-1- -2- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Cơng trình hồn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG -
 - NGUYỄN BÁ KHOA Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRỊNH THỊ THUỶ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ THĂM DỊ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUẢ NGŨ VỊ TỬ Phản biện 1: TS BÙI XUÂN VỮNG Phản biện 2: PGS.TS TRẦN VĂN THẮNG (SCHISANDRA SPHENANTHERA) Chuyên ngành : HOÁ HỮU CƠ Mã số 60.44.27 : Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 26 tháng năm 2011 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Có thể tìm hiểu luận văn tại: – Trung tâm Thông tin-Học liệu, Đại học Đà Nẵng ĐÀ NẴNG – NĂM 2011 – Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng -3- -4- MỞ ĐẦU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4.1 Nghiên cứu lý thuyết – Tổng quan tài liệu: Thu thập tài liệu nước liên quan ñến Ngũ vị tử Lý giải lý lựa chọn, ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài – Nghiên cứu tài liệu tham khảo có liên quan ñến phương pháp chiết tách, xác ñịnh cấu trúc 4.2 Thực nghiệm – Thu thập mẫu, xử lý mẫu, xác ñịnh tên khoa học mẫu – Khảo sát ñiều kiện chiết: + Chọn dung môi chiết mẫu: methanol, n-hexan, chloroform, + Chọn ñiều kiện tối ưu ñể phân tách cấu tử: hệ dung môi, chất mang, – Phương pháp ñịnh danh sơ thành phần hố học: phân tích sắc ký lớp mỏng – Phương pháp phân lập chất: phân tách sắc ký cột chất mang khác với hệ dung mơi thích hợp – Xác định cấu trúc hố học chất sạch: ño phổ ESI-MS, 1HNMR, 13C-NMR, DEPT – Thăm dị hoạt tính sinh học: thử hoạt tính chống ung thư thơng qua thử hoạt tính gây độc tế bào Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 5.1 Ý nghĩa khoa học – Cung cấp thông tin khoa học quy trình chiết tách, xác định thành phần hố học hoạt tính sinh học Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera Kon Tum – Cung cấp thông tin, tư liệu làm sở cho việc nghiên cứu sau 5.2 Ý nghĩa thực tiễn – Cơ sở khoa học góp phần giải thích tác dụng Ngũ vị tử y học cổ truyền LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Cây Ngũ vị tử (Schisandra sphenanthera Rehd Et Wils.) loài thuốc phát có Việt Nam vào năm 2007 Theo ñiều tra nhà thực vật đồng bào dân tộc huyện Trà My, tỉnh Quảng Nam ñồng bào Tây Nguyên dùng trị bệnh gan tốt [2] Người dân dùng hạt chữa bệnh gan, mật Nước sắc hạt làm giảm men gan tới 55% trường hợp bị bệnh [2], [16] Kết tổng hợp Từ ñiển hợp chất thiên nhiên [Dictionary of Natural Product Version 18:1 (2009)] cịn cho biết có tác dụng ức chế virus HIV tế bào ung thư máu P388 [17] Tuy nhiên có cơng bố thành phần hố học hoạt tính sinh học Việt Nam Vì nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính sinh học Ngũ vị tử có ý nghĩa khoa học triển vọng ứng dụng thực tế cao Kết nghiên cứu sở khoa học để góp phần ñánh giá tài nguyên thuốc miền Trung Tây Nguyên, xây dựng sở khoa học cho việc bảo tồn ña dạng sinh học khai thác sử dụng nguồn gien quý này, góp phần chăm sóc sức khoẻ cộng đồng phát triển kinh tế xã hội Xuất phát từ thực tế đó, chúng tơi chọn đề tài luận văn: “Nghiên cứu thành phần hố học thăm dị hoạt tính sinh học Ngũ vị tử (Schisandra sphenanthera)” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU – Xác định thành phần hố học Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera – Thăm dị hoạt tính sinh học dịch chiết chất tách ñược từ Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Quả Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera ñược thu hái tự nhiên xã Ngọc Lây, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum vào tháng năm 2010 -5- -6- – Nâng cao hiểu biết hợp chất thiên nhiên để giảng dạy mơn Hố học nhà trường phổ thơng tốt CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN Luận văn gồm có 82 trang khơng kể