Đang tải... (xem toàn văn)
Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao băng kỹ thuật Microsatellite 3
35 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 3.1.Vật liệu 3.1.1.Các giống cacao thí nghiệm Các dịng cacao thí nghiệm bao gồm: • 13 dịng cacao thương mại (được liệt kê bảng 3.1) trồng vườn sưu tập giống cacao, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh • dịng cacao CT bao gồm: CT1, CT3, CT4, CT5, CT6, CT7, CT8 CT9 trồng vườn giống cacao tỉnh Cần Thơ Ngồi cịn có ba giống cacao: trồng vườn sưu tập giống cacao, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, chọn để so sánh kết phân tích với Ngân hàng cacao giới Cách thức lấy mẫu sau: • Giống gần phịng thí nghiệm (13 dòng cacao thương mại giống AMAZ15/15, NA33 PA107): lấy mẫu vườn đem phịng thí nghiệm để ly trích DNA Vì chúng tơi quan sát thấy cacao lưu trữ lâu 24 giờ, cho dù tủ -20oC, xuất nhiều đốm nâu bề mặt làm ảnh hưởng đến chất lượng DNA ly trích • Giống xa phịng thí nghiệm (8 dịng cacao CT): mẫu sau lấy giữ lạnh chuyển đến phịng thí nghiệm vịng 24 để ly trích DNA Trên cây, chúng tơi chọn tươi, có màu xanh thẫm khơng q già, khơng chọn non chúng chứa nhiều nhựa khó li trích, ngồi phải khơng có dấu hiệu bị sâu bệnh hay trùng công Các mẫu trữ tủ -20oC tiến hành ly trích Những chọn để lấy mẫu (mỗi giống chọn cây) cột dây nylon màu để đánh dấu 36 Bảng 3.1: Các dòng cacao thương mại khảo sát Sồ thứ tự Tên thương mại TD1 Tên dòng Nguồn gốc BAL209 Malaysia TD2 BAL244 Malaysia TD3 BR25 Malaysia TD5 KKM Malaysia TD6 225 Malaysia TD7 PBC123 Malaysia TD8 PBC154 Malaysia TD9 PBC157 Malaysia TD10 PBC159 Malaysia 10 TD11 PBC230 Malaysia 11 TD12 PBC236 Malaysia 12 TD13 QH1213 Malaysia 13 TD14 QH22 Malaysia QH441 37 Hình 3.1: Lấy mẫu cacao vườn Hình 3.2: Đánh dấu chọn 3.1.2.Hóa chất thí nghiệm 3.1.2.1.Primer Tổng hợp kết nghiên cứu 15 cặp primer microsatellite để kiểm tra tính đồng di truyền cacao tổ chức USDA Đại Học Pennsylvania State, Mỹ, thực (xem phần 2.6.1 2.6.2), chọn cặp primer để phát trình tự microsatellite nằm nhiễm sắc thể (NST) khác genome cacao (Ingenic Newsletter No.9, 2004) Năm cặp primer cho đoạn khuếch đại có tính đa hình cao giống cacao (xem bảng 2.1) cho kết phân biệt rõ dịng cacao khảo sát Các primer có chiều dài từ 18-20bp, primer forward primer đánh dấu màu huỳnh quang đầu 5’, công ty Applied-Biosystem, Mỹ, tổng hợp Bảng 3.2: Các primer microsatellite dùng thí nghiệm Tên Màu Trình tự microsatellite Vị Ta hùynh trí (oC) quang Trình tự khuếch đại 38 NST mTcCIR7 Xanh 5’-6FAMATGCGAATGACAACTGGT-3’ dương Xanh mTcCIR8 46 (GA)11 51 GCTTTCAGTCCTTTGCTT 5’-VICCTAGTTTCCCATTTACCA-3’ (TC)5 TT(TC)17TTT(CT)4 TCCTCAGCATTTTCTTTC (TC)13 Vàng mTcCIR11 5’-NEDTTTGGTGATTATTAGCAG-3’ 46 GATTCGATTTGATGTGAG Đỏ mTcCIR15 5’-PETCAGCCGCCTCTTGTTAG-3’ (TC)19 46 TATTTGGGATTCTTGATG Xanh mTcCIR18 5’-6FAMGATAGCTAAGGGGATTGAGGA-3’ dương (GA)12 51 GGTAATTCAATCATTTGAGGATA 3.1.2.2.Các hóa chất dùng ly trích DNA • Dịch trích DNA (extraction buffer EB), 100mL EB bao gồm of 2g CTAB, 28mL 5M NaCl, 20mL 0.5M Tris-HCl, 4mL 0.5M EDTA, 1mL Mercapto ethanol, nước cất lần khử ion hấp khử trùng • TE buffer, bao gồm 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1mM EDTA (pH 8.0) • CIA, bao gồm 24V chloroform: 1V isoamylalcohol • Isopropanol • Sodium acetate • Ethanol 70% and 96% • RNase • Low-salt TE (10 mM Tris-HCl , 1mM EDTA [pH 8.0]) 3.1.2.3.Các hóa chất dùng phản ứng PCR • 10X PCR buffer (do công ty BioRad cung cấp) • 25mM MgCl2 (do công ty BioRad cung cấp) • 10mM dNTP’s (do cơng ty Applied-Biosystem-Mỹ cung cấp) • Taq DNA polymerase (do cơng ty BioRad cung cấp) 39 • Primer (do cơng ty Applied-Biosystem-Mỹ cung cấp) • DNA mẫu (ly trích từ cacao) • H2O cất lần, siêu lọc, hấp khử trùng 3.1.2.4.Các hóa chất dùng phân tích trình tự • Sản phẩm PCR • Chất làm biến tính DNA: Hidi Formamide • Chất chuẩn để xác định kích thước peak (size standard) • Polymer pop 6-ABI • Buffer 3.1.3.Trang thiết bị thí nghiệm • Chén sứ chày giã (Đức) • Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml (Mỹ) • Cân phân tích số (Ohaus - Mỹ) • Máy hút tủ cấy vơ trùng (Anh Quốc) • Pipet loại (Nichiryo –Nhật) • Đầu típ loại (Đức) • Máy ly tâm lạnh (Hettich –Đức) • Máy luân nhiệt (Biorad –Thụy Điển) • Máy điện di (Cosmo Bio Co –Nhật) • Máy chụp ảnh DNA (Biorad –Mỹ) • Lị Viba (Electrolux –Thụy Điển) • Máy định ơn (Memmert –Đức) • Tủ lạnh loại (Sanyo –Nhật) • Máy giải trình tự ABI 3100 (Applied Biosystem-Mỹ) • Mao quản 36cm (Applied Biosystem-Mỹ) 40 3.2.Phương pháp 3.2.1.Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu đề tài DNA ly trích từ 21 dòng cacao khảo sát Từ DNA tổng số thu được, tiếp tục nghiên cứu al có chứa trình tự microsatellite đặc trưng cho dịng 3.2.2.Bố trí thí nghiệm Đề tài thực Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Thời gian từ tháng 3/20005 đến tháng 8/2005 gồm giai đoạn sau: • Giai đoạn 1: Xây dựng phương pháp nhận diện 21 dòng cacao dựa cặp primer microsatellite mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 mTcCIR18 Phương pháp nhận diện gồm bước: 1- Lấy mẫu 21 dịng cacao 2- Tiến hành li trích DNA 3- Thực phản ứng PCR với primer 4- Phân tích sản phẩm PCR thu máy giải trình tự DNA Dùng phần mềm Gene Mapper để đọc kết phân tích đoạn microsatellite dịng Ghi nhận liệu microsatellite 21 dòng cacao với primer • Giai đoạn 2: Kiểm tra độ xác tính ổn định phương pháp nhận diện.qua bước: Thu nhận mẫu 13 dòng cacao thương mại từ vườn giống cacao Đại Học Nơng Lâm, 13 dịng người lấy mẫu mã hoá tên giống dạng: A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14 (các mã số giữ kín thu kết cụ thể) Tiến hành bước phân tích giai đoạn 41 để thu nhận liệu Microsatellite 13 dịng mã hố Nhận diện giống mã hóa cách dùng phần mềm Cervus để kiểm tra mức độ đồng Chọn vườn giống cacao Đại Học Nông Lâm số giống cacao truyền thống có liệu Microsatellite lưu trữ ngân hàng cacao giới ICGD Tiến hành phân tích giống truyền thống so sánh liệu Microsatellite chúng với liệu tương ứng ngân hàng liệu cacao giới ICGD • Giai đoạn 3: Tối ưu hóa phương pháp Thực phản ứng multiuplex PCR với cặp primer có nhiệt độ bắt cặp 46oC đánh dấu màu huỳnh quang khác nhau: mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 Chúng chọn thử nghiệm với số mẫu có liệu microsatellite giống cặp primer • Giai đoạn 4: Phân tích tính đa dạng di truyền 21 dịng cacao phần mềm Genetix dựa liệu microsatellite với cặp primer 3.2.3.Kỹ thuật ly trích DNA DNA cacao ly trích theo qui trình luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Liễu, 2004, có thay đổi tốc độ thời gian ly tâm cho phù hợp với điều kiện máy li tâm phịng thí nghiệm với tốc độ tối đa cho phép 12000 vòng/phút 1- Cân 0.2g rửa Cho 1.2ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền với dung dịch Vortex kỹ Ủ 65oC 45 phút 2- Thêm 500µl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), vortex 10 phút, li tâm phút 12000 vòng 4oC 3- Chuyển lấy dịch trong, lặp lại bước 4- Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 0.5 µl RNase, ủ 370C 5- Thêm vào 250µl Isopropanol lạnh Để tủa -200C khoảng 30 phút (nên để qua đêm) 6- Li tâm phút 12000 vòng 4oC Đổ bỏ dịch 7- Cho vào 300µl TE 1X, ủ 370C 42 8- Thêm 20µl muối Sodium acetate 3M 640µl Ethanol 96%, trộn để -200C 30 phút 9- Ly tâm 12 phút 12000 vòng 4oC, đổ bỏ dịch 10- Rửa cặn với 400µl Ethanol 70% cách ly tâm phút 12000 vòng oC, đổ bò dịch 11- Lặp lại bước 10, để khơ cặn, hịa tan cặn 200µl TE 1X, ủ 37 0C 45 phút 12- Bảo quản mẫu 4oC Hình 3.3: Giai đoạn nghiền mẫu Hình 3.4: DNA tiếp tục tinh 3.2.4.Kiểm tra định lượng định tính DNA 3.2.4.1 Định tính DNA phương pháp điện di Để kiểm tra kết li trích có thu DNA hay không, tiến hành điện di mẫu DNA li trích gel agarose 1.4%, nấu agarose lị viba 2.5 phút, 500W Trộn µl sản phẩm li trích với 2µl loading dye (BioRad) Vận hành máy điện di 100V, 250A 20 phút Sau đem nhuộm ethium bromide 20 phút Gel sau nhuộm chụp tia tử ngoại (UV) Nếu mẫu có DNA băng DNA phát sáng dạng vạch gel điện di Độ tập trung độ đậm nhạt băng điện di phản ánh độ tinh nồng độ cao hay thấp mẫu DNA 3.2.4.2 Định lượng DNA quang phổ kế Các mẫu DNA li trích sau định tính kiểm tra độ tinh ước lượng hàm lượng DNA cách đo mật độ quang OD (optical density) với bước sóng 43 260nm 280nm máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần Hàm lượng DNA tính theo cơng thức: DNA (ng/µl) = [(62.9 x OD260nm) – (36 x OD280nm)] x 100 DNA xem tỉ số OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1.7 đến 2.2 3.2.5.Qui trình phản ứng Microsatellite 3.2.5.1.Phản ứng PCR với cặp primer Hiện có nhiều qui trình PCR microsatellite cho cacao, chúng tơi chọn áp dụng qui trình thành phần hóa chất Đại Học Reading (Anh Quốc) phù hợp với trình tự primer tổng hợp Thứ tự pha trộn mẫu phản ứng PCR tuân theo thứ tự liệt kê bảng bên để đảm bảo hiệu phản ứng Sau cho Taq polymerase vào phản ứng PCR bắt đầu xảy ra, phải nhanh chóng cho vào máy PCR để bắt đầu qui trình phản ứng Tổng thể tích cho phản ứng PCR 20µl với thành phần phản ứng sau: Bảng 3.3: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR Thành phần H2O cất hai lần PCR buffer Dung dịch gốc Thể tích sử dụng 5.8µl 10X 2.0µl MgCl2 25mM 1.8µl dNTP 1.5mM 4.0µl Primer mix 1pmol/µl 4.0µl DNA mẫu 50ng/µl 2.0µl 5U/µl 0.4µl Taq polymerase Do primer sử dụng có nhiệt độ bắt cặp khác nhau, chuyên biệt cho loại primer, nên qui trình PCR cần phải điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho primer 44 Bảng 3.4: Qui trình phản ứng PCR Chu kỳ đến 35 36 37 38 Nhiệt độ (oC) 94 94 51 46 72 72 10 Thời gian phút 30 giây 30 giây phút 15 giây phút phút 15 phút 3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với cặp primer Multiplex PCR cần thiết nghiên cứu microsatellite nghiên cứu nhiều al, nhiều locus có kích thước khác lúc Ngày với phát triển chất nhuộm màu huỳnh quang cho phép nghiên cứu lúc al có kích thước gắn màu huỳnh quang khác Để phản ứng multiplex PCR cho kết tốt, tất locus phản ánh đúng, xác primer phải có nhiệt độ bắt cặp gần Dựa thành phần phản ứng PCR với cặp primer, thay thành phần nước thể tích cặp primer Do tổng thể tích cho phản ứng multiplex PCR 22.2µl với thành phần phản ứng sau: Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho phản ứng multiplex PCR Thành phần Dung dịch gốc Thể tích sử dụng PCR buffer 10X 2.0µl MgCl2 25mM 1.8µl dNTP 1.5mM 4.0µl Primer mix 1pmol/µl 4.0µl Primer mix 1pmol/µl 4.0µl Primer mix 1pmol/µl 4.0µl DNA mẫu 50ng/µl 2.0µl 5U/µl 0.4µl Taq polymerase Chúng tơi áp dụng qui trình PCR cho phản ứng multiplex PCR với primer mTcCIR8, mTcCIR11 mTcCIR15có nhiệt độ Ta = 46oC Ba primer 45 đánh dấu màu huỳnh quang khác nhau: primer mTcCIR8 có màu xanh cây, mTcCIR11 có màu vàng mTcCIR15 có màu đỏ Bảng 3.6: Qui trình phản ứng Multiplex PCR Nhiệt độ (oC) 94 94 đến 35 46 72 36 72 37 10 38 3.2.6 Điện di sản phẩm PCR Chu kỳ Thời gian phút 30 giây 30 giây phút 15 giây phút phút 15 phút Đổ gel agarose với nồng độ 1.4%, nấu agarose lò viba 2.5 phút, 500W Trộn µl sản phẩm PCR với 2µl loading dye (BioRad) Vận hành máy điện di 100V, 250A 15 phút Sau đem nhuộm ethium bromide 15 phút Các mẫu khác khuếch primer có băng điện di giống nên phân biệt gel điện di agarose, cần phải tiếp tục phân tích máy giải trình tự DNA 3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự máy giải trình tự DNA Sản phẩm PCR đưa vào phân tích trình tự qua bước chính: • Bước 1: Tiến hành trộn mẫu PCR với size standard hidi formamide Tổng thể tích cho phản ứng máy giải trình tự DNA 10µl với thành phần phản ứng sau: Thành phần Sản phẩm PCR Size standard Thể tích dùng cho phản ứng 0.5µl 0.5µl Hidi formamide 9µl Bước 2: Biến tính mẫu 95oC phút máy PCR để DNA mạch đôi tách thành mạch đơn Sau phải giữ lạnh mẫu đá để mạch đơn không bắt cặp lại với ã Bc 3: Bm 10àl mu vo tng ụ đĩa, sau đưa vào máy giải trình tự DNA lắp đặt sẵn mao quản thích hợp cài đặt chương trình phù 46 hợp phần mềm Gene Mapper, phần mềm phân tích kích thước al chứa trình tự microsatellite Máy tiến hành điện di phân tách sản phẩm PCR bên mao quản Kết phân tích tự động dựa số liệu bin set công ty Master Food cung cấp Bin set tập tin dạng text, chứa đầy đủ thơng tin kích thước độ tin cậy al tương ứng với loại primer, bin set loại primer sau thiết lập phần mềm Gene Mapper phân tích kết tự động liệu al có độ tin cậy cao mẫu với loại primer Do đó, có trường hợp kết phân tích có nhiều al microsatellite bin set cho liệu al đặc trưng (có độ tin cậy cao nhất) Hình 3.5: Đĩa bơm mẫu Hình 3.6: Lắp cappilary vào máy Một số sản phẩm PCR tinh để so sánh hiệu phân tích nghiệm thức: tinh khơng tinh Qui trình tinh gồm bước sau: - Bước 1: Hút 2.5µl EDTA 125mM 60µl Ethanol 100% Đảo nhẹ ống để nhiệt độ phòng 15 phút - Bước 2: Li tâm 12000 vòng 30 phút 4oC - Bước 3: Hút bỏ dịch - Bước 4: Hút 60µl Ethanol 70% cho vào ống Li tâm 12000 vòng 20 phút 4oC - Bước 5: Hút bỏ dịch Làm khô 30 phút - Bước 6: Hoà tan DNA tinh 10µl nước cất tinh khiết Sau làm tiếp tục với ba bước phân tích trình tự 47 3.2.9.Phương pháp phân tính mức độ đồng di truyền phần mềm Cevus Cervus phần mềm phân tích tần số al để kiểm tra đồng di truyền cá thể tìm đời bố mẹ cá thể dựa tiêu lựa chọn Cervus phân tích tần số al dựa liệu kiểu gen codominant- loci Dữ liệu đưa vào phân tích dạng bảng Excel kết phân tích xuất dạng file text Chúng đưa vào liệu di truyền microsatellite 13 dòng cacao thương mại 13 mẫu mã hoá (từ A2 đến A14) với primer mTcCIR15, mTcCIR18 mTcCIR8 để tiến hành phân tích đồng cá thể dựa trùng khớp loci chúng (matching loci), từ chúng tơi định danh mẫu mã hố Chúng tơi tiến hành phân tích kết dựa liệu microsatellite loci loại trừ allele dropping (xem trang 57) Mỗi loci gồm al đồng hợp (VD: al 292- al 292) al dị hợp (VD: al 235- al 244), đặc tính codominant-loci Bảng 3.7: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích phần mềm Cervus CODE BAL209 BAL244 BR25 KKM225 PBC123 PBC154 PBC157 ]PBC159 PBC230 PBC236 QH1213 QH22 QH441 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 15A 15B 252 244 235 235 235 232 235 235 235 235 252 232 232 244 235 232 235 235 252 235 235 252 235 232 235 232 18A 254 246 244 244 244 252 250 244 250 250 254 252 254 244 250 252 244 250 254 244 244 254 250 252 250 254 18B 344 337 331 331 331 342 331 331 331 342 344 342 342 337 331 342 331 342 344 331 331 344 331 342 331 342 8A 346 344 344 346 342 344 346 346 342 344 346 344 344 344 342 344 346 344 346 346 344 346 346 344 342 344 8B 288 292 302 286 288 288 288 290 286 290 288 288 288 292 288 288 286 290 288 290 302 288 288 288 286 288 290 292 305 286 290 305 302 302 288 305 290 302 288 292 290 302 286 305 290 302 305 290 302 305 288 288 48 Chọn tiêu phân tích để tìm cá thể có đồng di truyền công cụ “Identity Check” phần mềm Cervus Dựa tiêu phân tích này, Cervus tiến hành kiểm tra tất cá thể đưa liệu cặp cá thể có đồng mặt di truyền thỏa mãn tiêu đề Có tiêu sau: Số lượng loci phân tích Số lượng loci đồng tối thiểu Số loci sai khác cho phép Chúng dựa kết kiểm tra nhận diện cặp cá thể có đồng di truyền Cevus phân tích để định danh mẫu mã hóa Do việc định danh xác khách quan 3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền phần mềm Genetix Genetix phần mềm tiếng Pháp dùng cho nghiên cứu di truyền quần thể dựa định luật Hardy-Weinberg xử lý phép tốn thống kê Fichier (Weir & Cockerham,1984) thơng qua giá trị thống kê F Giá trị xác định mối quan hệ al cá thể liên quan đến hệ số cận huyết Hệ số đánh giá mối quan hệ khơng ngẫu nhiên al quần thể, đánh giá giao phối thân cận đơn vị quần thể quần thể Từ 21 dòng cacao khảo sát, vào tên giống, chúng tơi có quần thể với liệu microsatellite tương ứng với primer cá thể đưa vào phần mềm Genetix để tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền gần xa quần thể cá thể quần thể dựa biểu đồ 3D (3 chiều) Khoảng cách chiều dài al microsatellite chứa thông tin khoảng cách di truyền quần thể Hai quần thể tách biệt mặt di truyền tần số al khác rõ rệt Những tính tốn khoảng cách di truyền quần thể có giao phối ngẫu nhiên có phân ly trình di truyền giúp cấu trúc quần thể quần thể Bảng 3.8: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích Genetix 49 Biểu đồ 3.1: quần thể với số lượng cá thể Biểu đồ 3.2:5 primer với số lượng al tương ứng tương ứng Bảng 3.9: Kích thước al phân tích với loại primer 50 Bảng 3.10: Số lượng al phân tích quần thể với loại primer ... 18B 34 4 33 7 33 1 33 1 33 1 34 2 33 1 33 1 33 1 34 2 34 4 34 2 34 2 33 7 33 1 34 2 33 1 34 2 34 4 33 1 33 1 34 4 33 1 34 2 33 1 34 2 8A 34 6 34 4 34 4 34 6 34 2 34 4 34 6 34 6 34 2 34 4 34 6 34 4 34 4 34 4 34 2 34 4 34 6 34 4 34 6 34 6 34 4... A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A 13 A14 15A 15B 252 244 235 235 235 232 235 235 235 235 252 232 232 244 235 232 235 235 252 235 235 252 235 232 235 232 18A 254 246 244 244 244 252 250 244... Giai đoạn 1: Xây dựng phương pháp nhận di? ??n 21 dòng cacao dựa cặp primer microsatellite mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 mTcCIR18 Phương pháp nhận di? ??n gồm bước: 1- Lấy mẫu 21 dòng cacao 2- Tiến