Mục lục LỜI CẢM ƠN DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ DANH MỤC VIẾT TẮT Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu 2 1.3. Mục đích . 2 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN 3 2.1. Giới thiệu về cây Neem 3 2.1.1. Mô tả cây và giá trị của cây Neem 4 2.1.2. Dƣợc tính . 7 2.1.3. Các hợp chất limonoid trong cây Neem 8 2.2. Các phƣơng pháp trích ly limonoid từ hạt Neem . 14 2.2.1 Phƣơng pháp sử dụng dung môi . 14 2.2.2 Phƣơng pháp hiện đại, trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn . 16 2.3. Tính chất vật lý của họ Limonoid . 17 2.4. Tính chất hóa học của limonoid . 18 2.5. Các phƣơng pháp xác định limonoid 18 2.5.1. Phƣơng pháp sắc kí khí – khối phổ (GC – MS) 18 2.5.2. Phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC . 19 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 20 2.6. Tổng quan các công trình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc liên quan đến việc trích ly hợp chất limonoid từ cây Neem 21 2.6.1. Tổng quan các công trình nghiên cứu tại Việt Nam 21 2.6.2. Tổng quan các công trình nghiên cứu trên thế giới . 23 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 25 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài . 25 3.2. Vật liệu . 25 3.3. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị . 25 3.3.1 Dụng cụ . 25 3.3.2. Hóa chất . 25 3.3.3. Thiết bị . 25 3.4. Nội dung nghiên cứu . 26 3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu . 26 3.5.1. Khảo sát ảnh hƣởng của loại dung môi đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem 26 3.5.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem . 29 3.5.3. Khảo sát ảnh hƣởng của việc hỗ trợ xử lý nguyên liệu bằng vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt Neem . 31 Chƣơng 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 33 4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của loại dung môi đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem . 33 4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem 36 4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của việc hỗ trợ xử lý nguyên liệu bằng vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt Neem 38 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 5.1. Kết luận 41 5.2. Đề nghị . 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 42 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Th.S Kha Chấn Tuyền, Th.S Đoàn Thị Tuyết Lê. Ngƣời đã luôn động viên, tận tình hƣớng dẫn, quan tâm và giúp đỡ em rất nhiều về kiến thức cũng nhƣ truyền đạt kinh nghiệm cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học & Môi Trƣờng, cũng nhƣ tất cả các thầy cô của trƣờng đại học Lạc Hồng đã truyền đạt kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình học tập. Em xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện khoa học và ứng dụng Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian làm việc tại viện. Em xin cảm ơn các anh chị trong phòng phân tích, cùng các anh chị làm việc tại Viện. Con vô cùng biết ơn ba mẹ và anh chị đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều kiện cho con hoàn thành chƣơng trình đại học trong suốt thời gian vừa qua. Xin cảm ơn sự góp ý và giúp đỡ của tất cả các bạn trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Sinh viên Phạm Hồng Thắng Nguyễn Thành Trung DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Khu vực vƣờn giống cây Neem tại xã Phƣợc Dinh, huyện Ninh Phƣớc, tỉnh Ninh Thuận 3 Hình 2.3 Lá và trái Neem trồng tại Ninh Thuận 5 Hình 2.3 Nhân hạt Neem tại Ninh Thuận . 7 Hình 2.4. Cấu trúc Limonoid 9 Hình 2.6 Các hoạt chất chính trong lá và hạt Neem . 14 Hình 3.1 Thiết bị trích ly dầu Neem . 27 Hình 3.2 Máy cô quay chân không 29 Hình 3.3 Máy sắc kí cột cao áp (HPLC) . 30 Hình 3.4 Thiết bị trích ly có hỗ trợ vi sóng . 32 Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện khối lƣợng cao thu đƣợc từ 3 loại dung môi 34 Hình 4.2 Cao Neem sau khi trích ly 35 Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng limonoid phụ thuộc vào loại dung môi . 35 Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng cao phụ thuộc vào thời gian trích ly và tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi . 37 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng limonoid phụ thuộc vào thời gian trích ly và tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi . 38 Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện lƣợng cao thu đƣợc khi xử lý nguyên liệu ở các khoảng thời gian và công suất khác nhau 39 Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện lƣợng Limonoid khi xử lý nguyên liệu ở các công suất và khoảng thời gian khác nhau 40 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các hợp chất limonoid trong cây Neem . 