phụ lục, có 13 biểu bảng, 19 hình 07 sơ đồ, bố cục sau: Mở ñầu: 03 trang Chương 1: Tổng quan tài liệu: 35 trang Chương 2: Thực nghiệm phương pháp nghiên cứu: 09 trang Chương 3: Kết thảo luận: 29 trang Kết luận kiến nghị: 01 trang Tài liệu tham khảo: 05 trang Quyết ñịnh giao ñề tài luận văn Phụ lục 1.2.2.2 Nortriterpenoid 1.2.3 Hoạt tính sinh học 1.2.4 Sinh tổng hợp 1.2.4.1 Lignan 1.2.4.2 Nortriterpenoid 1.3 Phương pháp phân lập, chiết tách hoạt chất từ mẫu thực vật 1.3.1 Phương pháp chiết 1.3.1.1 Chiết lỏng – lỏng 1.3.1.2 Chiết lỏng – rắn 1.3.2 Phương pháp chưng cất 1.3.2.1 Chưng cất ñơn giản áp suất thường 1.3.2.2 Chưng cất phân ñoạn áp suất thường 1.3.2.3 Chưng cất áp suất thấp 1.3.2.4 Chưng cất hỗn hợp đẳng phí 1.3.2.5 Chưng cất lơi nước 1.3.3 Phương pháp kết tinh 1.3.4 Chiết, tách chất phương pháp sắc ký 1.3.4.1 Sắc ký lớp mỏng 1.3.4.2 Sắc ký cột 1.4 Các phương pháp vật lí xác định cấu trúc hố học chất tách từ mẫu thực vật 1.4.1 Phương pháp phổ hồng ngoại IR (Infrared Spectroscopy) 1.4.2 Phương pháp phổ tử ngoại, khả kiến UV–VIS (Ultraviolet – Visible Spectroscopy) 1.4.3 Phương pháp khối phổ MS (Mass Spectroscopy) 1.4.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát Ngũ vị tử 1.1.1 Vài nét họ Ngũ vị Schisandraceae 1.1.1.1 Chi Kadsura (Nam Ngũ vị) 1.1.1.2 Chi Schisandra (Bắc Ngũ vị) 1.1.2 Cây Ngũ vị tử (Schisandra) 1.1.2.1 Mô tả thực vật 1.1.2.2 Sự phân bố 1.1.2.3 Tác dụng sinh học 1.1.2.4 Một số kết nghiên cứu thành phần hố học lồi Schisandra sphenanthera 1.2 Hóa học hợp chất lignan, nortriterpenoid–hai nhóm chất Ngũ vị tử 1.2.1 Phân loại cấu trúc 1.2.1.1 Lignan 1.2.1.2 Nortriterpenoid 1.2.2 Tồn thiên nhiên 1.2.2.1 Lignan CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất -7- -8- 2.1.1 Thiết bị, dụng cụ hoá chất dùng cho nghiên cứu hoá học 2.1.1.1 Thiết bị, dụng cụ – Bể siêu âm, bếp ñiện, tủ sấy, quay cất chân khơng, cân kỹ thuật, cân điện tử phân tích, cột chạy sắc ký, mỏng sắc ký, ñèn tử ngoại UV, số dụng cụ thuỷ tinh bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm, pipet, – Các máy ño phổ: + ESI-MS: Agilent 6310 Ion Trap + NMR: Bruker Advance 500 spectrometer [499,8 MHz (1HNMR) 125 MHz (13C-NMR, DEPT)] Tín hiệu TMS dùng làm chuẩn cho phổ 1H-NMR (δ = ppm); tín hiệu dung môi CDCl3 (δ = 77,0 ppm) CD3OD (δ = 49,0 ppm) ñược dùng làm chuẩn cho phổ 13C-NMR 2.1.1.2 Hố chất – Các loại dung mơi dùng để ngâm, chiết mẫu loại dung môi công nghiệp ñược tinh chế lại cách cất phân ñoạn, loại dung mơi dùng để sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng loại tinh khiết phân tích (PA) – Sắc ký lớp mỏng phân tích: sử dụng mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck), có độ dày 0,2 mm Các SKLM sau sấy khơ soi ñèn tử ngoại (UV – BIOBLOCK) bước sóng λ = 254 nm 365 nm Thuốc thử ñể màu vanilin/H2SO4, sau ñó sấy nhiệt ñộ 1000C – Sắc ký cột: silicagel 60, 0,063 – 0,200 mm (Merck) cho cột ñầu, silicagel 60, 0,040 – 0,063 mm (Merck) cho cột Sắc ký cột lọc gel dùng Sephadex LH-20 (Merck) Bảng 2.1 Các dung môi hệ dung môi triển khai SKLM SKC TT Hệ dung môi Methanol n-Hexan Chloroform Ethyl acetat Tỉ lệ n-Butanol 9:1→1:9 10 : 8:1 n-Hexan/Diclometan 9:1→1:9 Diclometan/Methanol 95 : 15 Diclometan/Ethyl acetat 8:2 dụng cụ hố chất dùng thử hoạt tính n-Hexan/Ethyl acetat 2.1.2 Thiết bị, sinh học 2.1.2.1 Thiết bị, dụng cụ Tủ ấm CO2 (INNOVA CO–170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II (SteriGard II), máy li tâm (Universal 320R), kính hiển vi ngược (Aciovert 40 CFL), tủ lạnh sâu -250C, -800C, buồng ñếm tế bào (Fisher, Hoa Kỳ), máy quang phổ (Genios Tecan), bình nitơ lỏng bảo quản tế bào dụng cụ thí nghiệm thơng thường khác 2.1.2.2 Các dòng tế bào Các dòng tế bào ung thư người: – KB (Human epidermic carcinoma): ung thư biểu mơ dịng ln sử dụng phép thử ñộc tế bào – HepG2 (Hepatocellular carcinoma): ung thư gan – Lu (Human lung carcinoma): ung thư phổi – MCF7 (Human breast carcinoma): ung thư vú 2.2 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu mẫu cây, xác ñịnh tên khoa học phương pháp xử lý mẫu – Nguyên liệu ñể nghiên cứu gồm Ngũ vị tử ñược thu hái tự nhiên xã Ngọc Lây, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum – Cây Ngũ vị tử Kon Tum, gọi Ni (theo đồng bào dân tộc), có tên khoa học là: “Schisandra sphenanthera”, chi Schisandra, họ Schisandraceae – Quả già sau thu hái ñược làm sạch, phơi khơ sấy nhiệt độ 50 – 600C, nghiền nhỏ thành bột -9- -10- 2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất từ dịch chiết Quả Ngũ vị tử ñược nghiền nhỏ thành bột chiết lần với methanol nhiệt ñộ 600C Sau cất loại dung mơi áp suất giảm, thu cao chiết tổng Bổ sung thêm nước cất vào cao chiết tổng, lắc Sau chiết phân bố dung mơi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-butanol Cất loại dung môi áp suất giảm, thu cặn chiết thơ khác Các cặn chiết thơ phân chia sắc ký cột silicagel lọc gel Sephadex LH-20 (kết hợp với sắc ký lớp mỏng) với hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân ñoạn kết tinh lại hệ dung mơi thích hợp để thu chất 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hố học hợp chất ñã ñược phân lập Các chất kết tinh phân lập ñược ño loại phổ như: phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR DEPT) tuỳ theo loại chất Các số liệu phổ thực nghiệm chất ñược dùng ñể nhận dạng cấu trúc hoá học chúng 2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học Phương pháp thử độ ñộc tế bào in vitro ñược Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận phép thử ñộ ñộc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát chất có khả kìm hãm phát triển diệt tế bào ung thư ñiều kiện in vitro Các dịng tế bào ung thư nghiên cứu ni cấy mơi trường ni cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết phơi bị (FBS) thành phần cần thiết khác ñiều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 370C, độ ẩm 98%, vơ trùng tuyệt đối) Tùy thuộc vào đặc tính dịng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển khác Tế bào phát triển pha lỏng ñược sử dụng để thử độc tính Qui trình thử độc tế bào: Cho 200 µl dung dịch tế bào pha lỏng nồng độ × 104 tế bào/ml vào giếng (đĩa 96 giếng) mơi trường RPMI 1640 cho dịng tế bào HepG2, MCF7, KB; mơi trường DMEM cho dịng tế bào Lu Mẫu thử xử lý với tế bào nồng độ pha lỗng khác cho ñạt ñến nồng ñộ cuối 128 µg/ml; 32 µg/ml; µg/ml; µg/ml; 0,5 µg/ml Ủ 37oC, 5% CO2 ngày Giếng ñiều khiển gồm 200 µl dung dịch tế bào nồng độ × 104 tế bào/ml ủ 370C, 5% CO2 ngày, thêm 50 µl MTT (1mg/ml pha mơi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 37oC giờ, loại bỏ mơi trường, thêm 100 µl DMSO, lắc ñều, ñọc kết bước sóng 540 nm máy spectrophotometer Genios TECAN Phần trăm kìm hãm phát triển tế bào (Growth inhibition) = (OD ñiều kiển – OD mẫu) / OD ñiều kiển Giá trị IC50 ñược tính dựa kết số liệu phần trăm kìm hãm phát triển tế bào phần mềm máy tính table curve Các dịch chiết chất tách thử hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư như: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu) ung thư vú (MCF7) Nếu mẫu IC50 ≤ 128 µg/ml coi có hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư Mẫu thơ có IC50 ≤ 50 µg/ml chất có IC50 ≤ 30 µg/ml đánh giá có hoạt tính mạnh gây độc tế bào, có khả ức chế mạnh phát triển diệt tế bào ung thư [18], [28] 2.3 Thực nghiệm 2.3.1 Chiết suất, phân lập tinh chế chất từ Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera Bột khơ Ngũ vị tử (1,85 kg) chiết lần với methanol thiết bị chiết siêu âm nhiệt ñộ 600C Sau cất loại dung mơi nhiệt độ ≤ 500C áp suất giảm thiết bị quay cất chân khơng, thu cao ñặc methanol SSM (135 gam) Bổ sung thêm 1,5 lít nước cất vào cao đặc, lắc Sau chiết phân bố dung mơi có ñộ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-butanol thiết bị phễu chiết Cất loại dung môi -11- -12- nhiệt ñộ ≤ 500C áp suất giảm thiết bị quay cất chân khơng, thu cặn chiết tương ứng là: n-hexan SSH (73,8 gam), chloroform SSC (49,7 gam), ethyl acetat SSE (5,5 gam) nbutanol SSB (3,1 gam) (Sơ ñồ 2.1) 2.3.1.1 Cặn chiết n-hexan SSH Cặn chiết n-hexan SSH (73,8 gam) ñược khảo sát thành phần hoá học sắc ký lớp mỏng tiến hành phân lập sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải n-hexan/ethyl acetat (tỉ lệ: 9/1 → 1/9), thu ñược 16 phân ñoạn (ký hiệu là: SSH01 → SSH16) (Sơ ñồ 2.2) Quả Ngũ vị tử Thu, xử lí Cặn chiết SSH Bột khơ (1,85 kg) (73,8 g) 1.Chiết methanol (3 lần) 2.Cất loại dung môi áp suất giảm Sắc ký cột (SKC), silicagel, n-hexan/ ethyl acetat (9/1 → 1/9), thu ñược 16 phân ñoạn Cao chiết tổng SSM (135 g) 1.Pha lỗng nước 2.Chiết n-hexan 3.Cất loại dung mơi áp suất giảm Cặn chiết SSH (73,8 g) Dịch nước 1.Chiết chloroform 2.Cất loại dung môi áp suất giảm NVT01 NVT02 Cặn chiết SSC (49,7 g) Dịch nước Phân ñoạn 14 Phân ñoạn 15 SSH14 SSH15 1.SKC, silicagel, n-hexan/ ethyl acetat (10/1), thu ñược phân ñoạn 2.Phân ñoạn 3, SKC, Sephadex LH-20, methanol 1.SKC, silicagel, n-hexan/ ethyl acetat (8/1), thu ñược phân ñoạn 2.Phân ñoạn 5, SKC, Sephadex LH-20, methanol NVT01 NVT02 (300 mg) (212 mg) 1.Chiết ethyl acetat 2.Cất loại dung mơi áp suất giảm NVT03 NVT04 Sơ đồ 2.2 Sơ ñồ phân lập hợp chất từ cặn dịch chiết n-hexan SSH Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera Cặn chiết SSE (5,5 g) Dịch nước 1.Chiết n-butanol 2.Cất loại dung môi áp suất giảm Cặn chiết SSB (3,1 g) Dịch nước Sơ ñồ 2.1 Sơ ñồ chiết, tách chất từ Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera – Chất NVT01: Phân ñoạn SSH14 ñược tinh chế sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải n-hexan/ethyl acetat (10/1), thu ñược phân ñoạn Phân ñoạn thu ñược chất tương ñối sạch, sau tinh chế tiếp cột Sephadex LH-20 với dung mơi rửa giải methanol, thu chất tinh khiết: NVT01 (300 mg, hàm lượng ñạt ≈ 0,016% tính theo hạt khơ) -13- -14- – Chất NVT02: Phân ñoạn SSH15 ñược tinh chế sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải n-hexan/ethyl acetat (8/1), thu ñược phân ñoạn Phân ñoạn thu ñược chất tương ñối sạch, sau ñó ñược tinh chế tiếp cột Sephadex LH-20 với dung môi rửa giải methanol Kết tinh dung môi n-hexan/ethyl acetat, thu ñược chất sạch: NVT02 (212 mg, hàm lượng ñạt ≈ 0,011% tính theo hạt khơ) – Chất NVT03: Phân ñoạn SSC07 ñược tinh chế sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải diclometan/methanol (95/15), thu ñược phân ñoạn Phân ñoạn thu ñược chất tương đối sạch, sau tinh chế tiếp cột Sephadex LH-20 với dung môi rửa giải methanol, thu ñược chất sạch: NVT03 (75 mg, hàm lượng đạt ≈ 0,004% tính theo hạt khơ) – Chất NVT04: Phân ñoạn SSC11 ñược tinh chế sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải diclometan/ethyl acetat (8/2), thu ñược phân ñoạn Phân ñoạn thu ñược chất tương ñối sạch, sau ñó ñược tinh chế tiếp cột Sephadex LH-20 với dung môi rửa giải methanol, thu ñược chất sạch: NVT04 (2,5 g, hàm lượng đạt ≈ 0,135% tính theo hạt khơ) 2.3.2 Xác định cấu trúc hố học chất tách ñược từ Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera Các chất tách (NVT01, NVT02, NVT03, NVT04) ñược xác ñịnh cấu trúc hoá học việc kết hợp phương pháp phổ: phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều 1D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR DEPT) tuỳ theo loại chất 2.3.3 Thử hoạt tính sinh học dịch chiết chất tách ñược từ Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera Các dịch chiết methanol (SSM), n-hexan (SSH), chloroform (SSC), ethyl acetat (SSE) n-butanol (SSB) với chất ñã ñược phân lập NVT01, NVT02 NVT04 ñược tiến hành thử hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư người: KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan), Lu (ung thư phổi) MCF7 (ung thư vú) 2.3.1.2 Cặn chiết chloroform SSC Cặn chiết chloroform SSC (49,7 gam) khảo sát thành phần hố học sắc ký lớp mỏng tiến hành phân lập sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải n-hexan/diclometan (tỉ lệ: 9/1 → 1/9), thu ñược 13 phân ñoạn (ký hiệu là: SSC01 → SSC13) (Sơ ñồ 2.3) Cặn chiết SSC (49,7 g) Sắc ký cột (SKC), silicagel, n-hexan/ diclometan (9/1 → 1/9), thu ñược 13 phân ñoạn Phân ñoạn 07 Phân ñoạn 11 SSC07 SSC11 1.SKC, silicagel, diclometan/ methanol (95/15), thu ñược phân ñoạn 2.Phân ñoạn 3, SKC, Sephadex LH-20, methanol 1.SKC, silicagel, diclometan/ ethyl acetat (8/2), thu ñược phân ñoạn 2.Phân ñoạn 6, SKC, Sephadex LH-20, methanol NVT03 NVT04 (75 mg) (2,5 g) Sơ ñồ 2.3 Sơ ñồ phân lập hợp chất từ cặn dịch chiết chloroform SSC Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nguyên tắc chung -15- -16- – Trong trình nghiên cứu hố thực vật cần phải tơn trọng ngun tắc chung khơng làm thay đổi cấu trúc hố học chất sẵn có thực vật khơng làm ảnh hưởng đến thành phần hố học chúng thời ñiểm lấy mẫu Như vậy, sau mẫu thu hái xong phải ñược diệt men ñể tránh chuyển hố q trình sinh tổng hợp xảy thực vật, sấy khô nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu điều kiện khơ – Để tách chất khỏi thực vật tiến hành theo hai cách phổ biến sau: Cách 1: Chiết phân lập hợp chất từ mẫu thực vật loại dung mơi có ñộ phân cực tăng dần: ete dầu hoả n-hexan, chloroform, ethyl acetat, methanol ethanol, Cách 2: Chiết tổng ancol (methanol, ethanol) hay hệ dung môi ancol/nước Sau tách loại hợp chất loại dung mơi có độ phân cực tăng dần cách để thu dịch chiết có chứa nhóm hợp chất có độ phân cực tương đối giống Việc chiết lấy chất từ mẫu thực vật: Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera ñược thực theo cách (Sơ ñồ 2.1, 2.2 2.3) – Các dịch chiết tổng số phần chiết thơ đem thử nghiệm với tác ñộng sinh học ñộc tố tế bào nhằm giúp cho việc định hướng tìm kiếm chất có hoạt tính sinh lý cao dịch chiết Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ñược nêu bảng 3.7 3.2 Phân lập nhận dạng hợp chất có dịch chiết khác Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera – Các dịch chiết từ Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera ñều hỗn hợp phức tạp chứa hợp chất khác Để phân lập chất khỏi hỗn hợp ñã sử dụng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng, chất hấp phụ dùng silicagel, lọc gel Sephadex LH-20, hệ dung mơi rửa giải thích hợp thường phải lặp lại nhiều lần – Việc tinh chế chất thường dùng phương pháp kết tinh lại dung môi hệ dung mơi thích hợp Nhờ cách làm thu đơn chất có độ tinh khiết cao, ñáp ứng yêu cầu ñể khảo sát tính chất hố lý xác định quang phổ chúng – Khi phân lập thành phần hoá học từ Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera ñược thực sơ ñồ 2.1, 2.2 2.3 Bằng phương pháp phân lập trên, từ cặn dịch chiết n-hexan SSH, ñã thu ñược hợp chất (NVT01, NVT02) cặn dịch chiết chloroform SSC, chúng tơi thu hợp chất (NVT03, NVT04) 3.2.1 Hàm lượng cao chiết chất tách ñược từ Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera Bảng 3.1 Hàm lượng cao chiết từ 1,85 kg Ngũ vị tử chisandra sphenanthera) Cao chiết Cặn chiết phân ñoạn Loại tổng cao methanol n-hexan chloroform ethyl acetat n-butanol 135g 73,8g 49,7g 5,5g 3,1g Khối lượng Hàm lượng* 7,30% 3,99% 2,69% 0,30% 0,17% Bảng 3.2 Hàm lượng chất tách ñược từ cặn dịch chiết SSH SSC 1,85 kg Ngũ vị tử (Schisandra sphenanthera) Chất NVT01 NVT02 NVT03 NVT04 300 mg 212 mg 75 mg 2,5 g Khối lượng 0,016% 0,011% 0,004% 0,135% Hàm lượng* * Hàm lượng so với mẫu khơ Nhận xét đánh giá: – Hàm lượng loại cao dung