Đang tải... (xem toàn văn)
Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò - lời cảm tạ
LỜI CẢM TẠTôi xin chân thành gởi lời cảm tạ với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến:* Gia đình đã tạo cho tôi chỗ dựa vững chắc về vật chất lẫn tinh thần. Ba mẹ đã luôn sát cánh bên tôi, nuôi dưỡng chăm sóc tôi nên người, động viên tôi học tập.* Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hố Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiết thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.* PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn cùng những hỗ trợ rất thiết thực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp cũng như nâng cao kiến thức.* BSTY. Bùi Thị Thu Trang đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt khóa luận này.* Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.* BSTY. Lê Hữu Ngọc, phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi trường, Khoa CNTY Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.* Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.Chân thành cảm ơnĐoàn Thị Tuyết Lêiii TÓM TẮTĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Tháng 8/2005. “ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”.Hội đồng hướng dẫn:PGS. TS. Nguyễn Ngọc TuânBSTY. Bùi Thị Thu TrangĐề tài được thực hiện nhằm xác định các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo, bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR. Ghi nhận được khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC; trên SMAC có 2 loại: khuẩn lạc hồng và khuẩn lạc trắng; khuẩn lạc trắng trên CT-SMAC. Mỗi nhóm chọn khoảng 6 – 10 khuẩn lạc riêng lẻ. Ly trích DNA theo nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ theo phương pháp nhiệt. Kết quả multiplex - PCR được ghi nhận như sau:(1) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực đó.(2) Tần số phát hiện các gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần lượt là: 25% trên phân bò tiêu chảy (stx2, hly), 30% trên phân bê tiêu chảy (stx1, stx2, hly, eae), 88,89% trên phân heo tiêu chảy (stb, lt, vt2e, hly, stx1, eae). Điều này chứng tỏ rằng trên cả 3 nhóm đối tượng trên, E. coli mang các gen độc lực có thể là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy.(3) 9 mẫu bề mặt thịt bò chưa phát hiện được gen độc lực của E. coli.(4) Chưa phát hiện được gen sta trong E. coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, bê và heo.iv SUMMARY“Apply multiplex – PCR to detect some virulence genes of Escherichia coli isolated from diarrhea cattle and swine faeces, beef”The study was carried out to detect stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e genes of isolated E. coli from 27 diarrhea stools samples of cattles, calves, piglets, and 9 swabs of the beef surface by multiplex – PCR. Observation had one group of pink colony on MAC, white colony on SMAC, pink colony on SMAC, white colony on CT-SMAC. Each colony group was chosen about 6 – 10 separate colonies. DNA of the colony groups and each separate colony were extracted by heat method. The results of multiplex – PCR were showed that:(1) The colony group has virulence genes, the separate colony does or doesn’t have the genes.(2) Frequency of virulence genes of isolated E. coli from diarrhea stools samples was 25% from cattles (stx2, hly), 30% from calves (stx1, stx2, eae, hly), 88,89% from piglets (stb, lt-I, vt2e, hly, stx1, eae).(3) 9 swabs of the beef surface were detected that non virulence genes of E. coli.(4) Sta gene of E. coli isolated from 27 diarrhea cattle, calf, piglet stools samples weren’t detected.v MỤC LỤCCHƯƠNG TRANGTrang tựaLời cảm tạ iiiTóm tắt ivSummary .vMục lục viDanh sách các chữ viết tắt viiiDanh sách các hình .xDanh sách các bảng xi1. ĐẶT VẤN ĐỀ 12. TỔNG QUAN .32.1. Vi khuẩn E. coli 32.1.1. Định nghĩa .32.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa 32.1.3. Yếu tố kháng nguyên .42.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli 42.1.5. Phân loại E. coli .42.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC .42.1.5.2. Nhóm EPEC .72.1.53. Nhóm ETEC 82.2. Kỹ thuật PCR .112.2.1. Nguyên tắc 112.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR .122.2.3. Các thành phần của phản ứng PCR 142.2.4. Phân tích kết quả PCR .152.2.5. Những ứng dụng của PCR .152.2.5.1. PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ .152.2.5.2. PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng .162.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA .16vi 2.2.5.4. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau .172.2.6. Các hạn chế của PCR .173. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .193.1. Thời gian và địa điểm thực hiện .193.2. Nội dung 193.3. Phương pháp nghiên cứu 193.3.1. Lấy mẫu 193.3.2. Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli .203.3.3. Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của E. coli phân lập được 233.3.4. Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di 254. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 274.1. Kết quả phân nhóm khuẩn lạc và xác định E. coli từ các khuẩn lạc phân lập được 274.1.1. Các loại khuẩn lạc trên môi trường thạch MAC, SMAC, và CT-SMAC 274.1.2. Xác định E. coli cho các khuẩn lạc được chọn .274.2. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy 284.3. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo tiêu chảy .324.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy 364.5. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò 384.6. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát .395. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .415.1. Kết luận 415.2. Đề nghị .416. TÀI LIỆU THAM KHẢO 427. PHỤ LỤC .46vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮTA/A : Aggregative adhesionA/E : Attaching and effacingCF : Colonization factorCFA : Colonization factor antigenCT : Cholera toxinCT-SMAC :Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey agarDNA : Deoxyribonucleic aciddNTP : Deoxyribonucleotide triphosphateeae : E. coli attaching and effacingEaggEC = EAEC : Enteroaggregative E. coliEHEC : Enterohaemorrhagic E. coliEIEC : Enteroinvasive E. coliEMB : Eosin methylen blue agarEPEC : Enterophathogenic E. coliETEC : Enterotoxigenic E. coli FAO : Food and Agriculture OrganizationHC : Haemorrhagic colitisHly : HaemolysinHM : Khuẩn lạc hồng trên môi trường MACHS : Khuẩn lạc hồng trên môi trường SMACHUS : Haemolytic uraemic syndromeIMViC : Indol, Methyl Red, Voges - Proskauer, Simmon CitrateLEE : Locus of enterocyte effacementLT : Heat labile toxinMAC : MacConkey agarNA : Nutrient agarPCR : Polymerase chain reactionSMAC : Sorbitol MacConkey agarST : Heat stable toxinviii STEC : Shiga toxin-producing E. coliStx : Shiga toxinTBE : Tris borate EDTATC : Khuẩn lạc trắng trên môi trường CT-SMACTCVN : Tiêu chuẩn Việt NamTir : Translocated intimin receptorTm : Melting temperatureTS : Khuẩn lạc trắng trên môi trường SMACUV : Ultra violetVT : VerotoxinVTEC : Verotoxigenic E. coli ix DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒHÌNH TRANGHình 2.1. Nguyên lý của phản ứng PCR 13Hình 2.2. Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR .14Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR1 26Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR2 26SƠ ĐỒSơ đồ 3.1. Phân lập, xác định E. coli và phát hiện gen độc lực 22BIỂU ĐỒBiểu đồ 4.1. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát .40x DANH SÁCH CÁC BẢNGBẢNG TRANGBảng 3.1. Số lượng mẫu .20Bảng 4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong phân bò tiêu chảy 29Bảng 4.2. Kết quả phát hiện gen stx1, stx2, eae, hly của một số khuẩn lạc E. coli riêng lẻ phân lập được từ phân bò tiêu chảy .30Bảng 4.3. Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong phân heo tiêu chảy 33Bảng 4.4. Kết quả phát hiện các gen độc lực cho một số khuẩn lạc E. coli riêng lẻ phân lập được từ phân heo tiêu chảy .35Bảng 4.5. Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong phân bê tiêu chảy 36Bảng 4.6. Kết quả phát hiện các gen độc lực của nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong mẫu bề mặt thịt bò 38Bảng 4.7. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát .39xi . MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”.Hội đồng hướng dẫn:PGS. TS.. thực hiện nhằm xác định các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo,