Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu sự phát triển của hệ sợi nấm Hương (Lentinula edodes) trong môi trường nuôi cấy lỏng
Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Trang, K12 LEM is a product of SUN LEM co., Ltd (former Noda Shokukin Co., Ltd.) It is a brownish spray-dried powder of the hot-water extract of a mycelial culture of the Japanese edible mushroom, Lentinus edodes (shiitake) LEM contains water soluble metabolites together with components originating from both the autolyzed mycelia and enzymatically degraded constituents of the culture medium PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cùng với xu hướng phát triển xã hội nhu cầu thực phẩm ngày tăng cao số lượng chất lượng Trong phần ăn hàng ngày cần phải có loại thực phẩm cung cấp đẩy đủ dinh dưỡng đa lượng vi lượng cho nhu cầu hoạt động phát triển thể Bên cạnh nguồn dinh dưỡng từ ngũ cốc rau thịt thường khơng thể thiếu chúng cung cấp loại vitamin khống chất cho thể Trong dinh dưỡng đại, thực phẩm chức trở thành ngành khoa học công nghiệp tất nước quan tâm Thực phẩm chức trước hết thực phẩm, có thêm tính chất phịng chữa bệnh Nấm ăn loại thực phẩm biết từ lâu đời ngày xếp vào nguồn cung cấp thực phẩm chức nhiều quốc gia Trong loại nấm nấm Hương (Lentinula edodes) loại thực phẩm vừa rau vừa thịt có giá trị dinh dưỡng cao Hơn có khả phòng chữa bệnh Từ xa xưa, nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc…đã biết trồng sử dụng nấm Hương để làm thực phẩm dược phẩm Tuy nhiên ngày nước khu vực Đông Nam Á nói riêng tồn giới nói chung sử dụng nấm Hương làm thực phẩm đồng thời nghiên cứu công nghệ sản xuất chế biến sản phẩm có hoạt tính sinh học cao dùng để phịng chữa bệnh cho nhân loại Vì nấm Hương có giá trị dinh dưỡng hoạt tính dược lý cao, nên nhà nghiên cứu khơng ngừng tìm hiểu nghiên cứu Theo nhiều kết nghiên cứu nấm Hương dùng làm thực phẩm dạng thể, hệ _ Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Trang, K12 sợi chứa đầy đủ số lượng chất lượng hoạt tính sinh học, dinh dưỡng hương vị tương tự thể [15] Việc nuôi cấy hệ sợi nấm lớn giá thể rắn kỹ thuật phổ biến trồng nấm lấy thể Mặt khác hoàn toàn sử dụng phương pháp ni cấy mơi trường lỏng phổ biến loại nấm mốc vi khuẩn Nuôi cấy lấy hệ sợi nấm Hương rút ngắn thời gian, khơng địi hịi khắt khe điều kiện nhiệt độ ni trồng lấy thể, ni trồng lấy thể phụ thuộc vào điều kiện thời tiết Do yều cầu nhiệt độ thấp hình thành phát triển thể nên bất lợi lớn sản xuất nấm Hương nước ta Trên thực tế số tỉnh vùng cao miền núi phía bắc trồng nấm Hương, khối lượng hàng năm thấp Trong nuôi nấm Hương lấy sinh khối sợi Việt Nam lại có điều kiện khí hậu phù hợp địa bàn khắp nước Hiện giới việc nghiên cứu phát triển loại nấm thực phẩm (nấm Bào ngư, nấm Hương…) hay nấm thuốc (nấm Linh Chi) môi trường lỏng phổ biến phục vụ hai mục đích khác là: 1Làm giống nấm cho nuôi trồng lấy thể qui mô tập trung kiểu công nhiệp; 2- Thu sinh khối sợi nấm thu hoạt chất nấm mơi trường Như vậy, với mục đích sử dụng nấm hương việc khảo sát phát triển môi trường lỏng khâu cần thiết quan trọng để tạo tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng Chính vậy, khn khổ khố luận tốt nghiệp này, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu phát triển hệ sợi nấm Hương (Lentinula edodes) mơi trường ni cấy lỏng” 1.2 Mục đích Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Thu sinh khối sợi nấm Hương qua q trình ni cấy mơi trường lỏng 1.2.2 Yêu cầu - Lựa chọn chủng giống nấm tốt _ Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Trang, K12 - Phải nắm bắt thao tác thực nuôi cấy chủng nấm Hương mơi trường rắn lỏng quy mơ phịng thí nghiệm (đúng thao tác, khử trùng, tiệt trùng cách) - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phát triển hệ sợi nấm Hương môi trường nuôi cấy lỏng xác định thông số tối ưu cho phát triển hệ sợi nấm _ Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Trang, K12 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung nấm Hương hệ sợi nấm Hương 2.1.1 Đặc điểm hình thái đặc tính sinh học nấm Hương Nấm Hương (Đông cô, Hương cô, Shiitake) có tên khoa học lentiluna edodes Nấm Hương thuộc họ Tricholomataceae, Agaricaless, lớp phụ Hymenomycetidae, lớp Holobasidiomycetes (hoặc Homobasidio-mycetes hay Eubasidiomycetes), ngành phụ Basidiomycotina, ngành Nấm thật – Eumycota, giới Nấm – Myconta hay Fungi Nấm Hương thuộc nhóm nấm hoại sinh, thuộc nhóm nấm mọc gỗ Nấm Hương có dạng ơ, mũ nấm có đường kính 4-10 cm, màu nâu nhạt, chín chuyển thành nâu sậm Lúc đầu mũ nấm có dạng nón nhọn giữa, sau trải rộng phẳng Viền mũ thường cuộn vào Mặt có màu nâu đến đen rải rác vẩy trắng Phiến có màu trắng, bị dập hay già biến thành màu nâu Bề ngang phiến tương đối rộng có khuynh hướng bám vào cuống nấm Mặt tai nấm màu nâu, mặt có nhiều mỏng xếp lại Trên mặt nấm có vảy nhỏ màu trắng Thịt nấm màu trắng, cuống hình trụ [3] Chu trình sống đảm bào tử nảy mầm cho hệ sợi sơ cấp Hai sợi sơ cấp khác phải phối hợp cho hệ sợi thứ cấp Hệ sợi thứ cấp phát triển thành mạng hệ sợi Trong điều kiện thuận lợi mạng hệ sợi kết hạch tạo tiền thể (nụ nấm) Nụ nấm tiếp tục lớn dần cho tai nấm trưởng thành, phiến mũ mang đảm sinh bào tử Đảm bào tử phóng thích chu trình lại tiếp tục _ Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Trang, K12 Ngoài nhu cầu nguồn hydrat carbon, nấm Hương cịn cần đến nitơ Đạm thích hợp cho nấm chủ yếu dạng hữu như: pepton, axit amin, urê nhiều loại muối amôni Nấm sử dụng đạm vô nitrat hay nitrit Nồng độ thích hợp cho tăng trưởng hệ sợi tùy thuộc nguồn đạm cung cấp như: Sulfat ammon 0,03%; Tartrat ammon 0,06% Sự hình thành thể cần có đường đạm nồng độ đạm cao 0,02% với sulfat ammon ức chế phát triển nấm Ngược lại, để nụ nấm tiếp tục phát triển thành tai trưởng thành, nghĩa sản lượng tăng nồng độ đường phải cao, tối thiểu 8% với đường saccharose Nhu cầu dinh dưỡng khoáng nấm Hương như: Mn, Fe, Zn cần 2mg/l Ngồi cịn cần Mg, S, K, P để thúc đẩy tăng trưởng nấm Để sợi nấm phát triển tốt cần bổ sung thêm vitamin B với lượng 100µg/l Giá trị pH tối ưu cho sợi nấm phát triển môi trường lỏng 4,8, mạt cưa 4,5 Ở pH 8, nấm mọc chậm [2] Nấm Hương mọc tự nhiên nhiều Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan Chúng sống nhiều loại gỗ gỗ shii, gỗ sồi, hạt dẻ, gỗ thích Nấm Hương sống nhiệt độ ẩm, ưa ẩm Nhiệt độ thể nấm hình thành phát triển khoảng 15-160C [12] Các thông số môi trường quan trọng cho phát triển nấm Hương sau [9,10]: Nhiệt độ sợi nấm phát triển tốt 24-260C Độ ẩm chất: 65-70% Độ ẩm khơng khí: ≥ 80% Độ pH trung tính Ánh sáng khơng cần thiết giai đoạn sợi nấm phát triển Giai đoạn hình thành thể cần ánh sáng khuếch tán Độ thơng thống trung bình _ Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Trang, K12 Hình 2.1 Nấm Hương 2.1.2 Giai đoạn phát triển hệ sợi nấm Hương Chu trình sống nấm Hương bắt đầu tử bào tử đảm nảy mầm cho hệ sợi nấm Hương, sợi nấm lúc đầu nhỏ khoảng 1,5-1,0 mm đường kính, sau lớn dần lên đến kích thước đường kính 1,0-2,0 mm Sau trình tiếp hợp hai sợi nấm sơ cấp đơn nhân hình thành nên sợi nấm thứ cấp song nhân Các sợi nấm tăng trưởng theo kiểu tạo móc (clamp) để lại dấu vết tế bào Khi gặp điều kiện bất lợi sợi nấm song nhân tạo bào tử màng dày (bào tử áo – chlamydospore) giúp sợi nấm sống sót qua trường hợp bất lợi Bào tử màng dày điều kiện thuận lợi nảy mầm tạo sợi nấm Khi sợi nấm thứ cấp phát triển dày đặc chất bắt đầu q trình phân hóa để tạo thể Trước thể hệ sợi nấm Hương phát triển sinh khối đến mức tối đa chuẩn bị cho trình thể Nhưng điều đặc biệt hệ sợi nấm Hương có đẩy đủ về lượng chất giống thể, phịng chữa bệnh cho người Được sử dụng ăn hay chế phẩm sinh học _ Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Trang, K12 Trong giai đoạn phát triển hệ sợi, nấm cần nguồn dinh dưỡng môi trường đảm bảo nguồn cung cấp bon, nitơ khoáng [3] 2.1.3 Giá trị dinh dưỡng nấm Hương hệ sợi nấm Nấm Hương có giá trị dinh dưỡng cao, sử dụng nấm Hương làm rau thực phẩm cung cấp vitamin (như vitamin B 1,B2, vitamin PP, vitamin D2…) chất khoáng (Fe, Mn, K, Ca, Mg, Cd, Cu, P Zn) cho thể Đặc biệt hệ sợi nấm Hương đầy đủ vitamin khoáng chất thể, bổ sung dinh dưỡng cho người Các chất tạo nên hương thơm: xetôn, sunfit, ankan, axit béo…Theo Mizuno yếu tố tạo nên hương thơm, vị ngon nấm monosodium glutamate, nucleotit, amino axit tự do, chuỗi peptit, axit hữu (axit malic, axít fumalic, axít glutaric, axít oxalic, axít lactic,… ) đường [2, 12] Hơn nấm Hương hệ sợi nấm Hương có tới 40 loại enzyme, đáng ý enzyme β (1-3) glucozidaza, kitinaza, esteraza, lipoidaza, ligninaza, almondaza, pepsin, loxintinaza, tannaza, pectinaza, saccaraza, transferaza, maltaza, xenlulaza, hemixenlulaza, amylotransferaza, inulaza, melibiaza, glycozidaza, ureaza, insulinaza, asparaginaza, peroxydaza, lactaza, carboxylpeptidaza, tyrozin oxydaza, zymaza, lichen amylaza, chymosin, metalloproteaza…[12] 2.2 Tính chất dược học nấm Hương hệ sợi nấm Hương 2.2.1 Các hoạt chất tách chiết từ hệ sợi nấm Hương a) Chế phẩm LEM (Lentinula Edodes Mycelium): Chiết xuất từ hệ sợi nấm Hương lên men giá thể bã mía coi thành cơng lớn Nhật Bản Trung Quốc LEM giàu Lentinan - hoạt chất quan trọng nấm Hương, chiết xuất từ thể từ sinh khối sợi nấm, chất tạo nên tác dụng dược lý nấm Hương LEM tách chiết từ hệ sợi nấm Hương dạng bột Hệ sợi Lentinula edodes (LEM) Trong kg bột chứa 6-7g LEM _ Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Trang, K12 b) LAP chế phẩm tách chiết từ hệ sợi nấm Hương Dung dịch hệ sợi nấm Hương + lần thể tích ethanol gọi LAP LAP ≈0,3g LEM Hệ sợi nấm Lentinula edodes LAP glycoprotein bao gồm đường glucose, galactose, xylose, arabinose, manoza, fructozo LEM LAP chứa dẫn xuất axít nucleic vitamin B (như B1, B2) ergosterol Tạo nên giá trị dinh dưỡng tính dược lý hệ sợi nấm Hương Năm 1990, EP3 thu từ LEM Là chất hoạt hóa miễn dịch bao gồm nhiều nhóm cacboxyl Chính LEM LAP kích thích hoạt hóa hệ thống miễn dịch chống lại bệnh tật c) Hệ sợi nấm Hương dạng bột: Sinh khối sợi nấm Hương chế biến bổ sung thành thực phẩm bổ dưỡng dạng bột Dạng bột ăn liền sử dụng thuận tiện bột canh pha với nước sơi trước sử dụng Có thể tìm thấy sản phẩm kiểu siêu thị Nhật Bản [12] 2.2.2 Tính chất dược học Hệ sợi nấm Hương chứa loại polysaccarit tên Lentinan - hoạt chất quạn trọng hệ sợi nấm Hương thể nấm, mà tạo nên tính dược lý cho nấm Hương Lentinan chiết xuất từ sinh khối sợi nấm Hương thành phần hệ sợi Năm 1969 nhà khoa học Nhật Bản chứng minh lentinan loại polysaccarit – công thức nguyên (C 6H5O)n loại tinh bột khác, có trọng lượng phân tử 5x1015 Ngồi cịn có maunose peptit KS –Z với trọng lượng phân tử khoảng 6-9,5x104, glycoprotein (hiệu chống HIV mạnh so với thuốc AZT), chất eritadenine (làm giảm colestêrin máu) [12] Sử dụng nấm Hương hệ sợi nấm Hương để phịng chữa bệnh: Hoạt tính chống ung thư: Lentinan nấm Hương chấp nhận liệu pháp phụ trợ tiến trình dùng hóa trị liệu Nó có khả _ Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Trang, K12 kích thích tết bào hệ miễn dịch làm tăng sức đề kháng Nó kích thích tế bào “sát thủ tự nhiên” thể để chúng công tế bào ung thư Nó cịn có tác dụng chống virus viêm gan B Các thử nghiệm cho thấy, chất lentinan đơn độc khơng có tác dụng HIV, kết hợp với AZT tác dụng diệt virus tăng lên 24 lần so với dùng AZT đơn độc Lentinan cịn có khả giúp người bị lao phổi chống lại độc tố vi khuẩn lao Đặc biệt bệnh nhân trị liệu lentinan tăng thời gian sống sót cho bệnh nhân Hoạt tính kháng sinh: Chihara [16] chứng minh khả Lentinan kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm bệnh ký sinh trùng Đặc biệt, Lentinan làm giảm mạnh suy sụp trị liệu hóa chất cho chuột gây lao phổi thực nghiệp, chống lại xâm nhiễm virus viêm não, virus Abelson, Schistosoma mansoni Schistosoma japonicum, chống bội nhiễm khuẩn bệnh nhân AIDS Do Lentinan có khả làm tăng đề kháng vật chủ khỏi công virus ung thư