môi hữu (n-hexan, chloroform, ethyl acetat n-butanol) thu ñược từ dịch chiết tổng methanol thấp (so với mẫu ban ñầu) – Hàm lượng chất chiết ñược chủ yếu tập trung dung môi nhexan chloroform -17- -18- – Chất NVT04 có hàm lượng lớn (trong chất tách ñược) 3.2.2 Xác ñịnh cấu trúc chất NVT02 – Hợp chất NVT02 thu dạng tinh thể hình kim, nhiệt độ nóng chảy 128 – 1290C – Phổ khối ESI-MS chất NVT02 có pic ion giả phân tử m/z 433 [M+H]+, kết hợp với phổ 1H-NMR, 13C-NMR DEPT xác định cơng thức phân tử chất NVT02 C24H32O7 Phổ 13CNMR phổ DEPT chất NVT02 có tín hiệu 24 cacbon, gồm có: 11xCq, 3xCH, 2xCH2, 8xCH3 (trong có 6xOCH3 δC 60,82; 60,65; 60,51; 60,48; 55,89; 55,82) (bảng 3.3) Từ liệu phổ MS NMR, dự đốn chất NVT02 lignan có cấu trúc dạng dibenzocyclooctadiene Phổ 1H-NMR có tín hiệu singlet proton thơm (δH 6,62; 6,54), nhóm methoxy singlet (δH 3,91-3,58, 6xCH3O) nhóm methyl phía trường cao (δH 1,26; 0,83) Phổ 13 C-NMR có nhóm methylen δC 40,78; 34,22, với nhóm methyl δC 29,68; 15,76 cacbon bậc gắn với oxy δC 71,75 gợi ý cho biết có nhóm hydroxy gắn C-7 C-8 – So sánh trực tiếp kiện phổ NMR NVT02 với kiện phổ tương ứng Schisandrin theo tài liệu [27] cho thấy hợp chất NVT02 Schisandrin (Schizandrin, Schisandrol A, Wuweizi alcohol A), hợp chất lignan ñã biết từ S chinensis (Ikeya et al., 1979c), K longipedunculata (Li & Chen, 1986), S rubriflora (Chen et al., 2006) S sphenanthera (Bùi Thị Bằng ñồng sự, 2007) [2], [36] Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất NVT02 Schisandrin theo tài liệu [27] [CDCl3, 125/500 MHz, δ (ppm)] NVT02 C Schisandrin [27] δ C δ H, J (Hz) 151,77 140,69 152,29 110,38 6,62 s 131,77 C δC 151,9 140,8 152,3 110,5 131,8 δ H, J (Hz) 6,60 s 2,67 m; 40,78 2,36 m 6-Hα: 2,70 d (14); 40,9 6-Hβ: 2,32 d (14) 71,75 7-OH: 1,76 s 71,0 41,73 1,88 m 41,8 34,22 2,39 m; 2,65 m 133,78 109,94 151,95 140,13 151,47 122,71 124,09 15,76 29,68 60,51 60,48 60,82 60,65 55,89 55,82 10 11 12 13 14 15 16 17 18 6,54 s 0,83 d (7,2) 1,26 s 3,58 s 3,59 s 3,84 s 3,88 s 3,89 s 3,91 s 1,80 m 9-Hα: 2,33 dd (14/7); 34,4 9-Hβ: 2,68 dd (14/2) 133,8 110,1 6,53 s 152,0 140,3 151,6 122,8 124,2 15,9 0,82 d (7) 29,7 1,25 s C-1, 14 60,5 (×2) 3,59 s (×2) OCH3 OCH3 10 11 12 13 14 15 16 17 18 C-1 C-14 C-2 C-13 C-3 C-12 7-OH: 1,86 s C-2, 13 60,9 (×2) 3,90 s (×2) C-3, 12 56,0 (×2) 3,92 s (×2) -19- -20- 3.2.3 Xác định cấu trúc chất NVT01 – Chất NVT01 ñược tách dạng vơ định hình Phổ 13C-NMR DEPT chất NVT01 có tín hiệu 28 cacbon, gồm có: 13xCq (trong ñó có nhóm cacbonyl este δC 165,78), 5xCH, 2xCH2 8xCH3 (trong có 4xOCH3 δC 60,79; 60,57; 58,98; 55,79) (bảng 3.4) Kết hợp phổ khối ESI-MS, phổ 1H-NMR, 13C-NMR DEPT xác định cơng thức phân tử chất NVT01 C28H34O9 Khi so sánh phổ 1H-NMR 13C-NMR chất NVT01 với chất NVT02, ta thấy chất NVT01 có nhóm methoxy có thêm nhóm methylenedioxide (δH 5,89, d (1,4); 5,86, d (1,4); δC 100,50, C-19) có nhánh angeloyl tigloyl thấy rõ qua cụm tín hiệu δC 165,78 (C-1’); 127,06 (C-2’); 139,87 (C-3’); 15,64 (C-4’); 19,69 (C-5’) phổ 13C-NMR Điều ñược khẳng ñịnh thêm qua pic ion m/z 415 [M-C5H7O2]+ phổ khối ESI-MS Cấu hình OH-7 β xác ñịnh qua ñộ chuyển dịch hoá học C-7 (δC 72,17), α tín hiệu cacbon phía trường thấp (δC 75,2) [20], [23], [27] – So sánh chi tiết số liệu phổ NMR NVT01 với số liệu phổ tương ứng chất Tigloylgomisin P Angeloylgomisin P [20], [23], [27], ñã xác định chất NVT01 Angeloylgomisin P, hợp chất lignan ñã biết từ S chinensis (Ikeya et al., 1980b), S sphenanthera (Ikeya et al., 1990) S rubriflora (Chen et al., 2006) [17], [26], [36] Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất NVT01 Angeloylgomisin P theo tài liệu [27] [CDCl3, 125/500 MHz] NVT01 C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 δC δ H, J (Hz) 151,85 140,49 152,05 109,87 6,76 s 130,61 84,39 5,60 s 72,17 42,41 1,94 m 36,39 2,29 dd (14,0/9,8) 2,15 d (14,0) Angeloylgomisin P [27] C δC 152,1 141,1 153,0 109,8 130,6 84,4 72,2 42,4 δ H, J (Hz) 6,79 s 5,63 s 7-OH: 1,78 s 1,96 m 9-Hα: 2,31 dd (14,0/9,6) 36,4 9-Hβ: 2,16 d (14,0) 134,2 102,6 6,48 s 149,5 134,6 141,5 122,3 121,1 18,9 1,15 d (6,8) 28,1 1,35 s 135,16 10 102,63 6,46 s 11 148,71 12 134,21 13 141,70 14 122,22 15 121,17 16 18,88 1,13 d (7,1) 17 28,12 1,39 s 18 5,89 d (1,4) 19 100,50 19 100,5 5,37 s 5,86 d (1,4) 1-OCH3 60,57 3,56 s 1-OCH3 60,6 3,58 s 2-OCH3 60,79 3,90 s 2-OCH3 60,8 3,92 s 3-OCH3 55,79 3,91 s 3-OCH3 55,8 3,92 s 14-OCH3 58,98 3,73 s 14-OCH3 59,0 3,75 s 1’ 165,78 1’ 165,7 2’ 127,06 2’ 127,1 3’ 139,87 5,99 m 3’ 138,7 5,70 m 4’ 15,64 1,85 dd (7,5/1,5) 4’ 15,7 1,87 dd (7,0/1,5) 5’ 19,69 1,55 s 5’ 19,7 1,60 s -21- -22- 3.2.4 Xác ñịnh cấu trúc chất NVT03 – Chất NVT03 thu dạng tinh thể hình kim, có nhiệt ñộ nóng chảy 134 – 1350C – Trên sắc ký lớp mỏng, với thuốc thử axit sunfuric 10% hơ nóng màu hồng tươi, sau chuyển sang màu xanh tím, gợi ý steroid – Phổ 13C-NMR DEPT cho 29 tín hiệu tương ứng với 29 nguyên tử cacbon, gồm có: 3xCq, 9xCH, 11xCH2, 6xCH3 (bảng 3.5), có nối đơi δC 142,19 (Cq, C-5), 122,42 (CH, C-6) cacbon methin ñính trực tiếp với oxy δC 72,41 (CH, C-3) – So sánh trực tiếp phổ NMR NVT03 với phổ tương ứng β-Sitosterol theo tài liệu [19], [29] ñã khẳng ñịnh ñược cấu trúc chất NVT03 β -Sitosterol, hợp chất steroid ñã biết từ K heteroclite (Yang et al., 1992), S sphenanthera (Bùi Thị Bằng ñồng sự, 2007) S chinensis (Hu et al., 2009) [2], [22], [37] Bảng 3.5 Số liệu phổ 13C-NMR chất NVT03 β-Sitosterol theo tài liệu [19], [29] NVT03 [MeOH CDCl3, 125 MHz, δ (ppm)] C δ C (δ δ ppm) 38,52 33,00 72,41 β-Sitosterol [19] [CDCl3, 125 MHz, δ (ppm)] C δ C (δ δ ppm) 37,27 32,54 71,77 β-Sitosterol [29] [CDCl3, 125 MHz, δ (ppm)] C δ C (δ δ ppm) 37,36 31,90 71,77 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 42,98 142,19 122,42 32,26 33,23 51,68 37,65 22,16 41,11 43,46 58,14 25,29 29,32 57,42 12,24 20,19 37,39 19,33 35,08 27,16 47,24 30,36 19,43 19,86 24,13 12,33 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 42,29 140,75 121,69 31,92 31,92 50,15 36,51 21,10 39,80 42,23 56,78 24,31 28,25 56,08 11,89 19,39 36,16 18,80 33,96 26,11 45,85 29,18 18,82 19,05 23,08 11,99 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 42,29 140,75 121,69 31,65 31,93 50,13 36,50 21,09 39,78 42,32 56,77 24,31 28,26 56,06 11,86 19,40 36,15 18,79 33,95 26,07 45,83 29,16 19,83 19,04 23,07 11,99 3.2.5 Xác ñịnh cấu trúc chất NVT04 – Phổ 13C-NMR DEPT chất NVT04 có tín hiệu 29 cacbon, bao gồm: 11xCq (trong có nhóm cacbonyl δC 221,04; 199,28; 180,27; 176,98), 8xCH, 5xCH2, 5xCH3 Từ số liệu phổ 13CNMR DEPT cho thấy nortriterpenoid Phổ 1HNMR cho tín hiệu triplet nhóm methin olefin (δH 7,12, t, J=7,7 Hz), nhóm methinoxy (δH 4,66; 4,39; 4,26); nhóm methyl singlet (δH 1,43; 1,34; 1,15; 1,10) methyl doublet (δH 1,18, J=7,2 Hz) (bảng 3.6) -23- -24- – Qua phân tích phổ so sánh với tài liệu [25], ñã xác ñịnh ñược cấu trúc chất NVT04 Henridilacton A, nortriterpenoid lần ñầu tiên ñược Rong-Tao Li cộng phân lập từ Schisandra henryi var yunnanensis năm 2004 [25] Đây lần thứ hai chất ñược phân lập từ chi Schisandra [17], [32] Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất NVT04 Henridilacton A theo tài liệu [25] NVT04 [MeOD, 125/500 MHz, δ (ppm)] C δC δ H, J (Hz) 81,24 4,26 d (6,5) 36,02 2,36 m; 2,94 m 176,98 84,53 58,79 1,83* 24,52 1,94 m; 2,24 m 137,11 7,12 t (7,7) 138,68 84,12 10 96,35 11 39,80 1,93 m; 2,23 m 12 31,80 1,51 m; 1,99 m 13 50,62 14 46,56 2,54 d (8,5) 15 99,21 16 199,28 17 221,04 Henridilacton A [25] [C5D5N, 125 MHz, δ (ppm)] C δC 80,3 35,3 174,9 83,2 57,7 23,7 135,3 137,8 82,7 10 94,7 11 39,1 12 31,0 13 49,6 14 45,9 15 98,6 16 198,4 17 220,2 18 27,86 1,15 s 19 42,80 2,50 d (16); 2,38 m 20 75,41 21 24,45 1,43 s 22 42,80 2,99 m 23 74,77 4,66 br s 24 72,23 4,39 dd (4,1/2,1) 25 42,50 2,96 m 26 180,27 27 7,99 1,18 d (7,2) 29 27,96 1,34 s 30 20,81 1,10 s * Tín hiệu bị che phủ 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 29 30 27,5 42,5 74,6 25,3 42,2 73,6 71,7 41,7 178,1 8,5 27,5 20,4 3.3 Thăm dị hoạt tính sinh học (hoạt tính gây độc tế bào) Mẫu dịch chiết tổng, dịch chiết thô chất nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào dòng ung thư người bao gồm KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan), Lu (ung thư phổi) MCF7 (ung thư vú) Kết thử hoạt tính nêu bảng (bảng 3.7) Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào dịch chiết chất từ Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera STT Tên dòng tế bào Lu HepG2 KB MCF7 IC50 (µg/ml) IC50 (µg/ml) IC50 (µg/ml) IC50 (µg/ml) SSM 113,23 112,67 89,48 93,86 SSH 80,00 77,93 80,00 80,24 SSC >128 >128 88,07 >128 SSE >128 >128 >128 >128 SSB >128 >128 >128 >128 NVT01 59,35 39,11 18,6 23,05 NVT02 94,89 29,33 91,69 >128 NVT04 >128 66,80 104,96 >128 Ký hiệu mẫu Chất tham Elipticine 0,31–0,62 khảo 0,31–0,62 0,31–0,62 0,31–0,62 -25- -26- Nhận xét ñánh giá: – Dịch chiết tổng methanol SSM dịch chiết n-hexan SSH có hoạt tính với dịng tế bào (dịch chiết n-hexan SSH có hoạt tính mạnh nhất); dịch chiết chloroform SSC có hoạt tính chọn lọc dịng tế bào KB – Chất NVT01 NVT02 tách từ dịch chiết n-hexan SSH có hoạt tính mạnh dịch chiết ban đầu Hoạt tính NVT01 mạnh nhiều so với NVT02 chất ñều có kiểu khung Như nhận định nhóm methylenedioxide, angeloyl đóng vai trị quan trọng hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính NVT04 tách từ dịch chiết chloroform SSC nhiều so với NVT01 NVT02 tách từ dịch chiết n-hexan SSH Điều chứng tỏ lignan đóng vai trị quan trọng hoạt tính Ngũ vị tử Những kết luận hữu ích cho chúng tơi ñịnh hướng nghiên cứu sau liên quan hoạt tính cấu trúc – NVT04: Henridilacton A d) Kết thử hoạt tính chống ung thư cho thấy chất NVT01 có hoạt tính mạnh dòng tế bào (KB, HepG2, Lu, MCF7), chất NVT02 có hoạt tính kháng dịng tế bào (KB, HepG2, Lu) chất NVT04 có hoạt tính với dòng tế bào (KB, HepG2) KIẾN NGHỊ a) Nên tiếp tục phân lập, tách tinh chế nhiều chất từ cặn dịch chiết SSE, SSB thăm dị hoạt tính sinh học chúng b) Cây Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera thuốc quý có nhiều tác dụng y học Vì tơi ñề nghị tiếp tục nghiên cứu cách sâu rộng Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera nhằm phục vụ tốt ñời sống nhân dân KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN a) Lần ñầu tiên, Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera mọc hoang Kon Tum ñược nghiên cứu hố thực vật cách có hệ thống b) Bằng phương pháp sắc ký cột chất mang khác với hệ dung mơi thích hợp ñã phân lập ñược chất sạch: – chất từ cặn dịch chiết n-hexan SSH: NVT01, NVT02 – chất từ cặn dịch chiết chloroform SSC: NVT03, NVT04 c) Kết hợp phương pháp phổ khối ESI-MS phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT so sánh với tài liệu ñã xác ñịnh ñược cấu trúc chất là: – NVT01: Angeloylgomisin P – NVT02: Schisandrin – NVT03: β -Sitosterol  ... methylenedioxide (? ?H 5,89, d (1 ,4); 5,86, d (1 ,4); δC 100,50, C-19) có nhánh angeloyl tigloyl thấy rõ qua cụm tín hiệu δC 165,78 (C-1’); 127,06 (C-2’); 139,87 (C-3’); 15,64 (C-4’); 19,69 (C-5’) phổ... acetat 2.1.2 Thiết bị, sinh học 2.1.2.1 Thiết bị, dụng cụ Tủ ấm CO2 (INNOVA CO–170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II (SteriGard II), máy li tâm (Universal 320R), kính hiển vi ngược (Aciovert 40 CFL),... ứng là: n-hexan SSH (7 3,8 gam), chloroform SSC (4 9,7 gam), ethyl acetat SSE (5 ,5 gam) nbutanol SSB (3 ,1 gam) (Sơ ñồ 2.1) 2.3.1.1 Cặn chiết n-hexan SSH Cặn chiết n-hexan SSH (7 3,8 gam) ñược khảo