LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên” ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM    BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM    BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. VI THỊ ĐOAN CHÍNH THÁI NGUYÊN - 2008 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS. Vi Thị Đoan Chính đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Phú Hùng và các cán bộ của bộ môn Sinh học thuộc Khoa KHTN & XH - ĐHTN đã nhiệt tình giúp đỡ tôi. Xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Ngô Đình Quang Bính và các cán bộ phòng Di truyền vi sinh học - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Y - Dƣợc Thái Nguyên, Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau Đại học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - ĐHTN đã tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa KHCB, Bộ môn Hóa - sinh đã tạo mọi điều kiện cho tôi đƣợc học tập và hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những ngƣời thân yêu của tôi. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008 Tác giả Bùi Thị Hà MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Những chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 3 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 5 1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn 6 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI 8 1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 8 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 9 1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 10 1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy) 10 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11 1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 12 1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh 12 1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 15 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 16 1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 18 1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm 18 1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật 21 Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất 24 2.1.1. Nguyên liệu 24 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè 27 2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 28 2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 28 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh 28 2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 29 2.2.3. Bảo quản giống 29 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 30 2.2.4.1. Đặc điểm hình thái 30 2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy 31 2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 31 2.2.5. Lên men tạo kháng sinh 32 2.2.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 32 2.2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon 33 2.2.5.3. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ 33 2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA 33 2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB 33 2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 34 2.2.6.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 35 2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu 36 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè 37 3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 38 3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn 38 3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao 41 3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2 42 3.3.1. Đặc điểm hình thái 42 3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy 43 3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 45 * Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon 45 * Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp 46 * Khả năng chịu muối 46 * Khả năng sinh enzym ngoại bào 47 3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 48 3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 50 3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn 52 3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 52 3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon 54 3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ 56 3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử 57 3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn 57 3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 58 Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận 60 4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo 61 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN XK : Xạ khuẩn VSV : Vi sinh vật CKS : Chất kháng sinh HSCC : Hệ sợi cơ chất HSKS : Hệ sợi khí sinh KTKS : Khuẩn ty khí sinh HTKS : Hoạt tính kháng sinh HTKN : Hoạt tính kháng nấm MT : Môi trƣờng KHVQH : Kính hiển vi quang học KHVĐT : Kính hiển vi điện tử DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid ISP : International Streptomyces Project TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid SDS : Sodiumdodecyl sulfat TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm 37 Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39 Bảng 3. 3.Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè 40 Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn 41 Bảng 3.5. Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1 44 Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 45 Bảng 3.7. Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp của 2 chủng R2 và Đ1 46 Bảng 3.8. Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1 47 Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm kiểm định 48 Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis 50 Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu.52 Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng lên men khác nhau 53 Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1 55 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1 56 [...]... thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên” Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -22 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có... hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng 3 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài * Đối tượng nghiên cứu - Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Thái Nguyên - Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên * Nội dung nghiên cứu 1 Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV kiểm định 2 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có... chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của Thái Nguyên Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi. .. sinh mạnh Trên các giống chè lá nhỏ (như Đại bạch trà, Gruzia) bệnh cũng phát sinh mạnh 1.4.1.4 Bệnh đốm xám Bệnh đốm xám là bệnh phổ biến ở các vùng trồng chè Bệnh phát sinh vào mùa mưa, nhiệt độ 27 300C Bệnh nặng làm lá chè khô rụng, cây chè còi cọc Tác nhân gây bệnh là do nấm Pestalossia theae Sawada [1],[4] Vết bệnh trên lá có màu nâu sẫm, lúc đầu chỉ có chấm nhỏ màu đen sau đó lan ra khắp lá Bệnh. .. hơn ở nương chè hái búp Từ tháng 7 đến tháng 9 thường có mưa kéo dài, bệnh dễ gây hại nặng Nhiệt độ 270C và độ ẩm > 90% là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh Bào tử nấm lan truyền nhờ mưa gió Chè để cành và vườn ươm bón nhiều phân đạm và trên nền thâm canh cao, thường bị bệnh nặng hơn 1.4.2 Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật * Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật Các nhà bệnh học thực vật trên. .. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -14Năm 1999 một kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Đó là kháng sinh loposomal HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL - 312 Năm 2003, nhiều nước trên thế... năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6] Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã... đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [48],[49] 1.3 CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 1.3.1 Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -13Theo định nghĩa của Outchinnikov [48] Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các sản... gây bệnh Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp Trong đó cây chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất. .. cofactor Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -161.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 1.3.3.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy * Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp CKS của xạ khuẩn Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 - 300C, nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ . LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên”. đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu