Đang tải... (xem toàn văn)
Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao băng kỹ thuật Microsatellite 2
3 Phần Tổng quan tài liệu 2.1.Giới thiệu tổng quan cacao Cây cacao có tên khoa học Theobroma cacao L (2n = 20), thuộc họ Sterculiacea, số 22 loài thứ Theobroma trồng sản xuất Hiện có vùng giới trồng cacao: - Nam Mỹ: Brazil, Ecuador - Tây Phi: Bờ Biển Ngà, Ghana, Cameroon, Nigeria - Đông Nam Á: Indonesia, Malaysia, Việt Nam 2.1.1.Nguồn gốc cacao Cacao loại trồng địa nước nhiệt đới ẩm người Maya trồng Châu Mỹ từ lâu, trước người Châu Âu có mặt Từ “cacao” từ tiếng Maya mà ra, ngày nay, khắp nơi dùng từ Cacao xuất lần danh mục từ thực vật từ năm 1605 2.1.2.Đặc điểm hình thái Hình 2.1: Theobroma cacao Rễ: rễ cacao có dạng trụ, dài khoảng 1.5-2 m Trên suốt chiều dài rễ trụ có nhiều rễ ngang phân nhánh nhiều rễ tập trung chủ yếu cổ rễ khoảng 20 cm Thân: Cacao loài thân gỗ nhỏ, cao từ 10-20 m mọc tự nhiên Trong điều kiện sản xuất, chiều cao trung bình cacao khoảng 5-7 m, đường kính khoảng 10-18 cm Trên thân cacao có từ 4-5 tầng cành Lá: Lá cacao phát triển theo đợt, buông thỏng xuống Màu sắc thay đổi tùy theo giống, từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu hồng đến đỏ đậm Trong trình trưởng thành, sắc tố nên có màu xanh xanh thẫm, cứng cáp nằm ngang Lá bóng che có phiến rộng xanh ngồi nắng Khí khổng có mặt phiến Trên mặt lá, mơ dậu có nhiều khoang tế bào chứa đầy chất nhựa, lớp ngoại bì bị cutin hóa mạnh Lá tồn từ 4-5 tháng, sau vào giai đoạn lão suy rụng Hoa: Hoa cacao xuất sẹo thân, cành Hằng năm, hoa xuất chỗ vết sẹo lá, lâu ngày chỗ hoa phình to nhơ lên thành đệm hoa Hoa có cuống dài 1-3 cm, có cánh đặn xen kẽ với cánh đài Hoa nở từ chiều đến sáng hôm sau Quả: Những đặc tính màu sắc, kích thước hình dạng thay đổi nhiều tùy thuộc vào giống + Màu sắc: Quả chưa chín có màu xanh, đỏ tím xanh điểm sắc đỏ tím…Khi đạt độ chín, màu xanh chuyển qua vàng, màu đỏ tím thường chuyển qua màu da cam + Hình dạng, kích thước: Hình dạng thay đổi từ hình cầu, hình oval đến dài, nhọn hình trứng Thường có chiều dài 7-30 cm, rộng 7-9 cm Hạt: Hạt cacao khơng có nhân, mập, dài 2-3 cm có cùi nhớt màu trắng, có vị chua bao bên Kế lớp cùi nhớt lớp vỏ mỏng, nhiều đường gân bao bọc lấy hạt bên Hạt chứa tử diệp màu tím (màu trắng ngà vàng nhạt giống Criollo) hóa nâu sau lên men Kích thước hạt thay đổi tùy theo giống mùa vụ Mỗi cacao có từ 30-40 hạt 2.1.3.Yêu cầu sinh thái Khí hậu: Cacao thường trồng vùng có độ cao 800 m so với mực nước biển, vùng có lượng mưa khoảng 1500-2000 mm/năm Cây cacao thích nghi tốt nhiệt độ tối đa 30-32oC nhiệt độ tối thiểu 18-21oC Cây bị thiệt hại nghiêm trọng nhiệt độ nhỏ 10oC Ẩm độ thích hợp cho khoảng 70-80% Cacao đặc biệt sinh trưởng phát triển tốt điều kiện che bóng (chỉ cho 70% lượng ánh sáng lọt qua) Đất: Cacao thích hợp với nhiều loại đất khác nhau, đất cát, đất phù sa ven sông, đất triền dốc đất nghèo dinh dưỡng có bóng che gần nguồn nước Cacao sinh trưởng phát triển tốt với đất có độ pH khoảng 5.5-6.7 Đất phải đảm bảo khả thoát nước tốt đồng thời giữ nước tốt Vì thế, nước ta, cacao thường trồng Tây Nguyên, Duyên Hải Miền Trung, Đông Nam Bộ số tỉnh miền Tây Nam Bộ 2.1.4.Các giống cacao Trên giới, cacao có nhiều dịng, nhóm Mỗi dịng, nhóm mang đặc tính khác nhau, thích hợp vùng sinh thái khác Hiện giống cacao chia làm nhóm chính: - Nhóm Criollo: Hoa có nhị màu vàng nhạt, trước chín có màu xanh đỏ, dài, chóp nhọn có 10 khía nhau, vỏ sần sùi, mỏng, dễ cắt, hạt có tiết diện trịn, phơi nhũ có màu trắng ngà - Nhóm Forastero – Amazone: Hoa có nhị màu tím, màu xanh, sau chuyển sang màu vàng, đuôi trịn, vỏ dày, khó cắt, khơng có khía, hạt có phơi nhũ màu đỏ tím - Nhóm Trinitario: Có đặc tính trung gian nhóm Forastero Criollo Ở Việt Nam, giống cacao có lai nhóm Forastero nhóm Trinitario Tuy nhiên, trước đây, giống trồng địa phương hệ cháu tạp giao nhóm 2.1.5.Đặc điểm 21 dịng cacao nghiên cứu đề tài Các dòng cacao nghiên cứu đế tài thuộc giống có suất cao, có giá trị thương mại nhờ chọn lọc từ bố, mẹ có đặc tính tốt q trình lai tạo giống 13 dịng cacao thương mại nhập từ Malaysia có đời bố mẹ số dòng sau: Tên dòng TD1 TD3 TD5 TD10 TD13 TD14 TD12 Đời bố mẹ PA 35 x NA 32 Con lai Trinitario UAWA 18 x T.S.15/43.352 NA 31 x PA 15 UIT x NA 33 PA 173 x SCA (PA 76 x SCA 20) x (UIT x SCA 6) 2.2.Qui trình ly trích DNA tế bào thực vật Mọi nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử bắt đầu việc thu nhận lượng lớn nucleic acid đủ lớn đủ tinh để tiến hành thí nghiệm Mối quan tâm hàng đầu kỹ thuật tách chiết nucleic acid thu nhận phân tử trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy tác nhân học (phân tử bị gẫy nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải enzyme nội bào giải phóng mơi trường tế bào bị phá vỡ) Các nucleic acid cần tách chiết nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzyme nội bào (Desoxyribonuclease-Dnase Ribonuclease-Rnase) Một qui trình ly trích DNA tế bào thực vật gồm bước bản: Bước 1: Phá vỡ màng tế bào Thông thường người ta nghiền tế bào mô hỗn hợp dung dịch đệm chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7.5), NaCl 5M, EDTA 0.5M, sodium dodecyl sulfat 10% (SDS) Hỗn hợp phá vỡ màng tế bào màng nhân, giải phóng DNA mơi trường đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu chủ yếu protein Có thể sử dụng CTAB/NaCl (CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide) tạo phức hợp với polysaccharide protein kết tủa chúng Loại bỏ protein phức hợp CTAB – polysaccharide – protein hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Phenol chloroform làm biến tính protein Ngồi chloroform cịn làm cho pha nước pha hữu dễ tách rời Isoamyl alcohol hạn chế bọt suốt q trình ly trích Mặc dù phenol làm biến tính protein làm ức chế hình dạng Rnase làm dung mơi cho phân tử Rnase có chứa chuỗi dài polyA (Brawerman ctv,1972) Do đó, khắc phục nhược điểm cách sử dụng thêm chloroform giúp loại bỏ tất dấu vết cịn sót lại phenol nucleic acid Protein bị biến tính khơng hịa tan pha nước có chứa nucleic acid sau ly tâm tủa thành lớp nằm pha nước pha hữu Pha nước có chứa nucleic acid thu nhận lại Bước 3: Tủa nucleic acid isopropanol Các DNA có trọng lượng phân tử thấp khơng bị tủa nên loại bỏ chúng tủa isopropanol Nucleic acid thu nhận lại ly tâm Sau đó, cặn tủa phải rửa ethanol 70% để loại bỏ muối dấu vết isopropanol cịn dính lại (Hồ Huỳnh Thùy Dương,1998) Phân tích định tính định lượng DNA quang phổ kế Sau thu nhận nucleic acid dạng sạch, tiến hành phân tích định tính định lượng DNA quang phổ kế Phương pháp cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có mẫu sau ly trích Nguyên tắc phương pháp dựa vào hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm base purine pyrimidine Giá trị mật độ quang (OD: optical density) bước sóng 260 nm mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid mẫu dựa vào tương quan: đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ 50ng/μl cho dung dịch chứa DNA mạch kép Tuy nhiên, cách tính với dung dịch chứa nucleic acid Để kiểm tra độ dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD280nm Tại bước sóng 280 nm, protein có mức hấp thụ cao nhất, protein hấp thu bước sóng 260 nm nucleic acid làm sai lệch giá trị thật nồng độ nucleic acid Tỉ số OD260nm /OD280nm tỉ số cho thấy độ nhiễm chất phenol protein - Tỉ số OD260nm /OD280nm = 1.8 DNA tinh khiết - Tỉ số OD260nm /OD280nm = RNA tinh khiết (Quách Tuyết Oanh, 2003) 2.3.Giới thiệu kỹ thuật PCR 2.3.1.Nguyên tắc kỹ thuật PCR PCR thực sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm trình tự sau : Bước 1: Biến tính Giai đoạn thực nhiệt độ cao (94-95o C) vòng 30 giây đến phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành mạch đơn Chính mạch đơn đóng vai trị mạch khuôn cho tổng hợp mạch bổ sung Bước 2: Phản ứng primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã dây template để có phân tử DNA Ở giai đoạn nhiệt độ hạ thấp cho phép primer bắt cặp với khuôn, nhiệt độ dao động khoảng 30-70o C, kéo dài khoảng 30 giây đến phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) primer sử dụng Giai đoạn gọi giai đoạn lai Bước 3: Kéo dài dây nhờ primer Nhiệt độ tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt Thời gian giai đoạn tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Kết cuối đoạn mã hóa di truyền đặc biệt khuếch đại lên nhiều lần Sự khuếch đại tính sau: Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m : số chuỗi mã hóa n : số chu kỳ Hình 2.2: Nguyên tắc phản ứng PCR Ba trình tự xảy theo chu kỳ nhanh để khuếch đại DNA Trong chu kỳ thứ thứ hai phản ứng khuếch đại, có sản phẩm chuỗi dài hình thành, cịn chu kỳ khuếch đại sản phẩm chuỗi dài chuỗi ngắn Sản phẩm chuỗi dài tích tụ theo hướng tuyến tính, cịn sản phẩm chuỗi ngắn tích tụ theo logarit Do dó, người ta hy vọng có khoảng 105 lượng sản phẩm chuỗi ngắn sau khoảng 25-30 chu kỳ Theo nguyên tắc PCR áp dụng để khuếch đại đoạn DNA có chiều dài 200-2000bp Những phản ứng thực nhờ polymerase Taq polymerase, thay đổi chu kỳ nhiệt cách hợp lý, đặc biệt nhiệt độ cho giai đoạn biến tính giai đoạn bắt cặp Một polymerase DNA bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) dùng để khuếch đại đoạn chuyên tính DNA Khả “chọn lọc” thực thông qua hợp lại oligonucleotide (F R) phản ứng Nhiệm vụ 10 oligonucleotide tác động làm cho DNA bị biến chất (mở dây đôi thành dây đơn) phần cuối đoạn nhằm tăng hoạt lên cho hoạt động primer sinh tổng hợp DNA Primer bên trái tác động dây DNA 3’-5’ gọi forward primer, kí hiệu F Primer bên phải tác động dây 5’-3’ gọi reverse primer, kí hiệu R Sự xếp đảm bảo vùng bị can thiệp tăng cường hoạt động, theo trình tự nói Tóm lại primer kết hợp với sợi DNA đối lập điều kiện khoảng cách kích hoạt, đoạn DNA khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase 2.3.2.Tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng PCR 2.3.2.1.DNA mẫu Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy DNA thật tinh Tuy nhiên, kỹ thuật chẩn đoán PCR cho kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003) Lượng DNA mẫu sử dụng có khuynh hướng giảm (1μg xuống 100ng) với việc sử dụng polymerase cho hiệu cao Hơn việc giảm lượng mẫu ban đầu cịn hạn chế khuếch đại “kí sinh”, tạo sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003) Thông thường, nhiễm protein mẫu DNA trình ly trích DNA khơng ảnh hưởng xấu đến nhân DNA Tuy nhiên nhiễm DNA lạ dẫn đến kết PCR bị sai lệch Đối với DNA có kích thước q lớn (>50kb), biến tính khơng hữu hiệu suất PCR thấp Trong trường hợp này, cần phải cắt DNA trước enzyme cắt hạn chế mà enzyme khơng cắt chuỗi đích; tách DNA cách dùng nhiệt độ tới 100oC 2-5 phút 2.3.2.2.Taq polmerase Taq polymerase enzyme chịu nhiệt ly trích từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus Với enzyme này, PCR cho hiệu cao nhất, Taq xúc tác kéo dài khoảng 35-100 nucleotide giây nhiệt độ 70-80oC, giới hạn nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động (C.R Newton A.Graham, 1997) 11 Nồng độ Taq polymerase sử dụng thông thường 0.5-5 đơn vị/100μl dung dịch phản ứng Nếu nồng độ Taq cao, sản phẩm không chuyên tính nhảy vào làm sai lệch kết Nếu nồng độ Taq thấp, đủ số lượng men để xúc tác tạo sản phẩm PCR theo ý muốn Trong phản ứng PCR Taq polymerase có khuynh hướng thêm nucleotide loại “A” vào đầu tận 3’ sản phẩm PCR, điều quan trong việc tạo dòng (TA- cloning) bị loại thải gắn kết xảy đầu tận đầu (blunt end ligation) Ngồi làm gia tăng hoạt tính Taq polymerase cách sử dụng kết hợp với số enzyme khác: Tli Pfu Use Tli, Pfu số enzyme polymerase khác 2.3.2.3.Primer Primer tiêu quan trọng để đạt khuếch đại đặc trưng có hiệu cao Việc chọn primer giai đoạn định phương pháp PCR, việc thiết kế primer phải tuân thủ số tiêu sau (Vincent R Prezioso, 2004): 1- Chiều dài primer Đây tiêu quan trọng cho thành cơng PCR, tính đặc hiệu nhiệt độ bắt cặp primer phụ thuộc phần vào chiều dài primer Thơng thường primer có chiều dài từ 18-24 base (theo nguyên tắc Wallace) có tính đặc hiệu cao, cho nhiệt độ bắt cặp tối ưu Kích thước primer khơng nên q ngắn, trừ trường hợp phục vụ cho mục đích đặc biệt, khơng nên q dài làm giảm khả bắt cặp 2- Nhiệt độ nóng chảy Tm Hai primer xuôi ngược phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy khơng cách biệt q xa, chênh lệch nhiệt độ lớn primer có Tm cao bắt cặp khơng đặc hiệu, cịn primer có Tm thấp khơng thể lai với DNA 3- Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu primer phụ thuộc phần vào chiều dài primer nói Để có độ đặc hiệu cao, primer phải thiết kế cho khuếch đại trình tự đặc trưng DNA hay cho sản phẩm chính, khơng nên có nhiều trình tự lặp lại primer, điều dẫn đến xuất sản phẩm phụ Nhiệt độ giai đoạn kéo dài không thấp so với nhiệt độ bắt cặp primer để đảm bảo tính đặc hiệu 12 4- Trình tự bổ sung primer Trình tự primer phải thiết kế cho có khơng q cặp base có trình tự bổ sung với nhau, điều dẫn đến tượng “kẹp tóc” bắt cặp bổ sung phần khác primer, làm ngăn cản bắt cặp primer với DNA Hai primer xi ngược phải khơng có trình tự bắt cặp bổ sung với để tránh tượng “dimer primer”, điều dẫn đến cạnh tranh bắt cặp với DNA cản trở hình thành sản phẩm mong muốn Ngồi ra, nồng độ thừa primer dẫn đến hình thành “dimer primer” (Bùi Chí Bửu,1999) Thơng thường, primer xi primer ngược thường có nồng độ nhau, khoảng 0.1μM tương đương với 2.5pmol 25 μl dung dịch phản ứng Trình tự DNA nằm hai mồi “xi” “ngược” không lớn Phản ứng tối ưu trình tự DNA nhỏ kb (Hoàng Thị Liễu, 2004) 5- Hàm lượng GC AG Thành phần nucleotide primer nên cân bằng, tránh cặp GC lặp lại nhiều lần Hàm lượng GC primer nên nằm khoảng 45% đến 50% (Kwork ctv., 1990), trình tự primer lý tưởng có 50% GC (theo nguyên tắc Wallace) Trình tự primer phải khơng có poly G hay poly C, poly A hay poly T, điều làm cho bắt cặp khơng đặc hiệu Trình tự polypyrimidine TC hay polypurine Agcũng cần phải tránh làm giảm hiệu khuếch đại 6- Trình tự đầu 3’ Vị trí đầu 3’ primer quan trọng việc kiểm sốt tượng “mismatch” - bắt cặp khơng đặc hiệu Cần tránh trình tự A hay T đầu 3’, mà thay vào G C mối liên kết hydro G-C mạnh A-T bảo đảm cho bắt cặp đặc hiệu 2.3.2.4.Nhiệt độ bắt cặp Kỹ thuật PCR mẫn cảm với nhiệt độ Vì thay đổi nhiệt độ phản ứng ảnh hướng mạnh đến suất độ chuyên biệt 20 đoạn lặp lại ngắn từ 2-6 bp kích thước locus 20-100 bp Microsatellite tìm thấy tất thể sống, đặc biệt thể sống có gen lớn phân bố genome Microsatellite có tính đa hình cao (đa hình theo chiều dài), codominant-al hay al đồng trội (bao gồm loại: al đồng hợp al dị hợp), có tính chất cần thiết chất cần thiết cho marker Tần số đột biến từ 104 - 5.10-6, tuân theo định luật Mendel Vị trí microsatellite nhiễm sắc thể xác định PCR từ lượng DNA nhỏ Xác định microsatellite PCR lồi áp dụng lồi khác có quan hệ họ hàng 2.5.2.Các loại microsatellite Căn vào cấu tạo đơn vị lặp lại (2-6 lần) có : Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất dinucleotide SSR khoảng 10 lần, tetranucleotide SSR (Ma ctv., 1996) Những đoạn lặp lại poly A /poly T kiểu phổ biến tất gen tần số phân bố loài khác Tuy nhiên khơng phù hợp để sử dụng lập đồ, phân tích quần thể khơng ổn định bền vững q trình phân tích PCR Trong q trình này, tác động enzyme Taq polymerase làm cho kích thước al bị thay đổi cách thêm nucleotide A vào cuối đoạn chèn vào vùng lặp lại al (Smith ctv., 1996) Những phân tích gần số liệu đoạn lặp lại cặp CA/GT loại thường gặp động vật có vú, gấp đơi so với AT gấp so với AG/TC Loại dinucleotide thường gặp thực vật AA/TT AT/TA Chúng phân ba loại sau: 21 • Hồn hảo: khơng có ngắt qng CACACACACACA • Phối hợp: kết hợp nhiều loại lặp lại CACACACAGAGAGA • Ngắt quãng: bị chèn nhiều nhiều base CACATTCACACATTCATT Loại có tính đa hình cao loại không bị ngắt quãng, thực tế microsatellite thường bị ngắt quãng, kết hợp trình tự lặp lại Trong số nucleotide lặp lại, CAG ATT nhiều nhiên tần số xuất kiểu tùy thuộc vào chủng loại genome 2.5.3.Cơ chế hình thành microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite chưa hiểu biết cách đầy đủ Tuy nhiên di truyền học nghiên cứu khác cho chế xuất hình thành microsatellite q trình sau: • Q trình bắt chéo lỗi trình giảm phân (unequal crossing- over during meiosis) Hình 2.4: Cơ chế bắt chéo lỗi giảm phân • Q trình trượt lỗi mã (replication slippage) Đây coi nguyên nhân chủ yếu xảy mạch chậm (lagging strand) Quá trình liên quan đến trình trượt lỗi enzyme polymerase phân tử DNA tổng hợp Sự trượt lỗi tạo chỗ phình thời bị loại bỏ q trình sửa lỗi kéo dài thêm mạch đối diện tạo thành đoạn lặp lại dài 22 Hình 2.5: Cơ chế trượt lỗi q trình mã 2.5.4 Vai trị microsatellite Rất nhiều microsatellite tìm thấy vùng phía vùng khởi đầu mã vùng mang mã Chức rõ rệt vùng cịn chưa rõ ràng, người ta tìm thấy chúng tồn vùng exon có liên quan tới bệnh di truyền Microsatellite dùng marker di truyền để nghiên cứu di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập đồ gen Tuy nhiên có nhiều chứng cho trình tự microsatellite đóng vai trị yếu tố mang mã nhân tố điều hịa Microsatellite tìm thấy khắp nơi phần trước vùng khởi đầu mã vùng mang mã, số tìm thấy có quan hệ với vùng mã hố Số lượng khác đoạn lặp lại microsatellite vùng mã hố có quan hệ với biểu gene chức gene Ở số trường hợp, thay đổi (mất thêm) đơn vị lặp lại microsatellite làm thay đổi chức hoạt động promotor Vị trí microsatellite gần hay xa promotor làm hoạt động promotor thay đổi Vùng 23 điều khiển có chứa microsatellite hoạt động nhân tố thúc đẩy trình phiên mã đột biến đoạn microsatellite làm giảm chức gen Microsatellite liên kết với protein bám mà protein có chức bám dính vào trình tự khởi động gen, trình tự giải phóng gen khởi động mã Điều microsatellite hoạt động yếu tố điều hòa trình mã, ảnh hưởng đến trình mã thông qua ảnh hướng đến protein bám Rất nhiều nghiên cứu ảnh hưởng thúc đẩy microsatellite protein bám dính chức đoạn lặp lại vùng microsatellite đặc biệt Như trình tự mang mã, microsatellite tìm thấy biểu nhiều protein khác số lần lặp lại trình tự microsatellite dẫn đến khác chức protein hoạt động gen, ảnh hưởng đến chức sinh lý phát triển thể Một số nghiên cứu gần có ảnh hưởng chiều dài khác microsatellite đến hình thái phát triển mức độ quan tổng kết lại yếu tố chức hệ gen Những tính chất đặc biệt microsatellite đột biến điểm dẫn đến giả thiết cho microsatellite nguồn chủ yếu tạo nên đa dạng di truyền số lượng q trình tiến hóa thích nghi (Kashi ctv.,1990,1997) Nó cho phép quần thể khơi phục lại nguồn đa dạng di truyền bị q trình chọn lọc, hoạt động “núm điều chỉnh” mà qua gen đặc biệt điều chỉnh nhanh chóng phản ứng thay đổi hay nhiều trình địi hỏi tiến hóa (King ctv., 1997, 1998) Do microsatellite nguồn quan trọng việc nghiên cứu đa dạng di truyền làm sở cho thay đổi tiến hóa 2.5.5 Các phương pháp phát microsatellite Có phương pháp để phát microsatllite: phương pháp lai phương pháp PCR 2.5.5.1.Phương pháp lai Phương pháp lai ghép phân tử cho phép xác định xác kiểu microsatellite cách chuyển qua màng lai, lúc phát nhiều kiểu 24 microsatellite mẫu dò khác Tuy nhiên xác định chiều dài chúng bị hạn chế Trong phương pháp lai có hai cách: phương pháp phát nhờ đồng vị phóng xạ phương pháp nhuộm bạc • Phương pháp phát nhờ đồng vị phóng xạ Phương pháp hiệu dùng đồng vị phóng xạ Người ta đánh dấu vào đầu primer (end-labelling) đánh dấu trộn lẫn bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling) Nhưng ngày phương pháp dùng đồng vị phóng xạ sử dụng nguy hiểm đến sức khỏe người đòi hỏi việc xử lý chất thải tốn • Phương pháp nhuộm bạc (phát khơng dùng phóng xạ) Phương pháp rẻ, không hại độ nhạy cao, đòi hỏi số kỹ thuật rắc rối nhuộm 2.5.5.2.Phương pháp PCR Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward sử dụng máy giải trình tự tự động Đây phương pháp áp dụng Phương pháp phát triển với phát triển màng giải trình tự nucleotide để phát sản phẩm PCR đánh dấu chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer incorporation) Khi kích thích tia laser, chất nhuộm màu giải phóng tín hiệu mà máy tính phát cách so sánh di chuyển sản phẩm PCR với DNA chuẩn, có kích thước xác đoạn DNA quan tâm Chất huỳnh quang gắn vào đầu 5’ cặp mồi, 40 ng mồi loại đủ dùng cho 10000 phản ứng PCR Phương pháp có hiệu cao sử dụng phổ biến phịng thí nghiệm giới Người ta đánh dấu loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, phản ứng PCR chạy giếng điện di, kể kích thước đoạn xác định nhờ màu huỳnh quang khác 25 Kết thể máy tính, nhờ xác định xác kích thước al, loại trừ băng lặp lại (stuter DNA) thêm nucleotide A,… 2.5.6.Nguyên tắc phát microsatellite primer PCR Cách phổ biến để phát microsatellite thiết kế primer PCR đặc trưng cho locus genome Vì cặp primer PCR áp dụng cho cá thể loài, cho sản phẩm khuếch đại có kích thước khác phụ thuộc vào chiều dài khác trình tự microsatellite Hình 2.6 : Phát microsatellite từ DNA tổng số Hai primer PCR (2 mũi tên màu xám) thiết kế nằm vùng bảo tồn nằm bên trình tự microsatellite Nếu khơng có đoạn lặp lại nào, sản phẩm PCR có chiều dài 100bp Vì vậy, dựa vào kích thước sản phẩm PCR tính số lần lặp lại dinucleotide “CA” trình tự microsatellite (như ví dụ “CA” có lần lặp lại với chiều dài sản phẩm PCR 116bp) Primer microsatellite đặc trưng cho lồi giúp phát đa hình vị trí tương đồng (cùng locus al) cá thể lồi Điều thực nhờ trình tự microsatellite trình tự vùng flanking- vùng nằm bên trình tự microsatellite để thiết kế primer- bảo tồn q trình di truyền lồi Vùng flanking quan trọng giúp phát trình tự microsatellite đặc trưng locus nhiễm sắc thể 26 Hình 2.7 : Vùng flanking bên trình tự microsatellite Sản phẩm PCR sau phân tích điện di gel capillary, cách xác định kích thước sản phẩm PCR đồng thời đếm số lần lặp lại nucleotide al Thông thường sản phẩm PCR có band, band band phụ nhỏ band 2bp (Murray ctv., 1993) Sự xuất band phụ trình trượt lỗi DNA polymerase (Tautz,1989), band phụ gây trở ngại cho việc xác định kích thước xác band chính, band phụ xem dấu hiệu để nhận biết sản phẩm khuếch đại microsatellite Hình 2.8 :Dữ liệu microsatellite phân tích điện di gel với band màu đen band phụ màu xám MW: thang chuẩn để xác định kích thước sản phẩm PCR 27 Hình 2.9 : Dữ liệu microsatellite phân tích tự động điện di cappilary máy giải trình tự DNA Vị trí peak trục ngang tương ứng với kích thước sản phẩm PCR chiều cao peak biểu thị tổng lượng sản phẩm PCR Band tạo peak cao band phụ MW: thang chuẩn để xác định kích thước sản phẩm PCR 2.5.6.1.Khả chuyển đổi primer microsatellite lồi Rất nhiều microsatellite tìm thấy vùng tương ứng gen loài khác Rất nhiều tài liệu công bố bảo tồn microsatellite gene lồi động vật có vú trâu, bị, hươu, cừu, dê Do áp dụng kết nghiên cứu từ trâu sang bị hay lồi khác ngược lại Khả sử dụng loại primer microsatellite loài khác phụ thuộc vào di truyền ổn định trình tự microsatellite mức độ bảo tồn (hay giống nhau) vùng flanking (nằm bên trình tự microsatellite) trình tiến hóa lồi Khả chuyển đổi primer microsatellite loài khác làm tăng giá trị primer đó, nhiên số lồi có khả chuyển đổi primer microsatellite giới hạn (Roder ctv., 1995) Khi áp dụng cặp primer microsatellite lồi cho lồi khác, chu trình PCR thường phải biến đổi để thu kết tốt Thông thường nhiệt độ bắt cặp giảm xuống từ 2-5oC tùy theo mức độ xa hay gần quan hệ tiến hóa lồi Dayanadan ctv.(1997) phát primer có số lượng GC cao dễ áp dụng từ loài sang loài khác mà khơng cần biến đổi chu trình PCR ngược lại 28 2.5.6.2.Thiết kế primer microsatellite Nếu muốn áp dụng phương pháp microsatellite để nghiên cứu di truyền lồi trước tiên thử áp dụng phân tích với primer microsatellite lồi có quan hệ di truyền gần gũi với lồi Trong trường hợp khơng tìm primer microsatellite lồi thân thuộc, tự thiết kế primer microsatellite, bước sau: 1- Ly trích để thu DNA tổng số 2- Phân cắt tồn genome thành đoạn DNA có kích thước trung bình từ 300-600bp enzyme cắt giới hạn 3- Chèn đoạn DNA cắt vào plasmid để tạo nhiều DNA, loại plasmid thường sử dụng PUC19 vị trí cắt plasmid xác định rõ 4- Chuyển plasmid lên màng nylon 5- Dùng probe để lai với màng, probe oligonucleotide chứa trình tự microsatellite quan tâm (VD: (AC)10), đánh dấu phóng xạ huỳnh quang 6- Phát nuôi cấy dòng vi khuẩn chứa plasmid cho kết dương tính lai với probe 7- Dùng enzyme cắt giới hạn để thu lại đoạn DNA chèn plasmid, tiến hành phân tích đoạn DNA agarose gel 1% 8- Dùng phương pháp lai Southern với probe để phát lại lần đoạn DNA chứa trình tự microsatellite quan tâm 9- Đem giải trình tự xác định microsatellite trình tự vùng flanking nằm bên trình tự microsatellite, vùng để thiết kế primer 10- Chọn trình tự microsatellite phù hợp để thiết kế primer (thơng thường phải có lần lặp lại) tùy theo mục đích nghiên cứu 11- Tổng hợp cặp primer đặc hiệu cho locus, thông thường từ 20-30 bp nằm vùng flanking không nằm sát với trình tự microsatellite Primer forward đánh dấu huỳnh quang, màu huỳnh quang sản phẩm khuếch đại primer phát tia laser đưa vào phân tích trình tự 29 2.5.7.Ưu, khuyết điểm phương pháp microsatellite so với phương pháp khác - Phương pháp microsatellite hiệu phương pháp RFLP chỗ đòi hỏi lượng DNA phân tích hơn, mức độ đa hình cao thêm vào khả phân tích tự động máy giải trình tự - Primer microsatellite trao đổi dễ dàng nhà nghiên cứu locus có mang trình tự microsatellite phát cặp primer thích hợp Primer microsatellite dễ áp dụng từ loài sang loài khác phương pháp AFLP - Phương pháp microsatellite cho kết phân tích tính đa hình xác hơn, với mức độ đa hình cao gấp lần so với phương pháp RAPD (Kraic ctv., 1998) - Hiện nay, microsatellite công cụ chủ yếu thay phương pháp RFLP nghiên cứu lập đồ di truyền thực vật Ngoài ra, kết hợp phương pháp microsatellite phương pháp AFLP giúp cho việc xây dựng đồ di truyền cách chi tiết - Đặc tính đồng trội (co-dominant) microsatellite ưu điểm nghiên cứu lập đồ di truyền, RAPD AFLP khơng có đặc tính - Powell ctv., (1996) tiến hành thí nghiệm kiểm tra hiệu loại marker di truyền RFLP, RAPD, AFLP Microsatellite phân tích di truyền đậu tương thơng qua tiêu: phân tích mức độ dị hợp tỉ số multiplex (số loci phân tích lần thí nghiệm) Kết marker microsatellite phân tích mức độ dị hợp cao (0.60), marker AFLP cho tỉ số multiplex cao - Hạn chế phương pháp microsatellite khơng thể áp dụng phân tích hệ thống lớn bao gồm nhiều lồi có quan hệ di truyền xa nhau, điều microsatellite có tỉ lệ đột biến cao dẫn đến trở ngại Thứ nhất, trình tự vùng flanking bên vùng microsatellite thường khác loài đột biến, khó áp dụng primer microsatellite loài cho loài khác Thứ hai, tỉ lệ đột biến cao nên loài có kết phân tích với trình tự microsatellite, ví dụ AC19, khơng thể kết luận lồi có nguồn gốc tổ tiên ban đầu, lồi phân ly từ tổ tiên chúng AC18 đột biến thành AC19, cịn lồi phân ly từ tổ tiên chúng AC20 đột biến thành AC19 30 2.5.8.Ứng dụng microsatellite Microsatellite phát mô tả lần đầu người (Litt Luty, 1989; Weber May, 1989) Những phát tương tự nhanh chóng tìm thấy lồi động vật có vú như: chuột (Love ctv.,1990), heo (Johansson ctv., 1992) gia súc (Kemp ctv., 1993) Việc ứng dụng microsatellite nghiên cứu di truyền trồng thực khoảng thời gian gần kết ứng dụng thành công mức độ đa hình phát microsatellite cao marker phân tử khác (Saghai Maroof ctv.,1994; Powell ctv., 1996) Do đó, microsatellite công cụ đắc lực nghiên cứu đa dạng di truyền trồng ( Yang ctv., 1994; Xiao ctv., 1996) Những trồng nghiên cứu dựa microsatellite gần bao gồm: gạo (Wu Tanksley,1993), lúa mì (Saghai Maroof ctv.,1994), lúa mạch (Roder ctv.,1995), thông (Karhu ctv., 2000) cacao (Juan Carlos Motamayor ctv., 2002) Người ta nghiên cứu tần số xuất vùng microsatellite thực vật thấp động vật từ đến 10 lần (Lagercrantz ctv., 1993; Powell ctv., 1996) Mặc dù tần số microsatellite DNA tế bào thực vật thấp động vật (Wang ctv., 1994) trình tự microsatellite có DNA lục lạp nguồn marker hữu ích nghiên cứu tính đa hình, áp dụng để phân loại 13 dịng Glycine (Powell ctv., 1995) Những marker microsatellite lục lạp đánh giá công cụ đắc lực nghiên cứu phát sinh giống, loài phân loại theo nguồn gốc địa lý (Doyle ctv., 1998) Microsatellite phát DNA ti thể áp dụng nghiên cứu chuyển đổi 15 loài (Soranzo ctv., 1999) Nhờ tính chất marker, microsatellite áp dụng nhiều lĩnh vực như: lập đồ gen, nghiên cứu gen liên quan đến bệnh di truyền, giám định pháp y, phân tích để tìm bố mẹ, xác định phả hệ, xác định cấu trúc quần thể, đặc biệt áp dụng việc xác định cấu trúc liên kết cá thể, cấu trúc quần thể loài có nguy bị thu hẹp phát triển, xác định mức độ đồng huyết quần thể, xác định vị trí liên quan đến tính trạng số lượng (QTL)…Các thông tin microsatellite đa al locus nhiều locus phân tích phương pháp thống kê để đưa nhiều thơng tin bổ ích cấu trúc quần thể, phả hệ, gen liên quan đến suất chất lượng sản phẩm, gen chống bệnh,v.v 31 Người ta phát triển sử dụng phương pháp xác định microsatellite việc đánh giá mức độ cận huyết cá thể quần thể, đồng thời áp dụng việc nghiên cứu cấu trúc quần thể Trước tiên việc đánh giá giá trị trung bình dị hợp tử cho cá thể thông qua liệu microsatellite Tiếp theo việc xác định kiểu đột biến microsatellite Nghiên cứu trình đột biến microsatellite nhiều tác giả đưa phương pháp xác định mức độ thân cận quần thể Khoảng cách chiều dài al microsatellite chứa thông tin khoảng cách di truyền quần thể, phản ánh thời gian từ quần thể tách Những tính tốn khoảng cách di truyền quần thể giúp tính tương quan thời gian kể từ quần thể tồn Khi quần thể tách biệt mặt di truyền, trình đột biến phân ly dẫn đến tần số al khác rõ rệt 2.6.Các cơng trình nghiên cứu có liên quan 2.6.1.Kiểm tra tính đồng di truyền Theobroma cacao L microsatellite marker Trong nghiên cứu tổ chức USDA DNA cacao , người ta xác định 15 cặp primer microsatellite: mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR40, mTcCbIR33, mTcCIR1, mTcCIR60, mTcCIR22, mTcCIR24, mTcCIR15, mTcCIR11, mTcCIR12, mTcCIR26, mTcCIR37, mTcCIR6, mTcCIR8 có hiệu việc nhận dạng di truyền cá thể cacao thu nhận từ ngân hàng gen cacao Quốc tế Trinidad Lượng thông tin tính đa hình thay đổi khoảng 0.42 đến 0.82 với giá trị trung bình 0.67 số 15 loci Tính dị hợp thay đổi khoảng từ 0.51 đến 0.79 Xác suất đồng tích lũy 15 loci thay đổi từ 7.87x10-5 1.485x10-9, phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền quần thể Kết cho thấy xác suất phù hợp ngẫu nhiên kiểu gen khơng đáng kể Vì vậy, phối hợp 15 cặp primer SSR đủ cho việc nhận diện cá thể cacao Sử dụng 15 cặp primer người ta đánh giá mức độ nhầm lẫn tên quần thể cacao thu nhận từ rừng mưa nhiệt đới Amazone vào thập niên 50 Kết cho thấy 2-3% tổng số bị đặt tên sai Hơn nữa, người ta xác minh lại nguồn gốc cách so sánh liệu SSR với lân cận 32 khu vực Do vậy, SSR marker phương pháp hiệu tin cậy việc nhận diện cá thể cacao đặc trưng phân tử (Tham khảo tại: http://www.icg.rdg.ac.uk/public_html/ssr-helpfile.htm) 2.6.2.Nghiên cứu fingerprinting DNA cacao sử dụng microsatellite marker Tại Đại Học Penn State Mỹ, tác giả J-D Swanson, A.C.Lee J.Guiltinan sử dụng 15 microsatellite primer (trong đó, primer có nhiệt độ bắt cặp 51oC, primer cịn lại có nhiệt độ bắt cặp 46oC) nghiên cứu fingerprinting giống cacao từ trung tâm nghiên cứu cacao Trinidad, bao gồm: PA30 T1, LX31, PA30 T10, GU114P, PA T5, GS4/4A, LCTEEN 68-1 IMC47 DNA ly trích Quiagen DNeasy kit Sản phẩm PCR phân tích máy đọc trình tự tự động ABI 3100 Mỗi mẫu lặp lại thí nghiệm lần Kết 11 primer cho kết khuếch đại tốt, primer (mTcCIR40, mTcCIR33, mTcCIR12, mTcCIR6) không cho kết sau nhiều lần thí nghiệm Kết phân tích fingerprinting cho liệu nhị phân trình bày bảng 2.1 (Tham khảo tại: USDA Cacao DNA Fingerprinting- Ring Test Results from Penn State Iniversity) Bảng 2.1: Kết phân tích fingerprinting Primer mTcCIR7 mTcCIR7 mTcCIR7 mTcCIR7 mTcCIR7 mTcCIR7 mTcCIR7 mTcCIR7 mTcCIR7 mTcCIR7 Kích thướcđoạn DNA (bp) 118-120 132-133 1* 134 1* 138-139 143-144 1* 153-155 1* 156-158 1 162-163 0 168 0 190 1* 1 0 1 0 0 0 0 1* 1* 1 0 0 1 0 1 1 1* 1* 0 0 1 0 1 0 mTcCIR37 144 1* 0 0 1* mTcCIR37 159-160 1* 0 0 0 1* mTcCIR37 163 0 0 33 mTcCIR37 165 0 1* 0 1* mTcCIR60 190-191 0 1* 1 1* mTcCIR60 193 0 0 0 mTcCIR60 208-210 1 1* 1 mTcCIR60 211-213 1 1 0 1 mTcCIR60 221 1* 1* 1* 1* mTcCIR1 127 0 mTcCIR1 129-131 1 1* mTcCIR1 143 1* mTcCIR1 150 1 1 1 1 0 0 1* 1* 1* 1* 1* 1* mTcCIR11 129-130 1* 0 0 mTcCIR11 141 1* 1* 1* 0 mTcCIR11 253-254 1* 1* 1 mTcCIR11 272 0 0 1* 0 mTcCIR11 288 0 0 0 mTcCIR11 298-300 0 1 1* 1* mTcCIR11 308 1 0 0 mTcCIR11 314 1* 0 1 mTcCIR11 324 0 1* 1* Kích thướcđoạn Primer DNA mTcCIR18 320 mTcCIR18 330 mTcCIR18 332 mTcCIR18 334 mTcCIR18 342 mTcCIR18 344 mTcCIR18 354 0 0 1 1* 1* 0 10 00 10 01 01 00 mTcCIR22 120 1* mTcCIR22 290 0 mTcCIR22 307-308 0 mTcCIR22 314 1* mTcCIR24 182 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 00 00 00 01 1* 0 0 0 0 1* 0 34 mTcCIR8 mTcCIR8 mTcCIR8 mTcCIR8 mTcCIR8 mTcCIR8 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1* 0 0 0 0 mTcCIR15 203 0 mTcCIR15 221 0 mTcCIR15 233 0 mTcCIR15 239 mTcCIR15 249-251 0 mTcCIR15 284-285 mTcCIR15 300 1 1 0 00 00 00 00 1* 00 00 0 0 0 1* 1* 0 0 1 0 0 mTcCIR26 239 257-258 264-266 274-175 282-283 292 292 1* 1* 0 1 0 0 010 0 mTcCIR26 294-296 1* 1* mTcCIR26 301 1 000 1 mTcCIR26 303 0 100 0 Trong đó: 1: kết điện di có diện band 0: kết điện di khơng có band *: primer cho kết khuếch đại lần lặp lại thí nghiệm Kí hiệu giống phân tích microsatellite theo thứ tự từ đến 8: PA30 T1, PA30 T10, LCTEEN 68-1, LX31, IMC47, GU114P, GS4/4A PA T5 Trên sở tham khảo kết trên, chọn cặp primer: mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15, mTcCIR18 năm cặp primer cho đoạn khuếch đại có tính đa hình cao giống cacao phù hợp với mục đích định danh phân tích đa dạng di truyền ... mTcCIR15 20 3 0 mTcCIR15 22 1 0 mTcCIR15 23 3 0 mTcCIR15 23 9 mTcCIR15 24 9 -25 1 0 mTcCIR15 28 4 -28 5 mTcCIR15 300 1 1 0 00 00 00 00 1* 00 00 0 0 0 1* 1* 0 0 1 0 0 mTcCIR26 23 9 25 7 -25 8 26 4 -26 6 27 4-175 28 2 -28 3... 29 2. 5.7.Ưu, khuyết điểm phương pháp microsatellite so với phương pháp khác - Phương pháp microsatellite hiệu phương pháp RFLP chỗ đòi hỏi lượng DNA phân tích hơn, mức độ đa hình cao thêm vào... 330 mTcCIR18 3 32 mTcCIR18 334 mTcCIR18 3 42 mTcCIR18 344 mTcCIR18 354 0 0 1 1* 1* 0 10 00 10 01 01 00 mTcCIR 22 120 1* mTcCIR 22 290 0 mTcCIR 22 307-308 0 mTcCIR 22 314 1* mTcCIR24 1 82 0 1 0 0 1 0