TRƯỜNG KHOA……………………. Đề tài Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase, invertase, protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao 1 Mục lục MỞ ĐẦU 3 Đặt vấn đề 3 Chương 2 5 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 Giới thiệu chung về ca cao 5 Sơ lược về cây ca cao 5 CHƯƠNG 3 21 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 Chương 4 32 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao 32 Chương 5 70 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 2 Chương 1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Xã hội càng phát triển thì nhu cầu của con người ngày càng tăng. Các sản phẩm cao cấp cũng ngày càng được sử dụng nhiều hơn, trong đó các sản phẩm từ ca cao ngày càng phổ biến hơn. Từ ca cao, người ta có thể chế biến ra rất nhiều loại sản phẩm như: bánh, kẹo nhân chocolate; nước uống hương vị chocolate…Không những thế, cacao khô và một số thành phần chocolate chứa rất nhiều nhóm chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng trong việc duy trì hệ thống tim mạch hoạt động tốt, ngăn ngừa bệnh tim…(Theo Phạm Hồng Đức Phước, 2009). Tuy nhiên, để tạo ra được những sản phẩm từ ca cao chất lượng cao thì cần quan tâm đến nhiều vấn đề trong đó cần chú trọng đến quá trình lên men ca cao. Quá trình lên men có vai trò rất quan trọng nhằm tạo ra các hợp chất hóa học tạo nên hương vị đặc trưng cho sản phẩm chocolate. Trong quá trình lên men có sự tham gia hoạt động của các enzyme làm tăng hiệu quả các phản ứng tạo được nhiều tiền chất đặc trưng cho chocolate, làm tăng chất lượng sản phẩm. Các enzyme quan trọng trong quá trình lên men của ca cao như pectinase, protease, invertase,… Do đó, muốn xác định thời điểm thích hợp bổ sung enzyme để quá trình lên men được tối ưu tôi thực hiện đề tài “Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase, invertase, protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao”. 3 1.1. Mục đích đề tài - Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới khả năng hoạt hóa của enzyme pectinase, invertase, protease (giới hạn là sử dụng chế phẩm enzyme của hãng Novozym). - Xác định được thời điểm bổ sung enzyme vào để hiệu quả lên men đạt cao nhất. 4 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu chung về ca cao Sơ lược về cây ca cao Cây ca cao có tên khoa học là Theobroma cacao L., thuộc họ Sterculiaceae, là loài duy nhất trong số 22 loài của chi Theobroma được trồng sản xuất. Ca cao có nguồn gốc từ lưu vực sông Amazon nằm ở Nam, Trung Mỹ và cũng đã được trồng rộng rãi ở đây từ hơn 500 năm trước. Sinh thái tự nhiên của cây ca cao là ở tầng thấp trong những cánh rừng mưa nhiệt đới; nơi có cường độ ánh sáng thấp, ẩm độ không khí cao, biên độ nhiệt giữa ngày và đêm cũng như giữa các tháng trong năm đều hẹp (Theo Phạm Hồng Đức Phước, 2009). Hiện nay, ca cao được chia làm 3 nhóm chính, bao gồm: Criollo, Forastero và Trinitario. 2.1.1. Thành phần hóa học của quả và hạt ca cao Nước, chất béo (bơ ca cao), carbohydrates, nitrogen, acid hữu cơ, mối khoáng,…Các thành phần này sẽ có hàm lượng khác nhau ở chất nhầy, vỏ hạt và thịt hạt. - Chất nhầy (thịt quả) có hàm lượng nước và đường cao nhất, ngoài ra còn có acid citric làm cho pH của thịt quả luôn ở 3,5. - Vỏ hạt có hàm lượng carbohydrates cao - Thịt hạt có hàm lượng bơ ca cao rất cao, vỏ hạt có một ít và chất nhầy không có. 5 Hình 2.1 : Thịt quả ca cao Bảng 2.1 Các thành phần của hạt ca cao tươi, tính theo % trọng lượng tươi Thành phần Chất nhầy Vỏ hạt Phôi nhũ Nước Chất béo (Bơ Ca cao) Carbohydrate Cellulose Tinh bột Pentosans Sucrose Glucose + Fructose Nitrogen Protein Theobromine Enzyme Polyphenols 84,5 _ _ _ 2,7 0,7 10,0 0,6 _ _ _ 9,4 3,8 13,8 46,0 _ _ _ 18,0 _ _ 0,8 35,0 31,3 3,2 4,5 4,9 _ 1,1 8,4 2,4 0,8 5,2 6 Acid hữu cơ Citric & acetic, oxalic Muối khoáng Tổng số 0,7 0,8 100,0 _ 8,2 100,0 0,6 2,6 100,0 (Nguồn: F. Hardy. Trích từ Phạm Chí Thông, 1999) Theo Dr. Emile Cros, 1999 thì trong lớp cơm nhầy chứa khoảng 82% – 87% là nước, 10% – 15 % đường, acid citric 1% – 3 %, protein 0,6%, pH ban đầu của lớp cơm nhầy vào khoảng 3,6. Các thành phần này là cơ chất thích hợp cho hoạt động của các enzyme protease, invertase và pectinase. Với các thành phần trên thì việc ứng dụng các enzyme (pectinase, protease, invertase) phù hợp với cơ chất có trong thành phần của lớp thịt quả (lớp cơm nhầy) là hướng đi chính của đề tài. 2.1.2. Sơ chế hạt ca cao  Thu hoạch quả cacao Trong thu hoạch cần phải hái trái chín, vì nếu chưa chín hạt trong trái khó bóc ra, khó ủ, tỉ lệ hạt tím và xám cao, năng xuất cacao thô giảm nhiều. Nhưng trái chín lâu trên cây thì trái dễ bị sâu bệnh, côn trùng phá hoại và bản thân trái cacao bị chín rục, thối rữa và hạt trong trái sẽ nảy mầm (Theo Phạm Trí Thông, năm 1999). Quả sau khi thu hoạch được trữ khoảng 1 tuần như vậy sẽ đem lại hiệu quả lên men cao hơn (Sưu tầm và biên dịch Cao Xuân Lộc, năm 2007). Hình 2.2: Quy trình sơ chế ca cao 7 Thu hoạch Trữ trái Đập vỏ, lấy hạt Lên men Bảo quản Phơi, sấy cacao Hình 2.3: Trữ trái ca cao trong lồng làm bằng tre Hình 2.4: Trữ trái ca cao trên nền nhà  Lên men Theo Phạm Trí Thông, năm 1999 có 4 phương pháp ủ hạt cacao.  Ủ thành đống:  Ủ thùng  Ủ thúng/ cần xé  Ủ trên khay. Hình 2.5: Ủ thúng Hình 2.6: Ủ thùng • Mục đích của quá trình lên men Ca cao sau khi thu hoạch cần thiết phải lên men. Trong quá trình lên men các tiền chất để tạo hương chocolate được hình thành. Do đó ca cao chất lượng chỉ đạt được sau 8 khi lên men đúng kỹ thuật. Lên men cũng làm giảm vị đắng và chát và hình thành màu nâu đặc trưng của chocolate (khuyennongvn.gov.vn). • Yêu cầu của quá trình lên men Nhiệt độ trong quá trình lên men cần phải đạt từ 45 – 50 0 C để tiêu diệt sức sống của hạt (tránh hạt nảy mầm), nhiệt độ này sẽ thuận lợi cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào xảy ra nhanh hơn. Thời gian lên men từ 5 – 7 ngày đối với gống Forastero, Trinitario tùy điều kiện thời tiết của từng vùng. Nếu lên men ngắn quá thì quá trình sinh hóa chưa xảy ra hoàn thiện, nếu lên men quá dài thì sự phân hủy đối với một số chất hữu cơ trong hạt xảy ra mãnh liệt và tạo ra các sản phẩm gây mùi khó chịu như: phân hủy protein thành NH 3 , ôxy hóa các acid béo không no thành các aldehyt có mùi át mùi đặc trưng của ca cao, các phản ứng tạo ester với các mùi không mong muốn…(Theo Bernard W.Minific, C. C., F.R.I.C, năm 1980) Mức độ thông khí thích hợp: thông thường quá trình lên men yếm khí xảy ra đối với hạt cacao bình thường (không được lưu quả) là 32 – 48 giờ, và đối với hạt đã làm giảm hàm lượng nước (lưu quả 9 ngày) thì sau 24 – 32 giờ và tiếp theo sau đó là quá trình lên men hiếu khí (là giai đoạn cần không khí) tạo acid acetic. Như vậy, thời gian đảo cần thiết đối với hạt bình thường (không được lưu quả) là 2 ngày 1 lần đối với hạt từ quả được lưu 9 ngày là một ngày sau 48 giờ. (Theo Smilja, L., 2007) Loại thùng ủ: Thùng ủ phải đảm bảo không có mùi vị lạ (mùi cao su, mùi xốp, , …), không bị acid ăn mòn, chất liệu thùng ủ không bị tác động bởi acid và cồn. Thùng ủ còn phải có tác dụng dễ thoát dịch nhớt, giữ được nhiệt độ. Khối lượng và độ cao khối hạt: Khối lượng hạt để đạt được kết quả lên men tốt là từ 50 kg hạt tươi trở lên, độ cao khối hạt trong ủ lên men ở khối lượng vừa và nhỏ là không quá 40 cm. Với khối lượng và độ vao này thì quá trình sinh hóa trong hạt sẽ xảy ra 9 một cách triệt để và theo xu hướng tốt (Theo Sterling S. Thompson, K. B. M., Alex S.lopez, năm 2001) • Cơ chế của quá trình lên men - Sự lên men của lớp cơm nhầy ca cao Lớp cơm nhầy chứa một trữ lượng đường cao (khoảng 15 % - 20 %) và do sự có mặt của acid citric tạo nên độ pH của lớp cơm nhầy ban đầu là 3,5 là môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm men. - Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, các nấm men như: Candida, Debaryomyces, Hansenula, Saccharomyces… đã phát triển và chuyển hóa đường trong chất cơm nhầy thành rượu ethylic và CO 2 theo phản ứng: (Theo Phạm Trí Thông, 1999) C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 Sự chuyển hóa này xảy ra trong điều kiện khị khí, điều kiện này cho phép sự phát triển của các vi khuẩn acid lactic _ Lactobacillus, chủ yếu là L.Plantarum, L.Collinoides và L.Fermentum, cùng với sự sản sinh ra acid lactic. Các vi khuẩn này cũng tham gia vào quá trình phân hủy các chất đường. Khi chất nhầy bị tan vỡ và dịch ca cao chảy ra làm môi trường ủ thông thoáng, độ acid giảm, pH đạt khoảng 5 vào cuối giai đoạn lên men do sự mất đi của acid citric. Lúc này phản ứng oxy hóa cồn thành acid acetic diễn ra mạnh do sự xâm nhập của không khí vào khối ủ tạo điều kiện cho vi khuẩn Acetobacter spp. và Gluconobacter khi chất nhầy bị hủy hoại. Các vi khuẩn này hoạt động mạnh làm nhiệt độ khối ủ tăng lên. Nhệt độ tăng đều trong 48 giờ đầu đạt 42 – 48 0 C, sau khi được đảo trộn nhiệt độ tăng đến 50 0 C, sau đó giảm xuống. Sau 6 ngày ủ nhiệt độ đạt cỡ 48 0 C. Khi ủ một khối lượng lớn, nhiệt độ trong lòng khối ủ tăng chậm hơn và tỉ số hạt còn sống ở giữa khối còn cao, trong lúc đó ở lớp trên thì coi như không còn nữa. Vì vậy trong quá trình ủ cần phải đảo trộn để làm cho khối ủ được thông khí giúp cho các hạt lên men đều đặn. Ngoài ra còn giúp cho nấm mốc không nảy nở trên bề mặt và hạt không bị quá khô. 10 [...]... cứu: để xác định điều kiện nhiệt độ và pH để hoạt hóa enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao ta sử dụng ph ơng ph p đo độ nhớt Theo dõi sự thay đổi độ nhớt của dịch cơm nhầy ca cao trong 60 ph t Sau 5 ph t đo độ nhớt của dịch cơm nhầy một lần 25 Sử dụng máy Viscotester VF03 để đo độ nhớt của dịch cơm nhầy - Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: Quả ca cao sau khi thu hoạch từ vườn thực nghiệm của. .. sung enzyme) Mỗi mẫu thí nghiệm cần 50 ml dịch cơm nhầy của hạt ca cao Tỉ lệ enzyme sử dụng (20 ppm) so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó đối với mỗi mẫu thí nghiệm cần 1 µml enzyme 3.4 Chỉ tiêu và ph ơng ph p xác định 3.4.1 Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao Chỉ tiêu khảo sát: độ nhớt của dịch cơm nhầy Ph ơng ph p... ph m enzyme pectinex ultra SP-L, cũng như các enzyme khác mức độ hoạt hóa của enzyme này ph thuộc vào nhiệt độ và pH Ở các nhiệt độ và pH khác nhau thì hoạt động của enzyme sẽ làm mức độ giảm của độ nhớt dịch cơm nhầy của hạt ca cao khác nhau Ở nhiệt độ và pH nào mà mức độ giảm của độ nhớt cao nhất thì đó là điều kiện tối thích của enzyme 32 Dựa vào kết quả lên men thực nghiệm tại Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp. .. thí nghiệm ph i thường xuyên kiểm tra nhiệt độ của dịch mẫu để có biện ph p điều chỉnh nhiệt độ khi nhiệt độ cao quá hoặc thấp dưới nhệt độ khảo sát 28 3.4.3 Nội dung 3: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme invertase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao Chỉ tiêu theo dõi: Sự thay đổi hàm lượng dường khử sinh ra thông qua giá trị OD đo được bằng máy đo quang ph Ph ơng ph p nghiên... sung enzyme) Mỗi mẫu thí nghiệm cần 650 ml dịch cơm nhầy của hạt ca cao Tỉ lệ enzyme sử dụng (30 ppm) so với thể tích dịch mẫu thí nghiệm, do đó đối với mỗi mẫu thí nghiệm cần 19,5 µml enzyme 3.3.2 Nội dung 2: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao Trong nội dung 2 ta cũng có 2 thí nghiệm: 3.3.2.1 Thí nghiệm 3: Xác định điều kiện pH Thí... ph i thường xuyên kiểm tra nhiệt độ của dịch mẫu để có biện ph p điều chỉnh nhiệt độ khi nhiệt độ cao quá hoặc thấp dưới nhệt độ khảo sát Để điều chỉnh nhiệt độ và pH của mẫu thí nghiệm ta làm như sau: Điều chỉnh pH: sử dụng acid citric 0,1 N (nếu pH của dịch nhớt lớn hơn pH cần khảo sát) hoặc NaOH 0,1 N (nếu pH của dịch nhớt nhỏ hơn pH cần khảo sát) Điều chỉnh nhiệt độ: dùng tủ sấy để nâng nhiệt độ. .. nhiệt độ của dịch nhớt đến nhiệt độ khảo sát rồi dùng tủ định ôn để ổn định nhiệt độ của dịch nhớt trong suốt thời gian thí nghiệm 3.4.2 Nội dung 2: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme flavourzyme trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao Chỉ tiêu khảo sát: sự thay đổi hàm lượng amino acid thông qua giá trị OD đo được bằng máy đo quang ph 26 - Ph ơng ph p nghiên cứu: xác định hàm... khan cho vào bình định mức đến 200 ml 3.6 Ph ơng ph p xử lý số liệu Các biểu đồ được vẽ bằng ph n mềm Microsoft Excel 2007, kết quả được xử lý bằng ph n mềm xử lý thống kê Minitab 2002 31 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nội dung 1: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao Trong quá trình lên men, sự biến đổi của độ nhớt của lớp cơm nhầy giảm... Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme invertase trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao: 3.3.3.1 Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện pH Thí nghiệm được bố trí đầy đủ 1 yếu tố, 4 mức pH (3,5; 4,5; 5,5; 6,5), 2 lần lặp lại Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm 5 24 Công 3.3.3.2 pH Tỉ lệ enzyme Thể tích dịch thức sử dụng cơm nhầy CT1 3,5 CT2 4,5 20 ppm 50 ml CT3 5,5 CT4 6,5 Thí nghiệm 2: Xác định điều. .. từ 3 – 6, pH tối ưu là 4,7 – 5,2 Bảo quản ở 0 – 10 0C (32 0F – 50 0F), nhiệt độ hoạt động là 10 0C (50 0F) – 57 0C (135 0 F), nhiệt độ tối thích là 40 – 45 0C (Theo Lê Mỹ Hồng, 2005) 3.2.2 Nội dung 2: Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao Nội dung 2: Sử dụng chế ph m enzyme flavourzyme TM 500L (Novozyme) 21 Chế ph m enzyme protease flavourzyme . KHOA……………………. Đề tài Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase, invertase, protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao 1 Mục lục MỞ. thực hiện đề tài “Xác định điều kiện pH và nhiệt độ để hoạt hóa enzyme pectinase, invertase, protease trên cơ chất dịch cơm nhầy của hạt ca cao”. 3 1.1.