TRƯỜNG ………………. KHOA………………  BÁO CÁO TỐT NGHIỆP Đề tài: Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 1 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ………………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN ………………………………………………………………ii MỤC LỤC …………………………………………………………………iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ……………………………………………vi DANH MỤC CÁC BẢNG ……………………………………………… vii DANH MỤC CÁC HÌNH ……………………………………………… viii MỞ ĐẦU Error: Reference source not found CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Cúm A/H5N1 3 1.1.1. Cấu tạo 3 1.1.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ 5 1.1.3. Khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 7 1.1.4. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ 8 1.2. Kháng nguyên HA 10 1.3. Tình hình nghiên cứu cúm A và vấn đề nghiên cứu vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới 12 1.3.1. Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới 1 Error: Reference source not found 1.3.2. Nghiên cứu phát triển vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới 16 1.4. Kỹ thuật chuyển gen thông qua A.rhizogens và ứng dụng 19 1.4.1. Giới thiệu vi khuẩn A.rhizogens 19 1.4.2. Hệ vector nhị thể Error: Reference source not found 1 2 1.4.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất dược phẩm sinh học tái tổ hợp Error: Reference source not found 3 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error: Reference source not found5 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị Error: Reference source not found 5 2.1.1. Vật liệu Error: Reference source not found 5 2.1.2. Hóa chất Error: Reference source not found 5 2.1.3. Thiết bị Error: Reference source not found 6 2.2. Phương pháp nghiên cứu Error: Reference source not found 6 2.2.1. Phương pháp nhân đoạn gen HA1bằng kỹ thuật PCR Error: Reference source not found6 2.2.2. Phương pháp ghép nối đoạn gen HA1vào pENTR221/cal Error: Reference source not found8 2.2.3. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E. coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt 30 2.2.4. Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway 3 Error: Reference source not found 2.2.5. Biến nạp vector chuyển gen vào A. rhizogenes ATCC15834 35 2.2.6. Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa protein vỏ virus vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 36 2.2.7. Phương pháp đánh giá cây trồng chuyển gen 37 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu ………………………………………. 39 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. Kết quả tách dòng gen HA1 40 3.1.1. Kết quả PCR nhân đoạn gen HA1 40 3.1.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 41 3 3.1.3. Ghép nối đoạn gen HA1 vào vector pENTR/cal . 4 Error: Reference source not found 3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA1 bằng kỹ thuật Gateway ® . 47 3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp theo phản ứng LR 47 3.2.2. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR . 48 3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 48 3.3. Kết quả biến nạp pK7WG2D/cal/HA1 vào vi khuẩn A.rhizogenes . . 49 3.4. Kiểm tra hệ thống tạo rễ tơ chuyển gen thông qua A.rhizogenes sử dụng gen chỉ thị Gus 51 3.5. Kết quả chuyển gen HA1 vào mảnh lá thông qua A. rhizogens để tạo các dòng rễ tơ chuyển gen HA1 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC …………………………………………………………………. 66 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cúm gà (avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của các loài chim, kể cả gia cầm và thuỷ cầm, do các subtype khác nhau thuộc nhóm virus cúm A gây nên. Do có sức đề kháng tự nhiên tốt nên một số loài chim mang virus gây bệnh, nhưng không có biểu hiện của bệnh. Đây là mối nguy hiểm lan truyền bệnh cho các loài gia cầm khác. Ngoài ra, chúng còn là nơi cung cấp nguồn tàng trữ biến đổi nguồn gen tạo nên các subtype mới. Các subtype virus cúm A gây bệnh trên người đều có nguồn gốc tiến hoá biến thể và biến chủng từ động vật và sau khi thích ứng trên người thì gây bệnh, trước đây đã tạo nên những vụ dịch thảm khốc, rồi biến mất sau một thời gian lại tái 4 hiện và gây nên đại dịch mới. Năm 2004 các đại dịch cúm gia cầm tại các nước châu Á (bao gồm dịch do H5N1 gây ra tại Trung Quốc, Nhật, Nam Triều Tiên, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Campuchia và Lào; do H7N3 (Pakistan); do H5N2 ( Đài Loan) đã gây thiệt hại hàng trăm triệu gia cầm, làm chết hàng chục người ở Việt Nam và tại Thái Lan. Chủng H5N1 điển hình ở châu Á có tính kháng nguyên và di truyền giống với chủng A/Vietnam/1203/04. Để phòng chống sự lây lan mạnh mẽ của đại dịch cúm gia cầm, hàng năm Việt Nam cần một lượng vaccine rất lớn để tiêm chủng cho hàng trăm triệu con gà vịt. Ngoài những công nghệ sẵn có Việt Nam đang tìm kiếm những công nghệ sản xuất vaccine có ý nghĩa kinh tế, an toàn và hiệu quả cao. Vaccine ăn được có nguồn gốc từ thực vật sẽ là nguồn vaccine đáp ứng được các tiêu điểm đó và sẽ đem lại nhiều lợi ích cho ngành thú y và được xem là hướng đi phù hợp với những nước đang phát triển vì mục đích chăm sóc sức khoẻ cộng đồng như Việt Nam. Chuyển gen mã hóa các vaccine tái tổ hợp vào thực vật cụ thể là vào các cây trồng là nguồn thức ăn chính cho con người, động vật nuôi là một trong những hướng đi chính hiện nay. Tuy nhiên bên cạnh đó, một xu hướng cũng được bắt đầu quan tâm nghiên cứu và ứng dụng là sử dụng hệ thống nuôi cấy sinh khối tế bào để sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Do tế bào thực vật có ưu thế nuôi cấy dễ dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng hơn cả tế bào thực vật nuôi cấy in vitro không mang các mầm bệnh cho người. Với mục đích tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sỹ là: “Thiết kế 5 vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá”. 2. Mục tiêu của đề tài - Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1. - Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây thuốc lá tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A.rhizogens. 3. Nội dung nghiên cứu - Ghép nối gen HA1 mã hóa tiểu phần protein vỏ virus H5N1 vào vector mang pENTR 221/cal để tạo vector tái tổ hợp. - Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1. - Tạo vector chuyển gen vào thực vật mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1 và biến nạp vào vi khuẩn A. rhizogens. - Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây thuốc lá tạo rễ tơ thông qua A.rhizogens. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cúm A/H5N1 1.1.1. Cấu tạo Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Đây là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt vỏ của hạt virus . Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Dal. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa 6 khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand (Hình 1). Hình 1.1. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A. Ghi chú: A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzyme polymerase của virus). C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge). Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các 7 dấu ấn khác của virus , . Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm , . Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9), và sự tái tổ hợp (reassortment) giữa các phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA), hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ. Các subtype này gây nhiễm cho hầu như phần lớn mọi loài sinh vật bao gồm các loài lông vũ (gà, chim và thuỷ cầm), lợn, ngựa, chồn đất, hải cẩu, cá voi và loài người. Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, virus cúm A có 8 phân đoạn (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotide, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus (hình 2). Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen (hình trái) gồm 8 gen là 8 đoạn RNA sợi đơn âm (-ssRNA) và mô hình (hình phải) thể virus cúm H5N1 gồm các 8 protein và các đoạn –ssRNA. (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge). 1.1.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ Độc lực gây bệnh của virus cúm A Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên . - HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48h sau nhiễm. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin , . - LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm , . Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1 Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên . 9 Hình 1.3. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A (Nguồn: http://www.impe-qn.org.vn/impe- qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=3194) Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có khả năng xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và cả ở người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn; gà - lợn - người. Vịt (vịt trời) và một số loài thuỷ cầm khác (ngỗng) luôn luôn là vật chủ tàng trữ nguồn virus gây nhiễm , , . Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên (gen “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người , , . 10 [...]... hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của 12 virus và các RNA vận chuyển Phức hợp protein – RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase Các sợi này không được Adenine hóa. .. thành một hệ vector nhị thể gồm có vector chuyển gen (mang cấu trúc T-DNA) và vector bổ trợ (mang các gen vir) đảm nhiệm chức năng vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật Vector chuyển gen trong hệ vector nhị thể ở A.tumefaciens có thể sử dụng để chuyển gen thông qua A.rhizogenes Khi nhiễm A.rhizogenes với thực vật sẽ làm chuyển T-DNA từ vector chuyển gen cùng với T-DNA của A.rhizogenes vào genome thực... nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus. .. (Viện Sinh học phân tử và Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức) c Các vector: - HA của virus H5N1 đã được tối ưu hóa mã để biểu hiện ở thực vật do Viện Công nghệ sinh học cung cấp - Vector chuyển gen pK7WG2D(1) (phụ lục 2) - Vector pENTRTM221/cal nhận từ Viện Sinh học phân tử và Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức Vector này được thiết kế mang đoạn signal peptide calreticulin nằm giữa... cho phép đưa bộ gen của virus vào tế bào đích bằng cách hợp nhất màng endopisome của tế bào chủ với vỏ ngoài virus Cơ chế hoạt động: HA gắn kết với phân tử glycoprotein trên bề mặt của tế bào đích, dẫn đến các phân tử virus kết dính với tế bào vật chủ Màng tế bào sẽ bao bọc lấy virus và phần màng này sẽ tách ra hình thành một màng mới nằm trong tế bào gọi là endosome, endosome chứa virus được bao gói... theo từng chủng virus cúm A (ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng 1704 - 1707 bp) Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA 1 và HA2 Vùng nối giữa HA 1 và HA2 gồm một Hình 1.5 Mô hình cấu trúc protein 3 chiều của HA số amino acid mang tính kiềm (Nguồn:http://vi.wikipedia.org/wiki/Hemagglutinin) được mã hóa bởi một chuỗi... Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi” của virus NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ... chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus. .. hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống virus cúm A/H5N1 Vaccine DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA, NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen. .. đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus cúm A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003 Những chuỗi gen giúp xác định phân type H5, phân type N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen , [44] Trên . tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sỹ là: “Thiết kế 5 vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu chuyển gen HA1 tạo các dòng. chuyển gen ở cây thuốc lá”. 2. Mục tiêu của đề tài - Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1. - Bước đầu chuyển vector