Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa cayenne bằng phương pháp rapd
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHONG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHONG CN LƢU PHÚC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập - Các thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học thầy cô trực tiếp giảng dạy suốt bốn năm qua - TS Trần Thị Dung CN Lƣu Phúc Lợi tận tình hƣớng dẫn động viên thời gian thực đề tài tốt nghiệp - TS Lê Đình Đơn hƣớng dẫn góp ý cho tiến hành chủng rệp nhà lƣới - CN Hồ Việt Thế anh chị phụ trách phịng CNSH thực vật thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Hóa Sinh - Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh giúp đỡ suốt thời gian phịng thí nghiệm - Chị Tơn Bảo Linh, chị Biện Thị Lan Thanh góp ý giúp đỡ tơi q trình làm đề tài - Tồn thể lớp CNSH29 hỗ trợ động viên suốt thời gian học tập trƣờng - Thành kính ghi ơn ba mẹ ngƣời thân gia đình ln tạo điều kiện động viên để đạt đƣợc thành nhƣ ngày hôm Tháng năm 2007 Nguyễn Hồng Phong iii TÓM TẮT NGUYỄN HỒNG PHONG – Lớp DH03SH, Đại học Nông Lâm Tp HCM Đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne (Ananas comosus) phƣơng pháp RAPD” dƣới hƣớng dẫn TS Trần Thị Dung CN Lƣu Phúc Lợi đƣợc thực Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh khu nhà lƣới bảo vệ thực vật khoa Nông học Đại học Nông Lâm Tp HCM Nội dung nghiên cứu gồm: Đánh giá đa dạng di truyền giống dứa Cayenne Tp HCM kỹ thuật RAPD Nuôi rệp sáp tiến hành lây nhiễm virus PMWaV thông qua vector rệp sáp Xác định marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne Các kết thu đƣợc: Kết phân nhóm di truyền cho thấy nhóm Cayenne đối chứng Queen có hệ số tƣơng đồng 0,9 Nhóm dứa Cayenne phân thành nhóm nhỏ: nhóm gồm giống Cayenne Trung Quốc Thái Lan, nhóm giống Lâm Đồng Mức tƣơng đồng nhóm khoảng 0,92 Kết kiểm tra độ tin cậy phần mềm winboot cho thấy phân nhóm di truyền tạo có độ tin cậy cao Kết ni rệp sáp cho thấy rệp phát triển tốt bí đỏ điều kiện 25-26oC rệp phát triển tốt điều kiện 33-34oC Đã lây nhiễm đƣợc bệnh héo đỏ đầu lên dứa Cayenne với tỷ lệ 35,66% có biểu bệnh Chƣa phát đƣợc marker liên kết rõ ràng với kiểu hình kháng bệnh héo đỏ đầu iv SUMMARY Studying genetic diversity and detect markers associated with resistance to wilt disease in cayenne pineapple by RAPD-PCR Supervisor: Tran Thi Dung1; Luu Phuc Loi1, BSc Student: Nguyễn Hồng Phong1 Department of Biotechnology, Nong Lam university, Ho Chi Minh city Cayenne pineapple is an important crop in Ho Chi Minh city for domestic consumption and export But today most varietys have been plant is imports and have many pests, especially wilt disease To develop pineapple industry of this area, its need to research genetic variation of varietys in this area and find the type of wilt resistance In this study, we analysed genetic variation of varietys of Cayenne pineapple in Ho Chi Minh city and found markers associated with wilt resistant trait by using 32 primer RAPD and received these results: - primers gave DNA polymorphisms in Cayenne varietys and controls OPAC10 have hightest allen number in Cayenne UPGMA and bootstrap analysis on the basis of RAPD data clearly showed that Cayenne varietys belong to two major clusters with 92% similarity The first cluster includes Thailand and China varietys with 98% similarity The Second cluster is Lam Dong variety - The results of rearing mealybug show that mealybug can grow on pumpkin and the development of mealybug at 25 – 26oC is better than 33 – 34oC - Two primers gave most DNA polymorphisms in pineapple when analysed genetic variation were used to detect marker associated with wilt resistant trait in Cayenne pineapple But non marker was detected v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt x Danh sách hình biểu đồ xi Danh sách bảng xiii Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu, nội dung yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Nội dung 1.2.3 Yêu cầu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung dứa 2.1.1 Phân loại nguồn gốc 2.1.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ dứa 2.1.2.1 Việt Nam 2.1.2.2 Thế giới 2.1.3 Các nhóm dứa 2.1.3.1 Nhóm Queen 2.1.3.2 Nhóm Tây Ban Nha 2.1.3.3 Nhóm Cayenne 2.2 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền phát thị 2.2.1 Giới thiệu chung tính đa dạng di truyền thị 2.2.2 Chỉ thị hình thái vi 2.2.3 Chỉ thị isozyme 2.2.4 Chỉ thị phân tử – thị DNA 2.2.5 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 10 2.3 Các phƣơng pháp chủ yếu tạo phát sinh loài 11 2.4 Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử phân tích đa dạng di truyền dứa Thế Giới Việt Nam 12 2.4.1 Nghiên cứu Thế Giới 12 2.4.2 Nghiên cứu Việt Nam 13 2.5 Bệnh héo virus 14 2.5.1 Lịch sử phát virus PMWaV 14 2.5.2 Tác nhân lây truyền bệnh 16 2.5.3 Triệu chứng 18 2.5.4 Cách phòng trị 19 2.6 Marker liên kết tính kháng bệnh thực vật 20 2.6.1 Tính kháng bệnh thực vật 20 2.6.1.1 Kháng bệnh đơn gene (monogenic resistance) 21 2.6.1.2 Kháng bệnh đa gene (polygenic resistance) hay QTL kháng 21 2.6.2 Xác định marker phân tử liên kết gen kháng bệnh thực vật 21 2.6.3 Một số nghiên cứu phát marker phân tử cho tính kháng bệnh thực vật kỹ thuật RAPD 22 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Đánh giá đa dạng di truyền giống dứa Cayenne Tp Hồ Chí Minh 23 3.1.1 Thời gian địa điểm 23 3.1.2 Đối tƣợng 23 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 23 3.1.4 Hóa chất 24 3.1.5 Phƣơng pháp tiến hành 24 3.1.5.1 Ly trích DNA tổng số từ dứa 24 vii 3.1.5.2 Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 26 3.1.5.3 Thực phản ứng RAPD 28 3.1.5.4 Phân tích đa dạng di truyền phần mềm NTSYS Winboot 28 3.2 Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu cho dứa Cayenne 30 3.2.1 Thời gian địa điểm 30 3.2.2 Đối tƣợng 30 3.2.3 Dụng cụ 30 3.2.4 Phƣơng pháp tiến hành 31 3.2.4.1 Nuôi rệp 31 3.2.4.2 Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh 31 3.2.4.3 Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa bệnh 32 3.3 Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne 33 3.3.1 Thời gian địa điểm 33 3.3.2 Đối tƣợng 33 3.3.3 Dụng cụ thiết bị 33 3.3.4 Hóa chất 33 3.3.5 Phƣơng pháp 33 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Đánh giá đa dạng di truyền dứa Cayenne kỹ thuật RAPD 35 4.1.1 Kết ly trích DNA tổng số từ dứa 35 4.1.2 Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 35 4.1.3 Thực phản ứng RAPD 36 4.1.4 Phân tích đa dạng di truyền phần mềm NTSYS Winboot 40 4.2 Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu cho dứa Cayenne 43 4.2.1 Nuôi rệp 43 4.2.2 Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh 45 4.2.3 Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa bệnh 46 4.3 Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình khơng biểu bệnh héo viii đỏ đầu dứa Cayenne 48 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Đề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT EB extraction buffer EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate OD Optical density OUT Operational Taxonomic Unit PCR Polymerase Chain Reaction PMWaV Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus QTL Quantivative Trait Locus RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TAE Tris – Acetate – EDTA TE Tris – EDTA Tm Melting temperature x ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas... tạo giống dứa có tính kháng bệnh Vì vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu đa dạng di truyền xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne (Ananas comosus) phƣơng pháp RAPD ” đƣợc thực với... tích đa dạng di truyền giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng Tp Hồ Chí Minh Xác đinh marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne 1.2.2 Nội dung Đánh giá đa dạng di truyền
![Hình 2.5 Bọ rùa Cryptolaemus montrouzieri [10] a: Ấu trùng; b: Bọ rùa trƣởng thành - Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa cayenne bằng phương pháp rapd](https://media.store123doc.com/figures/001/354/hinh-bo-cryptolaemus-montrouzieri-au-trung-trong-thanh-1354617.png)
![Hình 2.6 Ong bắp cày Anagyrus ananatis [10] - Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa cayenne bằng phương pháp rapd](https://media.store123doc.com/figures/001/354/hinh-ong-bap-cay-anagyrus-ananatis-1354618.png)
![Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng RAPD [16] Số chu kỳ Nhiệt độ (0 - Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa cayenne bằng phương pháp rapd](https://media.store123doc.com/figures/001/354/bang-trinh-nhiet-phan-ung-rapd-nhiet-do-1354620.png)
