45 Chương Cấu trúc tính chất lý-hố protein I Các quan điểm khác nghiên cứu cấu trúc protein Như biết, protein phần chức thể, hình thành chức dựa sở thành phần cấu trúc protein, hay nói cách khác chức thành phần cấu trúc protein có liên hệ mật thiết với Từ nghiên cứu cấu trúc protein dựa quan điểm: nghiên cứu thành phần cấu trúc dựa vào chức sinh học để tìm hiểu cấu trúc chúng Chẳng hạn, việc nghiên cứu xác định cấu trúc bậc I phân tử protein bước quan trọng để xác định phân tử hoạt tính sinh học tính chất hoá lý protein, sở để xác định cấu trúc không gian phân tử protein Dựa vào cấu trúc không gian phân tử protein tương đồng, dự đốn định vị cầu disunfua, cấu trúc không gian protein nghiên cứu Ngược lại xuất bệnh lý đặc trưng liên quan đến thay đổi chức protein mà nguyên nhân thay đổi 1gốc amino acid phân tử Ví dụ: bệnh thiếu máu hồng cấu hình lưỡi liềm, nghiên cứu cấu trúc bậc I hemoglobin bình thường bệnh lý xác định gốc amino acid glutamic vị trí thứ chuỗi β hemoglobin A (bình thường) bị thay gốc amino acid valine II Các kiểu liên kết cấu trúc protein 2.1 Các liên kết cộng hố trị Trong phân tử protein ngồi liên kết cộng hố trị bình thường, người ta thường nhắc đến hai kiểu liên kết cộng hoá trị đặc biệt có ý nghĩa quan trọng cấu trúc chức chúng là: - Liên kết peptide (xem chương 3) - Liên kết disunfua (-S-S-) Liên kết disunfua liên kết đồng hoá trị tạo thành kết hợp hai phân tử cysteine với loại 2H (hình 4.1) Liên kết disunfua (cịn gọi cầu disunfua) hình thành hai phân tử cysteine chuỗi polypeptide hai cysteine thuộc hai chuỗi polypeptide khác Cầu disunfua có vai trị quan trọng việc trì cấu trúc bậc III phân tử protein Những phân tử protein chứa nhiều cầu disunfua chặt chẽ, vững bền protein không tan protein lông, móng, tóc, sừng vững bền với tác nhân hố học, chứa tới 12% cysteine 46 Oxy hóa Hình 4.1 Sự hình thành cầu disulfua hai phân tử cysteine 2.2 Các liên kết yếu làm ổn định cấu trúc protein 2.2.1 Liên kết hydro Là tương tác yếu hình thành ngun tử mang điện tích âm (gọi nguyên tử nhận A-acceptor) nguyên tử hydro (H) nằm D  H + A ⇔ D  H ••• A Liên kết hydro a Hình 4.2 b c Một số liên kết hydro quan trọng hệ thống sống Ghi chú: a) hydro ancohol oxy nước; b) nhóm carbonyl keto nước; c) nhóm peptide polypeptide; 47 nối cộng hoá trị với nguyên tử khác (gọi nguyên tử cho D- donnor) Nối cộng hoá trị D H phải nối phân cực đám mây điện tử A phải mang điện tử khơng liên kết có khả thu hút điện tích δ+ H Năng lượng cần để phá liên kết hydro khoảng kcal mol-1 Một đặc điểm quan trọng liên kết hydrogengen H, nguyên tử nhận A, nguyên tử cho D xếp đường thẳng Nguyên tử N liên kết N-H O liên kết O-H nguyên tử cho Trong hệ thống sống nhóm amine (-NH2) hydroxyl (-OH), diện nhóm khiến cho phân tử có mang chúng dể hồ tan nước có hình thành liên kết hydrogengen chúng Đặc biệt, phân tử nước H2O - nhân tố chủ yếu vật chất sống ln hình thành mạng lưới đặn hình tứ diện dù thể lỏng hay thể rắn Hình 4.3 Sơ đồ cấu trúc mạng lưới hình thành phân tử H2O - Nguyên tử oxy biểu thị vòng tròn lớn - Nguyên tử hydro biểu thị vòng tròn nhỏ 2.2.2 Liên kết ion Là tương tác tĩnh điện hai nhóm có điện tích ngược dấu Trong nhiều trường hợp chất vơ cơ, điện tử liên kết luôn bị hút 48 phía ngun tử có độ âm điện cao gây phân li cation (nguyên tử tích điện tích âm) anion (nguyên tử tích điện dương), ví dụ: NaCl → Na+ + ClVì điện tử liên kết không dược phân chia đồng cho hai nguyên tử nên liên kết không xếp vào loại liên kết cơng hố trị Khác với liên kết cộng hoá trị hay liên kết hydro, liên kết ion khơng có định hướng khơng gian điện trường không đồng quanh ion Trong môi trường nước, anion cation luôn vây bọc phân tử H2O tạo thành lớp vỏ bọc ngồi nên khơng thể liên kết trực tiếp với anion cation khác Do đó, người ta cho tương tác tĩnh điện khơng đóng vai trị quan định cấu hình khơng gian phân tử hữu 2.2.3 Liên kết Van der Waals Là tương tác không đặc hiệu xuất hai nguyên tử chúng tiến lại gần Tương tác không phân phối lệch điện tử hai phân tử mà biến động thoáng qua đám mây điện tử gây phân cức thời phân tử Liên kết Van der Waals kết lực hút lức đẩy Hai lực cân khoảng cách định, đặc trưng cho loại nguyên tử Khoảng cách gọi bán kính Van der Waals Đây lực liên kết yếu nhất, với giá trị khoang k cal mol-1 Để liên kết thật có ý nghĩa, phải tồn số lượng lớn, nghĩa bề mặt tiếp xúc hai phân tử phải cực đại Điển hình phân tử có mang hốc có hình dáng phù hợp với chổ lồi phân tử trường hợp tương tác kháng nguyên - kháng thể, enzyme - chất 2.2 Liên kết kị nước (tương tác kị nước) Các phân tử không phân cực, tức phân tử khơng chứa nhóm ion hố lẫn liên kết phân cực, khơng hồ tan nước, chúng phân tử kị nước Lực thúc đẩy phân tử hay vùng không phân cực phân tử liên kết với thay với phân tử H2O (đẩy phân tử H2O ngoài) gọi liên kết kị nước Đây lực liên kết nghĩa mà khuynh hướng loại trừ nhóm khơng phân cực khỏi mạng lưới nước Còn liên kết thật tồn phân tử không phân cực liên kết Van der Waals Các tương tác kị nước đóng vai trị quan trọng việc ổn định protein, phức protein với phân tử khác phân bố protein màng sinh học 49 III Hình dạng kích thước cấu trúc phân tử protein 3.1 Hình dạng kích thước Protein có khối lượng phân tử (Mr) tương đối lớn thay đổi dãi rộng từ 10 nghìn đến hàng trăm nghìn dalton (bảng 4.1) Các phân tử protein có dạng cầu (kể hình bầu dục) dạng sợi Thuộc dạng cầu hầu hết protein có hoạt tính xúc tác vận chuyển enzyme, hemoglobin, globulin tỷ lệ trục dài trục ngắn phân tử bé 20 Ở protein hình sợi tỷ lệ lớn nhiều ví dụ tropocolagen (đơn vị cấu trúc sở colagen) có chiều dài khoảng 3000 AO, đường kính khoảng 15AO Các protein hình sợi tương đối trơ mặt hoá học, chủ yếu giữ chức cấu trúc chống đỡ học ví dụ: colagen da, xương, sụn, gân, răng; keratin tóc, lơng; fibroin tơ; myosine v.v 3.2 Cấu trúc bậc (cấu trúc sơ cấp) Cấu trúc bậc I biểu thị thành phần trình tự amino acid phân tử protein, cấu trúc giữ vững liên kết peptide-liên kết cộng hoá trị (xem chương 3) Cấu trúc bậc I dịch mã di truyền, việc xác định cấu trúc bậc I sở để tổng hợp nhân tạo protein phương pháp hố học biện pháp cơng nghệ sinh học Ví dụ: năm 1953, lần Frederick Sanger (người Anh) xác định trình tự xếp amino acid phân tử insulin đến năm 1966 protein lần tổng hợp phương pháp hoá học Ngày người ta dùng vi khuẩn Escherichia coli để tổng hợp insulin (sẽ trình bày kỹ chương 6) 3.2.1 Cấu trúc bậc I số protein biết Bằng phương pháp xác trình tự amino acid protein, số loại protein biết rõ cấu trúc bậc I insulin trình bày chương 3, nhiều loại protein khác biết trình tự amino acid chuỗi polypeptide như: ribonuclease protein có 124 amino acid, nối với thành chuỗi (hình 4.4); hemoglobin protein có chuỗi polypeptide, chuỗi α ( chuỗi 141 amino acid) chuỗi β (mỗi chuỗi 146 amino acid); tripsinogen bò (229 amino acid); chimotrypsin bò (229 amino acid); alcohol dedhyrogenase ngựa (374 amino acid); glutamate dehdrogenase bò (500 amino acid) v.v 3.1.2 Tính quy luật cấu trúc bậc protein Những protein đồng thể lồi khác có số gốc amino acid tương đối khơng đổi vị trí đặc biệt có gốc amino acid thay đổi, nghĩa loài khác nhau, amino acid khác 50 thay cho Thí dụ insulin nhiều lồi khác có amino acid khác vị trí 8, 9, 10 (bảng 4.1), tương tự oxytocin, vasopressin, vasotocin số loài động vật khác Hình 4.4 Cấu trúc bậc ribonuclesae bò Bảng 4.1 Sự thay amino acid chuỗi A insulin số loài Loài Vị trí amino acid 10 Bị Ala Ser Val Lợn Thr Ser Ile Cừu Ala Gly Val Ngựa Thr Gly Ile Cá nhà táng Thr Ser Ile Người Thr Ser Ile Chó Thr Ser Ile Thỏ Thr Ser Ile 3.3 Cấu trúc bậc II (cấu trúc thứ cấp) Biểu thị cấu trúc bậc II xoắn chuỗi polypeptide, tương tác không gian gốc amino acid gần mạch polypeptide tạo thành hai dạng xoắn α xắn β Nói cách khác, dạng không gian cục phần mạch polypeptide Cấu trúc 51 làm bền nhờ liên kết hydro tạo thành liên kết peptide kề gần nhau, cách khoảng xác định Xoắn α Liên kết hydro Phiến gấp β Hình 4.5 Các kiểu xoắn cấu trúc bậc II protein 3.3.1 Phương pháp nghiên cứu cấu trúc bậc II Hiện người ta dùng nhiều phương pháp khác để phân tích cấu trúc bậc II phân tử protein phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại- khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, trao đổi hydro nặng, đo độ chiết quang v.v , sở số phương pháp thường hay dùng để phân tích cấu trúc bậc II protein dựạ nguyên tắc riêng sau: - Phổ hồng ngoại: phổ hấp thụ hồng ngoại phổ dao động quay, hấp thụ xạ hồng ngoại chuyển động dao động chuyển động quay bị kích thích Phổ quay phân tử khơng phương pháp quý để nhận dạng chất mà cịn cho phép xác định xác khoảng cách hạt nhân nguyên tử góc kiên kết - Phổ tử ngoại- khả kiến: Khi phân tử hấp thụ xạ tử ngoại khả kiến eletron hố trị bị kích thích chuyển từ trạng thái lên trạng thái kích thích Vì phổ thu gọi phổ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and Visible Spectra, viết tắt UV-Vis) gọi phổ hấp thụ eletron Mỗi trạng thái eletron ứng với đường cong ứng với giá trị xác định tần số dao động riêng phân tử 52 - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Dựa nguyên lí sử dụng nơtron proton hạt nhân nguyên tử, số lượng spin proton nơtron 1/2 Tuỳ thuộc vào việc spin hạt nucleon có cặp đôi hay không mà hạt nhân nguyên tử đặc trưng số lượng tử spin hạt nhân (I) không hay khác không Nếu hạt nhân có spin khơng cặp đơi I= 1/2, có nhiều spin khơng cặp đơi I ≥ Nếu chiếu vào mẫu dung dịch protein sóng vơ tuyến có tần số xác định, hạt nhân mức lượng thấp hấp thụ năng lượng sóng vơ tuyến để chuyển lên mức cao Người ta nói lúc xẩy cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance, viết tắt NMR) Từ người ta thiết kế máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân bao gồm ống chứa dung dịch mẫu đặt từ trường nam châm mạnh Một máy phát cung cấp sóng radio Một máy thu sóng radio theo dõi hấp thụ lượng thơng qua cuộn cảm bao quanh mẫu, tín hiệu cộng hưởng từ khuyếch đại, phân tích truyền sang bút tự ghi để vẽ phổ Máy cộng hưởng từ hạt nhân phát từ năm 1946, ứng dụng vào hoá hữu năm 1953, ngày phát triển hồn thiện Nó cơng cụ đắc lực cho nhà hoá học việc xác định cấu trúc phân tử protein - Trao đổi hydro nặng: Dựa nguyên tắc hydro nặng H (thường ký hiệu D-deuterium) H3 (thường ký hiệu T tritium) để thay cho hydro bình thường nằm liên kết cấu trúc phân tử protein Từ nhờ hình ảnh phổ đặc trưng phát từ loại hydro nặng để xác định cấu trúc phân tử 3.3.2 Cấu trúc bậc II số protein biết Theo Paulin Cori (1951) cấu trúc bậc II protein bao gồm kiểu xoắn α phiến gấp β Bảng Số lượng xoắn α phiến gấp β chuỗi đơn số protein số gốc (%) Protein (số gốc) Chymotrypsin (247) Ribonuclease (124) Carboxypeptidase (397) Cytochrom C (104) Lysozyme (129) Myoglobin (153) Xoắn α Phiến gấp β 14 26 38 39 40 78 45 35 17 12 53 Các tế bào Sợi nhỏ Tiền fibrin Tiền sợi nhỏ Hai sợi xoắn Xoắn α Hình 4.6 Lát cắt ngang sợi tóc với chuỗi xoắn α keratin Ở tóc người ta tìm thấy keratin (hình 4.6) loại protein có hai dạng cấu trúc: dạng α bình thường dạng β duỗi thẳng.; cấu trúc phiến gấp β tìm thấy fibroin tơ protein khác thay đổi nhiều Ví dụ hemoglobin mioglobin 75%; lisozym 35%; ribonuclease 17% - Ngồi cịn có kiểu xoắn colagen tìm thấy phân tử colagen (hình 4.7), đơn vị cấu trúc tropocolagen bao gồm mạch polypeptide bện vào thành dây cáp siêu xoắn (vì mạch đơn có cấu trúc xoắn chiều cao gốc xoắn trục siêu xoắn 2,9 anstron, vịng xoắn 3,3 Hình 4.7 Cấu trúc kiểu xoắn colagen gốc amino acid Ba mạch polypeptide “dây cáp” nối Cấu trúc xoắn α với liên kết tìm thấy nhiều loại protein hydro khác Mặt khác tỷ lệ % xoắn α 51 3.4 Cấu trúc không gian protein 3.4.1 Định nghĩa khái niệm cấu trúc không gian Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta nghiên cứu cấu trúc không gian ba chiều phân tử protein, hình dạng xoắn để tạo xoắn α phiến gấp β tạo thành cấu trúc bậc II, hình dạng cuộn lại chuỗi có cấu trúc bậc II để tạo thành cấu trúc bậc III vị trí xếp protein có cấu trúc bậc III khơng gian để tạo thành cấu trúc bậc IV (hình 4.8) Bậc I Bậc II Bậc III Bậc IV Hình 4.8 Sơ đồ bậc cấu trúc phân tử protein Trong cấu trúc không gian ngồi liên kết hydro liên kết cầu disulfua cấu trúc bậc II đặc biệt cấu trúc bậc III có ý nghĩa quan trọng để giữ cấu trúc cuộn khúc chuỗi polypeptide thành khối Đặc trưng cho potein hình cầu, tương tác khơng gian gốc amino acid xa mạch polypeptide Trong nhiều protein cầu có chứa gốc Cys tạo nên liên kết disulfua gốc Cys xa mạch polypeptide làm cho mạch bị cuộn lại Ngồi cấu trúc bậc III cịn giữ vững loại liên kết khác Van der Waals, liên kết hydro, liên kết tĩnh điện gốc amino acid v.v Cấu trúc bậc IV đặc trưng cho phân tử protein có cấu trúc từ hai hay nhiều chuỗi protein hình cầu, tương tác với xếp không gian tạo nên Mỗi chuỗi polypeptide gọi tiểu đơn vị (subunit), chúng gắn với nhờ liên kết hydro, tương tác Van der Waals nhóm phân bố bề mặt tiểu đợn vị để làm bền cấu trúc bậc IV 52 Như ta định nghĩa cách ngắn gọn cấu trúc khơng gian protein hình dạng phân tử protein cấu thành xếp chuỗi chuỗi polypeptide không gian 3.4.2 Xác định khối lượng phân tử protein Để xác định khối lượng phân tử protein người ta dùng nhiều phương pháp khác như: phương pháp khuyếch tán, phương pháp phân tích rơnghen, phương pháp tán xạ ánh sáng v.v Tuy nhiên, phương pháp khác thường cho kết khác Sau xin giới thiệu số phương pháp có độ tin cậy cao thường sử dụng để xác định khối lượng phân tử protein - Phương pháp ly tâm siêu tốc Dựa xác định tốc độ lắng (hằng số lắng) protein dung dịch chịu ly tâm tốc độ lớn (hàng trăm ngàn vòng phút) tính khối lượng phân tử (Mr) theo cơng thức RTS Mr = D(1- VP) Trong R số khí tính theo erg mol-1 độ-1, T nhiệt độ tuyệt đối, S số lắng tính theo đơn vị Svedberg (đơn vị Svedberg ký hiệu chữ S 10-13 giây), D hệ số khuyếch tán, V thể tích riêng phần protein, P tỷ trọng dung môi Bảng 4.3 Mối liên quan số lắng (S) khối lượng phân tử số protein Protein Chất ức chế pancreatic tripsin Cytochrom C Ribonuclease A Myoglobulin Tripsin Carbonic anhydrase Concanavalin A Malate dehydrogenase Lactate dehydrogenase Trị số S (đơn vị Svedbrg) 1,83 1,78 1,97 2,5 3,23 3,8 5,76 7,54 Khối lượng (KDa) 6,520 12,310 13,690 17,800 23,200 28,800 51,260 74,900 146,200 53 - Phương pháp điện di Dựa nguyên tắc khả di chuyển phân bố giá thể (thường gel polyacrylamide hay agarose) loại protein điện trường So sánh với protein biết trước khối lượng (protein chuẩn) để xác định khối lượng protein mẫu cần tìm Khối lượng (hay trọng lượng phân tử Mr) xác định tương quan với di động điện di phân tử protein gel polyacrylamide chứa SDS (SDS-PAGE) Người ta lập đồ thị chuẩn theo log Mr protein biết khối lượng (marker) tỷ lệ hay tương quan di động tương đối protein Căn vào đồ thị tính Mr protein chưa biết khối lượng phân tử Hình 4.9 Protein chưa biết Log Mr Sự di động tương đối Hình 4.9 Cách lập đồ thị chuẩn để tính Mr protein - Phương pháp sắc ký lọc gel (lọc sàng phân tử) Người ta dùng phương pháp sắc ký lọc gel để phân tách protein có khối lượng phân tử kích thước khác Gel dùng thường sephadex Đó polysaccharide đặc biệt, hydrate hoá mạnh thành hạt gồm phân tử polysaccharide kết hợp với liên kết ngang tạo nên lỗ “rây” phân tử khơng gian với lỗ có kích thước định (liên kết ngang nhiều lỗ rây bé ngược lại) Sephadex nhồi vào cột với dung dịch đệm cho hỗn hợp protein chảy qua, dung dịch protein xuống cột theo trọng lực, phân tử phân tử protein nhỏ lọt vào lỗ rây nên chảy xuống cột chậm phân tử protein lớn không lọt vào lỗ rây (hình 4.10) Kết hứng riêng loại protein sau thời gian định Xác định khối lượng protein cách dùng phương pháp ngoại suy với số protein mẫu biết khối lượng phân tử 54 Hình 4.10 Sơ đồ minh hoạ sắc ký lọc gel A-Hỗn hợp gồm phân tử lớn nhỏ B- Các phân tử nhỏ chui vào sâu lỗ gel C- Các phân tử lớn rút ngồi cịn phân tử nhỏ tạm thời giữ lại 3.4.3 Cấu trúc không gian số protein biết Nhờ phát triển ngày tiến bộ, ngày người ta biết cấu trúc bậc I khơng gian nhiều loại protein có vai trị quan trọng thể ( xem bảng 1.1) Ngoài cấu trúc không gian số protein giới thiệu phần cấu trúc bậc II trên, từ lâu người ta biết cấu trúc không gian (bậc III IV) nhiều protein có vai trị đặc biệt quan trọng khác như: hemoglobin protein nhắc đến nhiều nhất, có khối lượng 64.5 kDa, cấu trúc từ 547 amino acid nằm chuỗi polypeptide, chuỗi α chuỗi β; myoglobin gồm chuỗi polypeptide kết hợp với nhân hem chymotripsin protein có khối lượng 22.6 kDa, cấu tạo từ 241 amino acid tạo thành chuỗi polypeptide (hình 4.11) 3.4.4 Các điều kiện làm bền vững cấu trúc không gian Như biết cấu trúc không gian phân tử protein ổn định nhờ số liên kết disulfua bền vững, phần lớn nhờ liên kết yếu liên kết hydro, liên kết Van der Waals v.v Vì điều kiện để làm ổn định cấu trúc protein phải tránh tác động có 55 thể làm phá liên kết như: tác động mạnh học, nhiệt độ, độ pH, muối kim loại nặng v.v (sẽ giới thiệu kỹ mục biến tính protein phần sau) Chymotripsin Myoglobin Hình 4.11 Hemoglobin Cấu trúc không gian số phân tử protein 3.4.5 Tính quy luật cấu trúc bậc IV protein Các protein có cấu trúc bậc IV, phân tử cấu tạo từ hai hàng trăm tiểu đơn vị Tuy nhiên phần lớn phân tử protein cấu trúc từ tiểu đơn vị đồng từ nhóm tiểu đơn vị giống nhau, phân tử protein thường cấu tạo đối xứng Ví dụ: cấu trúc khơng gian protein xác đinh hemoglobin có khối lương phân tử 64,5 Kda, gồm chuỗi polypeptide, hai chuỗi α (141 amino acid chuỗi) hai chuỗi β (146 amino acid chuỗi) Nhờ phân tích cấu trúc tia X Max Peutz John Kendrew (1959) phát xếp tiểu đơn vị hemoglobin thành cặp đối xứng, cặp gồm tiểu đơn vị α tiểu đơn vị β Vì 56 vậy, coi hemoglobin có cấu trúc tiểu đơn vị hay tiểu đơn vị (mỗi tiểu đơn vị gồm α β) Những protein cấu trúc từ tiểu đơn vị đồng có hay số định kiểu đối xứng đối xứng quay tròn hay xoắn ốc Như tiểu đơn vị xếp chồng lên quanh trục đường xoắn ốc Hình 4.12 Hai kiểu đối xứng vịng trịn cấu trúc protein Trong cấu trúc đối xứng quay tròn tiểu đơn vị xếp xung quanh trục tạo thành dạng cấu trúc đóng, protein có cấu trúc đối xứng đường xoắn ốc tạo thành cấu trúc dạng mở mà tiểu đơn vị xếp thêm vào theo đường xoắn ốc Có nhiều dạng đối xứng quay tròn mà dạng đơn giản đối xứng vịng trịn, tiểu đơn vị xếp bao quanh trục (hình 4.12) Ngồi đối xứng quay trịn phân bố phức tạp gọi đối xứng hai mặt, chí hai mươi mặt cấu trúc vỏ số loại vius Trong số trường hợp phân tử protein gồm nhiều tiểu đơn vị khơng đồng cấu trúc chúng khơng mang tính đối xứng phức tạp IV Tính chất lý -hố protein 4.1 Tính tan protein Các loại protein khác có khả hoà tan dễ dàng số loại dung môi định, chẳng hạn albumin dễ tan nước; globulin dễ tan muối loãng; prolamin tan ethanol, glutelin tan dung dịch kiềm acid lỗng v.v 4.2 Tính ngậm nước protein Trong môi trường nước, protein kết hợp với nước trương lên trở thành dạng keo hay nói cách khác protein trạng thái hydrate hoá, phân tử nước bám vào nhóm ưa nước phân tử protein -NH 2, -COOH , lớp áo nước bao quanh phân tử protein yếu tố 57 làm bền vững cấu trúc, ngăn cách phân tử protein khơng cho chúng dính vào để thành tủa 4.3 Độ nhớt dung dịch protein Khi protein hoà tan dung dịch, loại dung dịch protein khác có độ nhớt khác (bảng 4.3) Người ta lợi dụng tính chất để xác định khối lượng phân tử protein (độ nhớt cao khối lượng phân tử cao) Bảng 4.4 Độ nhớt số protein Protein Gelatin Albumin trứng Gelatin Albumin trứng Nồng độ % (trong nước) 3,0 3,0 8,0 8,0 Độ nhớt tương đối (của nước =1) 4,54 1,20 14,2 1,57 4.4 Hằng số điện môi dung dịch protein Khi thêm dung môi hữu trung tính ethanol, aceton vào dung dịch protein nước độ tan protein giảm tới mức kết tủa giảm mức độ hydrate hố nhóm ion hoá protein, lớp áo nước, phân tử protein kết hợp với thành tủa Như vậy, số điện môi dung môi làm ngăn cản lực tĩnh điện nhóm tích điện protein nước Mối liên hệ đặc trưng biểu thức: L1 - l2 F= D r2 Trong đó: D - số điện môi dung dịch F- lực tĩnh điện ion tích điện L1 , l2 - điện tích ion, r - khoảng cách ion Ở lực tĩnh điện ion tỷ lệ nhgịch với số điện môi khoảng cáhc ion protein 4.5 Tính chất điện li protein Cũng amino acid, protein chất điện li lưỡng tính phân tử protein có nhiều nhóm phân cực mạnh (gốc bên R) amino acid ví dụ: nhóm COOH thứ hai Asp, Glu; nhóm NH Lys; nhóm OH 58 Ser, Thr, Tyr v.v Trạng thái tích điện nhóm phụ thuộc vào pH môi trường Ở pH mà tổng điện tích (+) điện tích (-) phân tử protein khơng, phân tử protein khơng di chuyển điện trường giá trị pH gọi pH i (isoeletric-điểm đẳng điện) protein Như protein chứa nhiều Asp, Glu (amino acid có tính acid mạnh) pHi vùng acid, ngược lại nhiều amino acid kiềm Lys, Arg, His pHi vùng kiềm Ở mơi trường có pH < pHi , đa số protein cation, số điện tích dương lớn số điện tích âm Ở pH > pHi phân tử protein thể tính acid, cho ion H+, số điện tích âm lớn số điện tích dương, protein đa anion, tích điện âm Bảng 4.5 Protein Pepsin Albumin trứng Casein Albumin huyết Gelatin Giá trị pHi số protein pHi Protein pHi 1,0 4,6 4,7 4,9 Globulin sữa Hemoglobin Ribonuclease Tripsin Cytochrom C Prolamin 5,2 6,8 7,8 10,5 10,6 12,0 4,9 Trong mơi trường có pH = pHi , protein dễ dàng kết tụ lại với người ta lợi dụng tính chất để xác định pHi protein để kết tủa protein Mặt khác sai khác pHi protein khác nhau, điều chỉnh pH môi trường để tách riêng protein khỏi hỗn hợp chúng 4.6 Sự kết muối dung dịch protein Muối trung tính có ảnh hưởng rõ tới độ hồ tan protein hình cầu: với nồng độ thấp chúng làm hồ tan nhiều protein Tác dụng khơng phụ thuộc vào chất muối trung tính, mà phụ thuộc vào nồng độ muối số điện tích ion dung dịch, tức phụ thuộc vào lực ion µ dung dịch (µ = 1/2 ∑ C1 Z1 ∑ ký hiệu tổng, C1 nồng độ ion, Z1 điện tích ion) Các muối có ion hoá trị (MgCl2, MgSO4 ) làm tăng đáng kể độ tan protein muối có ion hoá trị (NaCl, NH 4Cl, KCl ) Khi tăng đáng kể nồng độ muối trung tính độ tan protein bắt đầu giảm nồng độ muối cao, protein bị tủa hồn tồn 59 Các protein khác tủa nồng độ muối trung tính khác Người ta sử dụng tính chất để chiết xuất tách riêng phần protein khỏi hỗn hợp Đó phương pháp diêm tích (kết tủa protein muối) Thí dụ dùng muối amonium sulfate 50% bão hoà kết tủa globulin dung dịch amonium sulfate bão hoà để kết tủa albumin từ huyết 4.7 Biểu quang học protein Cũng nhiều chất hố học khác, protein có khả hấp thụ xạ xạ ánh sáng dạng lượng tử hγ Vì đo cường độ hấp thụ protein dung dịch hay gọi mật độ quang thường ký hiệu chữ OD (Optical Density) Dựa tính chất người ta sản xuất loại máy quang phổ hấp thụ để phân tích protein Nhìn chung protein có khả hấp thụ ánh sáng vùng khả kiến (từ 350nm800nm) vùng tử ngoại (từ 320nm xuống tới 180nm) Trong vùng ánh sáng khả kiến protein kết hợp với thuốc thử hấp thụ mạnh vùng ánh sáng đỏ 750nm (định lượng protein theo Lowry) Đối với vùng tử ngoại dung dịch protein có khả hấp thụ ánh sáng tử ngoại hai vùng bước sóng khác nhau: 180nm-220nm 250nm 300nm Ở bước sóng từ 180nm-220nm vùng hấp thụ liên kết peptide protein, cực đại hấp thụ 190nm Do liên kết peptide có nhiều phân tử protein nên độ hấp thụ cao, cho phép định lượng tất loại protein với nồng độ thấp Tuy nhiên vùng hấp thụ liên kết peptide protein bị dịch phía có bước sóng dài có số tạp chất lẫn dung dịch protein Mặt khác tạp chất hấp thụ ánh sáng tử ngoại vùng bước sóng vùng bước sóng 180nm-220nm Vì thực tế thường đo độ hấp thụ dung dịch protein bước sóng 220nm-240nm Ở bước từ 250nm-300nm vùng hấp thụ amino acid thơm (Phe, Tyr, Trp) có phân tử protein hấp thụ cực đại 280nm (xem chương 2) Có thể sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ dung dịch protein bước sóng 280nm để định tính định lượng protein có chứa amino acid thơm Hàm lượng amino acid thơm protein khác thay đổi nhiều, dung dịch protein khác có nồng độ giống khác độ hấp thụ bước sóng 280nm.Và đánh giá hệ số tắt, ví dụ: hệ số tắt albumin huyết bò băng 6,7 cho ánh sáng có bước sóng 280 nm qua cm dung dịch có nồng độ 10 mg/ml; hệ số tắt kháng thể IgG 13,6 Ngồi có nhiều chất khác dung dịch có ảnh hưởng đến độ hấp thụ protein Vì vậy, phương pháp đo độ hấp thụ 60 vùng ánh sáng tử ngoại thường dùng để định lượng protein tinh để xác định protein phân đoạn nhận sắc ký tách protein qua cột 4.8 Kết tủa thuận nghịch không thuận nghịch protein Khi protein bị kết tủa đơn dung dịch muối trung tính có nồng độ khác alcohol, aceton nhiệt độ thấp protein giữ ngun tính chất kể tính chất sinh học hồ tan trở lại gọi kết tủa thuận nghịch Các yếu tố kết tủa thuận nghịch dùng để thu nhận chế phẩm protein Trong trình kết tủa thuận nghịch muối trung tính vừa làm trung hồ điện vừa loại bỏ lớp vỏ hydrate hố protein, cịn dung mơi hữu háo nước phá hủy lớp vỏ hydrate nhanh chóng Trong chế phẩm protein nhận lẫn chất dùng để kết tủa, cần sử dụng phương pháp thích hợp để loại bỏ chất Ví dụ dùng phương pháp thẩm tích để loại bỏ muối Ngược lại kết tủa không thuận nghịch phân tử protein sau bị kết tủa phục hồi lại trạng thái ban đầu Sự kết tủa thường sử dụng để loại bỏ protein khỏi dung dịch, làm ngưng phản ứng enzyme Một yếu tố gây kết tủa không thuận nghịch đơn giản đun sôi dung dịch protein (sẽ nói kỹ phần biến tính protein phần sau) 4.9 Các phản ứng hố học protein Cũng amino acid peptide protein có phản ứng hố học tương tự là: phản ứng nhóm -COOH, -NH2, gốc R phản ứng tạo màu đặc trưng liên kết peptide phản ứng biure (xem chương Ngồi ra, cịn số phản ứng màu đặc trưng khác, có ý nghĩa quan trọng phát protein gốc amio acid chuỗi polypeptide: 4.9.1 Phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau Thuốc thử Folin-Ciocalteau có chứa acid phosphomolipdic acid phos phovolframic Các chất làm tăng độ nhạy phản ứng biure, mặt khác phản ứng với gốc Tyr Trp phân tử protein Các gốc amino acid tham gia trình tạo phức chất màu xanh da trời 4.9.2 Phản ứng với ninhydrin Tất amino acid phân tử protein phản ứng với hợp chất ninhydrin tạo thành phức chất màu xanh tím, Phản ứng thực qua số bước sau: Dưới tác dụng ninhydrin nhiệt độ cao, amino acid tạo thành NH3, CO2 aldehit, mạch polypeptide ngắn môt carbon; đồng thời ... v.v 3.2 Cấu trúc bậc (cấu trúc sơ cấp) Cấu trúc bậc I biểu thị thành phần trình tự amino acid phân tử protein, cấu trúc giữ vững liên kết peptide-liên kết cộng hoá trị (xem chương 3) Cấu trúc bậc... Hemoglobin Cấu trúc không gian số phân tử protein 3.4.5 Tính quy luật cấu trúc bậc IV protein Các protein có cấu trúc bậc IV, phân tử cấu tạo từ hai hàng trăm tiểu đơn vị Tuy nhiên phần lớn phân tử protein. .. kết cấu trúc phân tử protein Từ nhờ hình ảnh phổ đặc trưng phát từ loại hydro nặng để xác định cấu trúc phân tử 3.3.2 Cấu trúc bậc II số protein biết Theo Paulin Cori (1951) cấu trúc bậc II protein