virus lạ Hoạt động ngoại trừ chlosterol: Nấm Hương làm giảm chlosterol máu có chứa chất Eritidenin Chất Eritidenin (Lentysin, Lentinacin) Mizuno xác định thể nấm Hương nuôi trồng [17, 18] Chất sau lại Lelik CS xác định sinh khối sợi lên men công nghiệp chứng minh có khả làm giảm mức cholesrol lipid trung tính máu [19] Chính nấm Hương có hiệu tim mạch Bởi hầu hết bệnh nhân mắc bệnh tim mạch hàm lượng chlosterol máu cao Hoạt tính chống virus, vi khuẩn ký sinh: Lentinan dẫn xuất có tác dụng chống lại vi khuẩn, virus (kể virus AIDS) nhiễm ký sinh trùng Trong nghiên cứu in vitro cho thấy Lentinan sử dụng với hợp chất AZT (azido-Thymidine) ngăn chặn virus làm giảm miễn dịch người (virus HIV) tế bào T sử dụng AZT đơn độc [20] _ Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Thu Trang, K12 2.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ nấm Hương 2.3.1 Tình hình ngồi nước Đầu kỷ 20 nấm Hương nuôi trồng nhân tạo quy mô công nghiệp Nhật, Pháp, Mỹ Nấm Hương trồng theo phương pháp đơn giản quy mô lớn nhiều tỉnh Trung Quốc (Phúc Kiến, Chiết Giang, Giang Tô, Giang Tây…) Năm 1994 tỉnh Phúc Kiến trồng 190.000 nấm Hương, có 15.000 xuất Năm 1993 tỉnh Chiết Giang sản xuất 185.000 tấn, có 8.500 xuất [3] Gần Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên nước trồng nhiều nấm Hương giới Tổng sản lượng hàng năm đạt triệu Sản phẩm nấm sử dụng chủ yếu dạng tươi sấy khô Các nước phát triển sản xuất sinh khối sợi nấm Hương cung cấp cho thị trường nước số sản phẩm dạng bột dạng lỏng có giá trị dinh dưỡng phòng trị bệnh Chế phẩm LEM (Lentinula edodes Mycelium) chiết xuất từ hệ sợi nấm Hương lên men giá thể bã mía coi thành cơng lớn Nhật Bản Trung Quốc Khắp giới, Châu Á thích nấm Hương Nó có giá thành cao chủ yếu có giá trị cao dinh dưỡng “thực phẩm chức năng”, mặt khó ươm trồng, thời gian phát triển dài, suất thấp Một số nghiên cứu ngồi nước sử dụng chất thải nơng nghiệp công nghiệp chế biến để cung cấp nguồn cacbon cho nuôi cấy rắn lỏng [9] Trong siêu thị Nhật Bản có bán bột sợi nấm Hương thu từ sinh khối sợi nấm Sử dụng bột sợi nấm loại bột canh sử dụng hàng ngày Từ nhu cầu dinh dưỡng tác dụng phòng chữa bệnh nấm Hương hệ sợi nấm Hương nước giới khơng ngừng nghiên cứu gần việc nghiên cứu thu sinh khối sợi nấm _ Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội 10 ... đề tài ? ?Nghiên cứu phát triển hệ sợi nấm Hương (Lentinula edodes) mơi trường ni cấy lỏng? ?? 1.2 Mục đích Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Thu sinh khối sợi nấm Hương qua q trình ni cấy mơi trường lỏng 1.2.2... thực nuôi cấy chủng nấm Hương môi trường rắn lỏng quy mơ phịng thí nghiệm (đúng thao tác, khử trùng, tiệt trùng cách) - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phát triển hệ sợi nấm Hương môi trường nuôi cấy. .. xúc tiến phát triển hệ sợi nấm Hương [1] Các môi trường nuôi cấy để nuôi hệ sợi phải có đầy đủ nguồn cácbon, nitơ, chất khoáng… đáp ứng cho nhu cầu phát triển hệ sợi nấm Hương
