chinh vi the' nhip dQ san xua't enzyme d qui mo cong nghi~p t<;ticac n11'dcpMt tri~nhang nam tang vao khoangtit 5%+ 15%.Ngaynay ng11'aita co th~ san xua't cac enzyme protease c6 dinh tren cac cha't mang khong tan cho phep co th~ tai sa d\1ngl<;tienzyme nhi€u Mn. Vi v~y ma vi~c ung d\1ng protease ngay cang gia tang. d Vi~t Nam cling co nhi€u cong trinh cong b6 v€ vi~c nghien CUllsa d\1ngprotease cM ye'u t~p trung vao cae protease th\fc v~t va dQng v~t con protease tit vi sinh v~t mdi chi d11'c,1cnghien CUlltrong hdn ch\1cnam trd l<;tiday. Vi v~y dn tie'p t\1Ctang c11'angnghien cUu v€ protease tit vi sinh v~t noi chung va protease tit vi khua'nnoi rieng. 4 '1.2. Gioi thi~u v~ ntioe miim va phtidng phap su' d\mg protease trong san xua't ntioe miim Nuoc miim truy~n th6ng Hike't qua cua qua trlnh thuy phan protein thit ca duoi tac dQngcua M protease nQitl;litrong di~u ki~n co mu6i theo co che': protease protease protease Protein ~ ~ polypeptid .peptid ~ .axit alliin Ciing voi qua trlnh thiiy phan protein thit ca con co hang lol;ltqua trlnh bie'n d6i sinh boa sau sAcdo mc dQngcua nhi~t dQva h~ vi sinh v~t co trong do ma hlnh thanh mall sAc, huang vi d~c tru'ng cua nuoc mAID. Trong khoang 24 gia d~u tieD, duoi mc dQngcua M protease nQiti;licua ca ma chUye'u la cac proteinase serine, proteinase kim 10l;liva proteinase aspartic mQt ph~n protein thit ca bi thuy phan thanh peptid, polypeptid boa tan trong nuoc b6i (nuoc ca). Sau do protein thit ca, polypeptid va cac peptid du<;lcti;lothanh d tren Il;litie'p t1;1cbi thuy phan ml;lnhme bdi cac proteinase kim 10l;litl;lothanh cac axit alliin t1!do, cac peptid ngiin va da: co s1!hlnh thanh huang vi nuoc mAID.Tit giai dol;ln3 + 6 thang duoi tac d1;1ngcua cac protease d~c bi~t Ia cac proteinase serine, cac peptid, cac protein, polypeptid con Il;litie'p t1;1cbi thUy phan tl;lothanh cac axit amiD t1!do. Khi do chU<;lpda:chin, nuoc mAmnit ra co mall va mlii vi d~e tru'ng. Ch!t lu<;lngcua nuoe mAm ph1;1thuQe vao 10l;liea, t)11~mu6i sii' d1;1ng,pH, nhi~t dQ,phudng phap ehe' bie'n Trongqua trlnh san xu!t ne'u bie't ph6i h<;lphai boa cae ye'u to'nay thl nuoe mAmse dl;lteh!t lu<;lngcaD. V~ nguyen tAethl t!t ea cae loai ea bi€n d~u co th€ sii'd1;1ngd€ san K 'A J Nh d ~ 0 th ~. K d 'A oS th d A xuat nuve mam. ltng e e e san xuat u<;lenuve mam dm ngon, Q dl;lmcaDva mang Il;lihi~u qua kinh te' thl e~n chQnca co thit m~m, ham lU<;lngprotein caD, de thuy phan, ti;lora so' lu<;lngnuoe miim nhi~u voi huang vi thdm ngon. Cae 10l;liea thuang dlipg d€ san xu!t nuoe mAmla: ea com, ea n1;1e,ea trieh, ea li~t, ea bo, ca m6i trong do ehu ye'u la ea com va ea n1;1e. Nhln chung cae phuong phap ehe' bie'n nuoe miim truy~n th6ng d nuoc ta con tho so, thai gian san xu!t dai tit 6 + 12 thang. D€ nit ngiin thai gian san xu!t nuoe miim da:co nhi~u cong trlnh nghien CUllnh~m tang euang 5 ho~tdQngciia h~ protease co siintrongca va Mvi sinh v~t tl)'nhien bAng cach tie'p nhi~t, cho mu6i nhi~u liin, nao daD. Nhu'ng thai gian che' bie'n nudc mAm rhea cac phuong phap nay vh con dai. Vi v~y da:co mQtso' cong trinh nghien cUu sit dl,mgprotease b6 sung them tit bell ngoai dS tang cuang kha nang thuy phan protein ca thanh axit aminoPhuong phap nay co ttu diSm la thai gian che' bie'n ngAn, luQng mAm c6t nhi~u hon nhung san phifm co mui vi va mall sAckern nudc mAm san xua't rhea phuong phap truy~n th6ng. DS khAcphl,lchi~n tuQngnay nguai ta co thS cho ch~y qua chuQp t6t dS la'y huang. Vi v~y, vi~c nghien cUu san xua't nudc mAm rhea phuong phap sit dl,lngprotease con dn thie't phai duQc tie'p tl,lCnghien cUu. 1.3. GiOi thi~o v~ b~t d~m va phu'dng phap su' dvng protease d~ san xoa't b~t d~m thuy phan tit ca Trong qua trlnh khai thac danh bAt tbUy san d nudc ta, luQng ca t~p kern gia tri kinh te'thuang chie'm ty tr<;}figIOn.Vi v~y, trong chuang trlnh "chi biin cac san pMm co gid tri gia tang" cua BQTbUy san co phiin nghien CUusit dl,lng hQp 19cac ngu6n ca t~p, mQt trong cac huang che' bie'n do la san xua't bQtd~m tbUyphan. Thl)'ccha't cua qua trinh san xua't bQt d~m ca b~ng phuong phap sit dl,lngprotease la qua trinh tbUyphan protein ca t~o ra cac peptid va axit amin dudi tac dQngcua h~ protease nQit~i va protease b6 sung tit bell ngoai. Trong qua trinh thuy phan thit ca b~ng protease co nhi~u ye'u to'anh hudng tdi t6c dQthuy phan nhu: ty l~ enzyme, nhi~t dQ,pH, ty l~ nudc b6 sung Nen yell ch d~t ra la phai tim ra che'dQ thuy phan thich hQpdS san xua'tra bQtd~m ca d~t yell duo Chudng 2.VOl TU(1NGvA PHUONGPHAp NGHIEN CUD 2.1. VO'itu'Q'ngnghien CUll 2.1.1. Ngo6n tho nh~n enzyme protease B.subtilis S5 Ia chung vi khuifn co kha nang san xua't protease vdi ho~t tinh cao duQc phan l~p tit tl)'nhien va lUll giii' t~i phOng Vi sinh - Vi~n Sinh hQc Nhi~t ddi TP. H6 Chi Minh. ChUng B.subtilis S5 nay duQc sit dl,lngdS nghien cUu san xua't protease b~ng phuong phap nuoi ca'y ban rAn.Sau khi ditng qua trinh nuoi, thu canh trltang chua protease, sa'ykho, xay min va sit dl,lngdS tach chie't protease. 6 2.1.2. Nguy~n li~u ea d~ san xudt nu'oe miim va bQt d~m - Ca m6i nguyen li~u: Ca m6i thu'ang (hlnh 2.1) du'<;ledaub bAt t~i vilng bi~n Khanh Hoa, ea tu'di du'<;leb,taehQntheo lieu ehu[{nTCVN 3250 - 88. Thit ea m6i thu'ang du'<;lesii'd\1nglam nguyen li~u d~ nghien eUusan xua'tbQtd~m thuy pMn bAngprotease B.subtilis S5. mnh 2.1. Ca mol thu'CIng(Saurida tumbil) (Sau day gQitAt"ea m6i thu'ang" la "ea m6i"). - Ca edm nguyen li~u: ea edm thu'ang (hlnh 2.2) lam nguyen li~u san xua't nu'demAmla lo~i ea n6i co mila V\1tir thang 2 + 5 va tir thang 7 + 10 hang Dam.San lu'<;lngea edm khai iliac (jNha Trang vao khoang 12.000- 15.000 ta'nInam. II'mh 2.2. Ca cdm thu'CIng(Stolephorus commersonii) (Sau day gQitAt"ea edm thu'ang" la "ea edm"). 2.2. Phu'dng phap nghi~n CUll -Xae dinh ho~t dQ protease theo phu'drig phap Anson. - Dinh lu'<;lngprotein boa tan theo phu'dngphap Lowry. - Xae dinh ham lu'<;lngnu'de, lipid, nitd t6ng so' (NTs),mtd NH3, mtd axil amiD,tro, theo TCVN 3700, 3703, 3706, 3708, 5105 - 90. - Xae dinh thanh ph~n va ham lu'<;lngaxil amiDbAngphu'dngphap sAc ky khi teen may GC-17A SIllMADZU vdi dQnh~y 10-9. - Xae dinh ham lu'<;lngkim lo~i bAngphu'dng phap quang ph6 ha'p th\1 nguyen tii'. -Danh gia earn quaDtheo TCVN 3250-88. - Tinh s~eh enzyme theo phu'dngphap sAcky lQegel sephadex G-75. 7 2.3. Phuong phap xii' Iy s61i~u: Xii Iy s6li~u nghien cUurhea phuong phap th6ng ke sinh hQc.M6i thi nghi~m d~u tie'n hanh 3 Ian, m6i I&n3 mi1uva ke't qua la trung binh d)ng coa cac I&nthi nghi~m. s6 li~u duQc xii Iy d~ ve d6 thi tren ph&nm~m Excel vdi h~ s6 tuong quail R ?:0,95. Chu'o'ng3. KET QUANGHIEN CUU vA THAOLU!N 3.1. Nghien CUllsan xua't protease tit B.subtilis 55 3.1.1. Phuong phap giii'~m thich hQ'p Thii nghi~m san xua't protease ttt B.subtilis S5 rhea phuong phap nuoi ea'y ban rAntrong di~u ki~n co thong gio va giG'a"'mrhea 3 phuong phap nhu san: phuong phap 1: b~ m~t khay nuoi khOng pho vai a"'m;phuong phap 2: b~ m~t cae khay nuoi duQcphOvai a"'m;phu'ong phap 3: b~ m~t khay nuoi pho vai a"'mva san 4 giOnuoi phon hoi nude qua may th6i khi vao phong nuoi d~ t<.10de>a"'m.San 37 gio nuoi, tho canh tru'ong chua enzyme va xae dinh ho<.1tde>protease. Ke'tqua th~ hi~n d bang 3.1. Bang 3.1. Anh hudng cua phuong phap giii'~m toi ho~t dQprotease B.subtilis 55 tho duQ'ctrong canh truong Phu'ong phap giG' a"'m Ho<.1tde>protease (UI/g canh tru'ong) 1 20,2 2 21,1 3 28,2 Tr<.1ngthai eoa eanh tru'ong B~ m~t eanh tru'ong bi thO, nUt,vi khua"'nmQe trAngphia du'di con d phia tren thl thong mQc. Tu'ongtl! nhu'tren B~ m~t canh tru'ong thOng bi thO, kh6i canh tru'ong nong, a"'m,m~m, vi khua"'nmQc trAng cii tren va du'di. I I Ttt ke't qua bang 3.1 cho tha'y phu'ong phap phO vai a"'mtren b~ m~t canh tru'ong nuoi va phon a"'mla phu'ong phap thich hQp nh~m giG'a"'mcho canh tru'ong nuoi B.subtilis 55 d~ san xua't protease. 8 3.1.2. Xac dinh kha Dang san xua't protease cua B.subtilis 55 trong di~u ki~n co thong gio va khOng thong gio Tie'n hflOh san xua't protease tif B.subtilis S5 theo 2 phlidng phap: phlidng phap 1: nuoi ca'y trong di~u ki~n khOngthong gio va phlidng phap 2: nuoi cffy trong di~u ki~n co thOng gio. Sau 37 gio, tho canh trliong chua enzyme va xac dinh ho<:ltdQprotease. Ke't qua th~ hi~n d bang 3.2. Bang 3.2. Anh hlfdng cua thong gio tOi ho~t dQprotease tho dlf(jc Ke't qua nghien cUud bang 3.2 cho thffyphlidng phap nuoi ca'yban dn co thong gio la thich h<;fpcho vi~c san xufft protease tit B.subtilis S5. 3.1.3. Xac dinh thai gian ke't thuc qua trinh nuoi B.subtilis 55 Tie'n hanh san xufft protease tit B.subtilis S5 theo cac di~u ki~n da chQn, sau 17; 21; 25; 53 gio, tho canh trUong nuoi, sffykho va xac dinh ho<:ltdQenzyme. Ke'tqua th~ hi~n d bang 3.3. Bang 3.3. Anh hlfdng cua thai gian de'n ho~t dQprotease tho dlf(jc Ke't qua nghien cUucho tha'y co th~ difng qua trlnh nuoi d thai di~m 41 gio d~ co th~ tho dli<;fccanh trUongco ho<:ltdQprotease cao. 3.1.4. D~ xua't quy trinh san xua't protease tit B.subtilis 85 Tif cac ke't qua nghien cUu d teen d~ xufft quy trlnh nuoi ban din san xufftprotease tifB.subtilis S5 nhli sau: Phlfdng phap Hot dQprotease Trng thai canh trlfong (UI/g canh trUong) 1 19,3 Nhit dQcanh trlfong nuoi co th6 leu de'n 55°C, vi khuffn phat tri6n kern, canh trlfong roi rc. 2 28,6 Nhit dQcanh trlfong nuoi t6i da leu Wi 45°C, vi khuffn rnQctriing d. teen va dlfdi, canh trlfong cleodinh. Th<'1igian 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 (gi<'1) Hot d(> 5,0 8,0 12,5 17,5 23,5 31,5 33,2 33,1 32,0 29,5 protease (DUg) [...]... h70% Sau do ly tam thu che' ph£m enzyme (CPE), boa tan trong cling me>t h~ tich nudc ca't va xac t dinh ho~t de> protease Ke't qua nghien cUuth~ hi~n d hlnh 3.3 100 '0 :::;-120... protease B.subtilis S5 Cac ke't qua phan tich cho tha'y che'di) b6 sung mu6i an vao hOn h . chie'trut protease tli B. subtilis S5. 3.2.2. Xae djnh tae nhdn ke't tna protease B. subtilis SS Tie'n hanh ke't tua protease B. subtilis S5 ra. Iy tam tho B. subtilis 55 dung d€ san xufftenzyme. + San xua't protease tit' B. subtilis SS M6i truong nu6i B. subtilis 55 san xufft protease (152,19kg/me)