9 Bảng 2.2 Hàm lƣợng Azadirachtin trong nhân, cành, lá, rễ và thân cây Neem 12 Bảng 2.3 Hàm lƣợng Azadirachtin trong nhân hạt nem ở các nƣớc . 13 Bảng 2.4. So sánh phƣơng pháp trích ly bằng dung môi có hỗ trợ vi sóng 16 Bảng 4.1 Kết quả lƣợng cao Neem thu đƣợc bằng 3 loại dung môi khác nhau 33 Bảng 4.2 Kết quả lƣợng limonoid thu đƣợc bằng 3 loại dung môi khác nhau 34 Bảng 4.3 Mã hóa yếu tố thí nghiệm . 36 Bảng 4.4 Kết quả lƣợng cao thu đƣợc khi khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem 36 Bảng 4.5 Kết quả lƣợng limonoid thu đƣợc khi khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem 37 Bảng 4.6 Kết quả lƣợng cao thu đƣợc khi xử lý nguyên liệu bằng vi sóng 38 Bảng 4.7 Kết quả lƣợng limonoid thu đƣợc khi xử lý nguyên liệu bằng vi sóng 39 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình trích ly tổng quát đối với nguyên liệu hạt Neem 15 Sơ đồ 3.1 Quy trình trích ly hoạt chất limonoid từ hạt cây Neem 28 DANH MỤC VIẾT TẮT SCFs : Lƣu chất siêu tới hạn GC – MS: Phƣơng pháp sắc kí khí - khối phổ (gas chromatography- Mass Spechrmetry) HPLC: Sắc kí lỏng cao áp (High performance liquid chromatography) 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Các hợp chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc thiên nhiên từ thực vật, động vật, vi sinh vật … ngày nay đƣợc hƣớng đến sử dụng thay thế cho các hóa chất tổng hợp ở các lĩnh vực nông nghiệp, môi trƣờng và dƣợc phẩm. Trong lĩnh vực nông nghiệp các hoạt chất sinh học đƣợc ứng dụng bảo vệ thực vật, kích thích sinh trƣởng cho cây trồng, bảo quản nông sản và chế biến thực phẩm … Các hoạt chất sinh học trong cây Neem hay cây Xoan chịu hạn tên khoa học Azadirachta indica A. Juss, thuộc họ xoan (Meliaceae) trên thế giới đã nghiên cứu đƣợc ứng dụng nhƣ chất chống viêm trong y học, chống nấm mốc, kháng khuẩn, diệt côn trùng gây hại, … trong bảo vệ thực vật và bảo quản nông sản cho đến các sản phẩm thực phẩm chức năng chống oxy hóa. Nhƣng tại Việt Nam các nghiên cứu đi vào ứng dụng các hoạt chất sinh học từ cây Neem chủ yếu về lĩnh vực bảo vệ thực vật và bắt đầu có những nghiên cứu sử dụng các hoạt chất này trong bảo quản nông sản và chế biến thực phẩm nhƣ việc sử dụng dầu Neem với nồng độ 200 ppm có tác dụng xua đuổi sự ký sinh của bọ hà (Cylas Formicarius F.) [7]. Điều chế thuốc với hoạt chất từ lá Neem Ninh Thuận để phòng trừ mối mọt trong bảo quản ngũ cốc… Theo kết quả điều tra mới nhất của Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Đồng Nai về tổn thất sau thu hoạch đối với 8 loại nông sản chính (lúa, bắp, cà phê, điều, tiêu, rau ăn lá, rau ăn quả và trái cây) thì trái cây đứng hàng đầu với tỷ lệ tổn thất trung bình gần 19%. Còn rau ăn lá và rau ăn quả tổn thất từ 12 - 13,6%, với lúa là trên 12%, cà phê trên 7%, bắp trên 6% .Trong đó, tổn thất nặng nề nhất là ở các khâu thu hoạch, vận chuyển và bảo quản sơ chế. Do đó, để góp phần vào việc giảm tổn thất sau thu hoạch ở khâu bảo quản nông sản đồng thời nâng cao giá trị sử dụng các hoạt chất sinh học từ cây Neem, 2 chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt cây Neem (Azadirachta indica A. Juss)”. Từ đó làm tiền đề ứng dụng tác dụng các hoạt chất sinh học từ hạt Neem trong ngành bảo quản nông sản và chế biến thực phẩm. 1.2 . Mục tiêu - Xác định đƣợc loại dung môi cho hiệu suất thu hồi limonoid cao. - Xác định tỉ lệ dung môi và nguyên liệu, thời gian thích hợp của phƣơng pháp trích ly các hoạt chất limonoid từ hạt Neem cho hiệu suất cao và có hiệu quả. - Khảo sát và xác định đƣơc sự ảnh hƣởng của vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt cây Neem. 1.3 . Mục đích Góp phần xây dựng quy trình trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ hạt cây Neem với hiệu suất cao. 3 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về cây Neem Cây Neem (Xoan chịu hạn) tên khoa học Azadirachta indica A. Juss, thuộc họ Xoan (Meliaceae), có nguồn gốc từ Ấn Độ và chính tại đây cây Neem đƣợc sử dụng rộng rãi nhất. Là loài cây chịu hạn và thích nghi rất tốt với các điều kiện khác nhau của môi trƣờng, do vậy cây Neem đƣợc trồng từ cực nam Karaia của dãy Hymalya, từ vùng nhiệt đới tới vùng cận nhiệt đới, vùng khô cằn tới vùng nhiệt đới, từ vùng gần mặt nƣớc biển đến vùng có độ cao 700 m so với mặt nƣớc biển. Cây Neem đƣợc du nhập vào Việt Nam từ năm 1981 trồng thử nghiệm bƣớc đầu thành công ở tỉnh Thuận Hải (cũ), ngày nay thuộc tỉnh Ninh Thuận với diện tích nhỏ, nhƣng thực sự phát triển nhanh ở Ninh Thuận kể từ năm 1998 bắt đầu từ mô hình nghiên cứu khoa học trồng thử nghiệm 5 ha cây Neem trồng xen với cây Keo lá tràm tại hộ ông Nguyễn Văn Phóng, xã Phƣớc Dinh, huyện Ninh Phƣớc. Hình 2.1 Khu vực vