Đang tải... (xem toàn văn)
Khảo sát hoạt tính và tinh sạch Protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae và Aspergillus Kawasaki trên môi trường bán rắn
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ĐẬU THỊ KIM DUNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN Luận văn kỹ sƣ Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện : TS. NGUYỄN NGỌC HẢI ĐẬU THỊ KIM DUNG PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Khóa : 2002 - 2006 CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING ACTIVITY OF PROTEASE AND PURIFYING PROTEASE EXTRACTING FROM TWO FUNGAL SPECIES ASPERGILLUS ORYZAE AND ASPERGILLUS KAWASAKI ON SEMI SOLID MEDIUM Graduation thesis Major : Biotechnology Professors : Student : PhD. NGUYEN NGOC HAI ĐAU THI KIM DUNG Vice Professor-PhD. NGUYEN TIEN THANG Term : 2002 - 2006 BA. ĐO THI TUYEN HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến : * Ban Giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. * Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn, giải đáp mọi thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. * Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn tất khóa luận này. * Anh Nguyễn Diên Sanh, anh Nguyễn Duy Long là những cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã hỗ trợ cũng nhƣ cung cấp cho em nhiều kiến thức xung quanh đề tài. * Các bạn lớp CNSH K28 đã động viên, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn cũng nhƣ chia xẻ những vui buồn trong suốt thời gian học tập. * Các bạn phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. * Cuối cùng con xin cảm ơn bố mẹ đã, đang và mãi mãi là chỗ dựa vững chắc cả về tinh thần lẫn vật chất cho con niềm tin và động lực bƣớc vào đời. TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đậu Thị Kim Dung, Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Tháng 9/2006. “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC v ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN”. Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10/2/2006 đến ngày 1/6/2006 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM. Hội đồng hƣớng dẫn : PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG TS. NGUYỄN NGOC HẢI CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Chế phẩm enzyme thô dạng bột của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki đƣợc chiết bằng nƣớc cất, thu đƣợc dịch chiết enzyme thô. Dịch chiết thô này đƣợc tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60, 65, 70, 75 và cồn 960 ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 Cặn tủa thu đƣợc hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính protease nhằm tìm ra nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease. Từ đó khảo sát điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease từ dịch tủa enzyme thu đƣợc từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm đƣợc chạy qua sắc ký lọc gel và xác định trọng lƣợng phân tử protease bằng điện di. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau : Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ƣu để tủa protease. Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 470C. Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus kawasaki. MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa . i Trang tựa ii vi Lời cảm tạ iii Tóm tắt khóa luận . iv Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt . viii Danh sách các bảng ix Danh sách các hình và đồ thị xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU . 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích nghiên cứu . 2 1.3 Yêu cầu 2 2.1 Khái quát chung về enzyme 3 2.1.1 Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme . 3 2.1.2 Định nghĩa về enzyme 5 2.1.3 Phân loại enzyme 6 2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme 7 2.1.4.1 Hoạt tính enzyme . 7 2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme . 7 2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống 9 2.1.5.1 Nguồn thu nhận . 9 2.1.5.2 Vai trò 11 2.2 Khái quát chung về enzyme protease 11 2.2.1 Định nghĩa enzyme protease 11 2.2.2 Lƣợc sử phát triển các enzyme protease 12 2.2.2.1 Protease từ động vật 12 2.2.2.2 Protease từ thực vật . 12 2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật 13 2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease . 13 2.2.3.1 Từ động vật 13 2.2.3.2 Từ thực vật . 13 2.2.3.3 Từ vi sinh vật . 14 2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease 14 2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 15 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae . 15 2.3.1.1 Phân loại . 15 2.3.1.2 Đặc điểm 15 2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt 16 2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease . 18 2.5.1 Trích ly enzyme 19 2.5.2 Quá trình tủa 20 2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký . 22 2.5.4 Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS – PAGE . 27 PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 29 3.1 Thời gian và địa điểm 29 3.2 Vật liệu 29 3.2.1 Chế phẩm enzyme thô 29 3.2.2 Hóa chất 29 vii 3.2.3 Thiết bị 29 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 30 3.3.1 Bố trí thí nghiệm . 30 3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lƣợng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme thô 30 3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa enzyme protease 36 3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động của protease 37 3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel 37 3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme bằng phƣơng pháp điện di SDS – PAGE . 41 3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu . 44 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45 4.1 Hàm lƣợng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô 45 4.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ƣu cho việc tủa protease 45 4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 46 4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki . 48 4.3 Tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease . 49 4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 49 4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki . 51 4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960 và tủa bằng muối (NH4)2SO4 53 4.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease 54 4.5.1 pH tối ƣu . 54 4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae 54 4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki 54 4.5.2 Nhiệt độ tối ƣu 55 4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae . 55 4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 56 4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel . 56 4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae . 57 4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki 59 4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki . 62 4.7.1 Tủa protease bằng muối 62 4.7.2 Tủa protease bằng cồn 62 4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di trên gel SDS – PAGE . 63 PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ . 67 5.1 Kết luận 67 5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae . 67 5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki 67 5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 68 5.2 Đề nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 69 PHỤ LỤC 70 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ Asp.oryzae : Aspergillus oryzae Asp.kawasaki : Aspergillus kawasaki CP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp). ix CBB : Coomasie Brilliant Blue. ĐVHT : Đơn vị hoạt tính. HT : Hoạt tính HTR : Hoạt tính riêng. TCA : Trichloacetic acid A.U : Độ hấp thụ. mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lƣờng độ dẫn điện). UI : Đơn vị hoạt tính enzyme. DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein 22 Bảng 3.1 Đƣờng chuẩn Albumin . 32 x Bảng 3.2 Đƣờng chuẩn Tyrosine . 34 Bảng 3.3 Khối lƣợng (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ 36 Bảng 3.4 Thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ. 36 Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein của dịch chiết enzyme thô của hai chủng Asp.oryzae và Asp. kawasaki . 45 Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 46 Bảng 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 46 Bảng 4.4 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 48 Bảng 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối . 48 Bảng 4.6 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 50 Bảng 4.7 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 50 Bảng 4.8 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 51 Bảng 4.9 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1 g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 52 Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. 53 Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH 54 Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH 55 Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ . 55 Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ 56 Bảng 4.15 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel . 59 Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel 61 Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng muối 62 [...]... enzyme hoạt động là khác nhau Do đó, để sử dụng enzyme hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ƣu cho hoạt động của enzyme đó Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài : Khảo sát hoạt tính và tinh sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki trên môi trƣờng... protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspgillus kawasaki So sánh hoạt tính enzyme protease giữa hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 1.3 Yêu cầu Thu nhận enzyme , xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa và tỷ lệ cồn tối ƣu trong việc tủa enzyme - bƣớc đầu trong quá trình tinh sạch enzyme Xác định pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme protease Tinh. .. hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp .oryzae 54 Đồ thị 4.7 Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp .kawasaki 55 Đồ thị 4.8 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp .oryzae 55 Đồ thị 4.9 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp .kawasaki 56 Đồ thị 4.10 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa protein... sung vào thức ăn của lợn và gia cầm Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn đƣợc dùng để tái sinh các nguyên liệu nhƣ phim điện ảnh, phim Rơnghen Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tƣơng gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý 2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. .. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng cồn đối với Aspergillus kawasaki 60 ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp .oryzae và Asp .kawasaki 45 Đồ thị 4.2 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp .oryzae khi tủa protease bằng muối... Giống : Aspergillus Loài : Aspergillus oryzae 2.3.1.2 Đặc điểm Hình thái Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty 16 Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae. .. Đồ thị 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp .kawasaki khi tủa protease bằng muối 49 Đồ thị 4.4 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp .oryzae khi tủa protease bằng cồn 51 Đồ thị 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp .kawasaki khi tủa protease bằng cồn 52... 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P-100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus oryzae 58 Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng cồn đối với nấm Aspergillus oryzae 58 Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus kawasaki 60 Hình... dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 100C Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme đƣợc xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme 2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký Sắc ký sinh học là phƣơng pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng Các kỹ thuật sắc ký tinh sạch. ..Bảng 4.18 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng cồn 62 Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của những protein trong thang 65 Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 3 của Asp .oryzae 66 Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 2 của Asp .kawasaki 66 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ HÌNH TRANG . 9/2006. “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC v ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN”.. việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài : Khảo sát hoạt tính và tinh sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus