Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Sinh học Sinh viên Cao Thị Tâm Trờng Đại học Vinh Khoa Sinh học Cao Thị Tâm Nghiên cứu phân bố số đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus vùng rễ đất trồng lạc xà Nghi Liên, huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành: Di truyền - Vi sinh Vinh, 5/2005 Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Sinh học Sinh viên Cao Thị Tâm Mục lục Cao Thị Tâm -1 Nghiªn cứu phân bố số đặc điểm sinh häc Kho¸ luËn tèt nghiÖp .1 Chuyên ngành: Di truyền - Vi sinh Vinh, 5/2005 đặt vấn đề .4 Chơng I : tổng quan tài liệu I đặc điểm chung vi khuẩn bacillus II vai trß cđa vi khuẩn Bacillus hệ sinh thái nông nghiệp 2.1 Vi khuẩn Bacillus có khả cố định nitơ phân tử 2.2 Vi khuÈn Bacillus ®èi với phân giải chất -10 ∗ Sù amon hãa urª 10 ∗ Sù am«n hãa kitin .10 ∗ Sự phân giải xelluloza 10 Sự phân giải pectin 10 ∗ Sù chun hãa ph«tpho .10 ∗ Sù chuyÓn hãa kali .11 2.3 Vi khuẩn Bacillus có khả diệt côn trùng 12 2.4 Vi khuÈn Bacillus kÝch thÝch sù sinh trëng cña thùc vËt 13 III Mét sè nghiªn cøu øng dơng vi khn Bacillus 13 3.1 S¶n xuÊt chÕ phÈm Bacillus thuringiensis 13 3.2 Thu nhËn α- amylaza tõ Bacillus subtilis 14 3.3 Thu nhËn protein tõ vi khuÈn Bacillus 15 3.4 S¶n xuất chế phẩm xử lý môi trờng nuôi tôm, cá từ Bacillus 16 CHƯƠNG II Đối tợng Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 17 I Đối tợng nghiên cứu 17 II Thêi gian nghiªn cøu 17 III Địa điểm Phơng pháp thu mẫu 17 III ph¬ng pháp nghiên cứu 18 3.1 Phơng pháp phân tích số tiêu nông hoá-thổ nhỡng 18 3.2 Môi trờng phân lập, nuôi cấy vi sinh vật -20 3.3 Phơng pháp phân lập định lợng vi khuẩn Bacillus [7,5] 21 3.4 Phơng pháp tuyển chọn chủng vi khuÈn Bacillus -22 3.5 Phơng pháp thử hoạt tính phân giải photphat khã tan 22 3.6 Phơng pháp thử hoạt tính enzim proteaza xellulaza -23 3.7 Phơng pháp xư lý sè liƯu 24 Chơng III Kết nghiên cứu thảo luận .25 I Một số đặc ®iĨm cđa khu vùc nghiªn cøu 25 Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Sinh học Sinh viên Cao Thị Tâm II Kết phân tích số tiêu nông ho¸ 25 2.1 KÕt đo pH 25 2.2 Kết phân tích NH4+ 27 27 2.3 Kết phân tích l©n tỉng sè (P205) .27 III Kết định lợng vi khuẩn Bacillus mẫu đất mẫu rễ .29 IV Mối quan hệ Bacillus với số tiêu nông hoá .31 V Kết phân lập nghiên cứu số đặc điểm sinh học số chñng vi khuÈn Bacillus 32 5.1 Kết phân lập vµ tun chän 32 5.2 Hoạt tính enzim chñng vi khuÈn Bacillus 33 5.3 Kết thử hoạt tính phân giải phốtphát khó tan số chủng vi khuÈn Bacillus 33 KÕt luËn vµ KiÕn NghÞ .35 I KÕt luËn 35 II KiÕn nghÞ 35 Tài liệu tham khảo .36 PhÇn phơ lơc .38 Kho¸ luËn tèt nghiệp Cử nhân Khoa học Sinh học Sinh viên Cao Thị Tâm đặt vấn đề Vi khuẩn Bacillus trực khuẩn Gram dơng, sống hiếu khí kỵ khÝ tïy ý, sinh néi bµo tư nhê cã néi bào tử mà Bacillus vợt qua đợc điều kiện khắc nghiệt môi trờng Bacillus đà đợc nhiều nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu từ sớm Năm 1901, vi khuẩn Bacillus sotto đà đợc ishiwata phát từ bệnh tằm dâu năm 1911, Berliner phân lập đợc vi khuẩn gây bệnh tơng tự nằm tằm dâu Địa Trung Hải đặt tên Bacillus thuringensis issaelensis đợc mô tả nh loài phụ dựa vào đặc điểm huyết học Năm 1988, nhà khoa học H L.Beijerinck đà phân lập đợc loại vi khuẩn sống cộng sinh đậu đặt tên Bacillus radicicola Những loài đà đợc nghiên cứu nhiều nh Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacillus megaterium, Bacillus thuringensis… Trong đất trồng, Bacillus có vai trò cố định nitơ phân tử, phân giải hợp chất photpho khó tan phân hủy chất có nguồn gốc protein, kitin, xenlluloza Vi khn Bacillus sèng tËp trung ë vïng rƠ c©y có tác dụng kích thích sinh trởng thùc vËt nhê tiÕt Indol Acetic Acid (IAA) Ngoµi ra, nhiều loài Bacillus có tác dụng diệt côn trùng, bảo vệ mùa màng nớc ta, Bacillus đà đợc nghiên cứu nhiều Đỗ Thị Hồng Việt cộng (1997) đà nghiên cứu khả sinh tổng hợp proteaza Bacillus Võ Thị Thứ cộng (1997) đà phân lập đợc chủng thuộc loài Bacillus sphaericus có khả diệt ấu trùng muỗi Ngô Đình Quang Bính cộng (2001) đà nghiên cứu phân bố đa dạng sinh học Bacillus thuringiensis ph©n lËp tõ mét sè tØnh ë ViƯt Nam hay đà nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh than Bacillus anthracis phơng pháp sinh học phân tử (2003) Tuy nhiên, Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Sinh học Sinh viên Cao Thị Tâm nghiên cứu điều tra Bacillus tập trung số địa phơng Nghệ An nói chung đất trồng hoa màu huyện Nghi Lộc (Nghệ An) nói riêng, cha có nghiên cứu ®Ị cËp ®Õn vi khn Bacillus Víi lý trªn với khuôn khổ đề tài tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, đà lựa chọn đề tài : Nghiên cứu phân bố số ®Ỉc ®iĨm sinh häc cđa vi khn Bacillus ë vïng rễ đất trồng lạc xà Nghi Liên, huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An Mục đích nghiên cứu đề tài là: Tìm hiểu phân bố số đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus vùng rễ lạc đất trồng lạc xà Nghi Liên, huyện Nghi Lộc, Nghệ An Khoá ln tèt nghiƯp Cư nh©n Khoa häc Sinh häc – Sinh viên Cao Thị Tâm Chơng I : tổng quan tài liệu I đặc điểm chung vi khuẩn bacillus Vi khn bacillus lµ trùc khn rÊt phỉ biÕn tự nhiên (trong đất, nớc loại thực vật nh cỏ khô, khoai tây, rau quả) Tế bào chúng có hình que, gram dơng đứng riêng rẽ kết thành chuỗi Đặc điểm giống Bacillus sinh bào tử, sống hiếu khí (hoặc kị khí tùy tiƯn), thêng sinh enzim proteaza vµ amylaza (chđ u lµ amylaza) Những loài thờng gặp Bacillus subtilis (trực khuẩn khoai tây) trực khuẩn cỏ khô (Bacillus mesentericus) Hai loài Bacillus có nhiệt độ sinh trởng thích hợp 35 450C (thờng nuôi cấy 370C ), tối đa tới 600C; môi trờng có pH dới 4,5 chúng ngừng phát triển Ngoài loài trên, gặp B megaterium, B cereus, B licheniformis, B sterthermophilus Trong giống có loài gây bệnh nhiệt thán, bệnh nguy hiểm ngời gia súc, Bacillus anthracis [9] Các loài thuộc giống Bacillus đặc trng cho trực khuẩn sinh bào tử mà giữ nguyên hình que mang bào tử, số trờng hợp phình to lên chút Tùy thuộc vào loại vi sinh vật mà bào tử nằm giữa, nằm gần đầu đầu tế bào Hình 1: Hình dạng tế bào nội bào tử vi khuẩn Bacillus dạng tế bào đơn độc dạng chuỗi chụp dới kính hiển vi phản pha (ảnh từ internet) Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Sinh học Sinh viên Cao Thị Tâm Nội bào tử vi khuẩn đợc sinh để sinh sôi nảy nở mà để chịu đựng đợc điều kiện bất lợi Đó tế bào trạng thái nghỉ mà chúng trình sống bị ức chế mạnh Bào tử có màng nhiều lớp, chứa nớc tự chịu đựng tốt nhiều tác động bất lợi làm chết tế bào dinh dỡng phần lín vi khn, tÕ bµo chØ cã mét bµo tử Khi bào tử đợc hình thành ta thấy thành tế bào phần lại bị phân hủy làm cho bào tử đợc rời Gặp điều kiện thuận lợi bào tử nảy mầm Mỗi bào tử cho tế bào dinh dỡng[3] áo bào tử Vỏ bào tử Màng bảo tử Thành lõi bào tử ADN Riboxôm Hình 2: Cấu tạo nội bµo tư vi khn (Bacterial endospore) chơp díi kÝnh hiĨn vi điển tử (ảnh từ internet) Trong đất thờng gặp loài thuộc giống Bacillus sau [3]: - Bacillus subtilis : Khuẩn lạc khô, vỏ màu hay có màu xám nhạt trắng, nhăn hay tạo lớp màng mịn, lan bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, trực khuẩn ngắn nhỏ: 3-5 x 0,6àm, nhiều nối lại thành sợi dài Bào tử hình bầu dục 0,9- 0,6àm phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm gần tâm nhng không tâm Khoá luận tèt nghiƯp Cư nh©n Khoa häc Sinh häc – Sinh viên Cao Thị Tâm - Bacillus mesentericus: Khuẩn lạc thờng bám vào môi trờng thạch, có dính vào môi trờng, mỏng, nhăn nheo, màu xám nhạt - trắng, màu kem hay màu vàng rau, có nhiều thứ (variety) khác Trực khuẩn mảnh, dài ngắn, 3-10 x 0,5 0,6àm, đứng riêng rẽ xếp lại thành chuỗi dài bào tử hình bầu dục kéo dài 0,9 x0,5àm, nằm vị trí tế bào Tế bào không phình to hình thành bào tử - Bacillus cereus: Khuẩn lạc phẳng, khuyếch tán với bề mặt xù xì (dạng bột, dạng hạt nhỏ), lồi lõm, đục, mép lồi lõm Tế bào dµy, réng 1,0 – 1,5µm, dµi -5µm, cã dài hơn, đứng riêng rẽ xếp thành chuỗi, thành sợi Bào tử hình bầu dục, 1,2 1,5 x 0,9àm, nằm lệch tâm, tế bào chất dạng hạt dạng chứa không bào - Bacillus simplex: Khuẩn lạc giống với Bacillus cereus Chỗ sai khác khả hình thành sắc tố lục nhạt vàng tiết vào môi trờng Tế bào nhỏ bé, -5 x 0,6àm thờng đứng riêng rẽ, không khớp thành chuỗi Bào tử hình bầu dục 0,9 x 0,6àm nằm lệch tâm - Bacillus cereus var mycoides: Khuẩn lạc phẳng, có dạng rễ dạng khuẩn ty (sợi nấm) bám sát vào môi trờng Tế bào (5 10) x (0,8 - 1,0) àm, dài hơn, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi dài tế bào chất có dạng chứa không bào bào tử hình kéo dài, hình bầu dục, (1,0 - 1,5) x (0,8 - 1,0) µm n»m lƯch bên - Bacillus megaterium: Khuẩn lạc hình tròn đều, thùy, nếp, mép tròn lợn sóng, trông giống nh giọt bạch lạp (nến trắng), lồi, nhẵn, nhng thờng có vòng vòng đồng tâm bề mặt, màu trắng sữa, màu kem, có màu nâu nhạt, có ánh mỡ hay có dạng đục ống giống non, tế bào dày, chiều ngang 1,2 1,5àm, đến 2àm, chiều dài từ đến 10 12àm, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi giống nuôi già Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Sinh học Sinh viên Cao Thị Tâm tế bào ngắn hơn, có hình thoi với đầu hẹp lại tế bào chứa nhiều hạt nhỏ nhiều chất dinh dỡng dự trữ (mỡ, glicogen) Bào tử hình ô van hay hình kéo dài , 1,5 x (0,7 - 1,0) µm, n»m lƯch t©m, thêng theo chiỊu ngang hay chiỊu xiên tế bào - Bacillus polymyx: Khuẩn lạc vô màu, phẳng lồi trơn dày, mép cã thïy TÕ bµo (2,0 - 7,0) x (0,6 - 1,0)àm đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, thành chuỗi ngắn hình thành bào tử phồng lên thành hình chanh hay có dạng giống nh Clostridium Bào tử hình bầu dục, hình kéo dài 2,6 x 1,7àm, nằm tế bào - Bacillus asterosporus: Khuẩn lạc nhỏ bé màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng, mềm, nhầy, đồng chất Trực khuẩn dày (3 7) x (1,0 - 1,2)àm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi bào tử hình trụ hay hình kéo dài, (1,5 - 2,0) x 1,0àm nằm tế bào, hình thành bào tử, tế bào phồng lên chút trông giống nh dạng Clostridium - Bacillus brevis: Khuẩn lạc màu trắng, có sắc vàng, lồi phẳng, lấp lánh, mép ca, giống dạng mỡ đặc Tế bào (3 - 5) x (0,7 1,0) àm, đứng riêng rẽ, xếp thành chuỗi bào tử hình bầu dục, 0,8 1,0 àm chiều ngang, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào phồng to lên II vai trò vi khuẩn Bacillus hệ sinh thái nông nghiệp 2.1 Vi khuẩn Bacillus có khả cố định nitơ phân tử Ngoài nhóm vi sinh vật cố định nitơ chủ yếu nh Azotobacter, Rhizobium, ngời ta phát thÊy rÊt nhiỊu gièng vi sinh vËt kh¸c cịng cã khả đồng hóa nitơ phân tử không khí, ®ã cã vi khuÈn Bacillus nh Bacillus polymyxa, Bacillus megatherium, Bacillus truffauti [13] Kho¸ ln tèt nghiƯp Cử nhân Khoa học Sinh học Sinh viên Cao Thị Tâm 2.2 Vi khuẩn Bacillus phân giải chất Sự amon hóa urê Năm 1862, lần L.Pasteur phát vi khuẩn phân giải urê Càng sau ngời ta tìm thấy nhiều loại vi khuẩn tham gia tích cực vào trình phân giải loài đáng ý nh : trùc khuÈn Bacillus pasterii (hay Urobacillus pasterurii), Bacillus miquelii, Bacillus psichocatericus, Bacillus amylovorum [13] ∗ Sù am«n hãa kitin Bacillus có khả phân giải kitin trình phân giải kitin đợc nghiên cứu kỹ vi khuẩn Bacillus chitinnovorum Chúng có khả sinh enzim ngoại bào kitinaza kitobioza [13] Sự phân giải xelluloza Vi khuẩn Bacillus có khả phân gi¶i xelluloza nh vi sinh vËt yÕm khÝ sèng tù Bacillus cellulozae hydrogenicus, Bacillus cellulozae methanicus; vi khuÈn a nóng Bacillus cellulozae thermophicus Cơ chế trình phân giải: muốn phân giải đợc xelluloza, loại vi sinh vật thuộc giống phải tiết enzim xellulaza Enzim xelluloza enzim bào chế chung trình phân giải [13]: Xelluloza Disacarit Monosacarit (glucoza) Sự phân giải pectin Các chủng thuộc giống Bacillus phân giải pectin Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus macaras, Bacillus polimyxa [13] Sự chuyển hóa phôtpho Photpho nguyên tố cần thiết trồng, nằm thành phần nucleotit thành phần nhân tế bào Nó nằm 10 Khoá ln tèt nghiƯp Cư nh©n Khoa häc Sinh häc – Sinh viên Cao Thị Tâm ảnh 3: Chủng vi khuẩn Bacillus HD10 trình phân lập ảnh 4: Chủng vi khuẩn Bacillus HD1 trình phân lập 39 Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Sinh học Sinh viên Cao Thị Tâm ảnh 5: Chủng vi khuẩn Bacillus HD1 trình cấy ria ảnh 5: Chủng vi khuẩn Bacillus HD5 trình phân lập 40 Khoá luận tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Sinh học Sinh viên Cao Thị Tâm ảnh 6: Các chủng HD1 HD10 ảnh 7: ảnh nhuộm nội bào tử chủng L1 chụp qua hình 41 ... tốt nghi? ??p Cử nhân Sinh học, đà lựa chọn đề tài : Nghi? ?n cứu phân bố số đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus vùng rễ đất trồng lạc xà Nghi Liên, huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An Mục đích nghi? ?n cứu. .. là: Tìm hiểu phân bố số đặc ®iĨm sinh häc cđa vi khn Bacillus ë vïng rƠ lạc đất trồng lạc xà Nghi Liên, hun Nghi Léc, NghƯ An Kho¸ ln tèt nghi? ?p Cử nhân Khoa học Sinh học Sinh vi? ?n Cao Thị Tâm... Kết nghi? ?n cứu thảo luận I Một số đặc ®iĨm cđa khu vùc nghi? ?n cøu Xãm 11, x· Nghi Liên, huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An đợc nằm khu vực quy hoạch trồng hoa màu rau tỉnh Nghệ An nói chung huyện Nghi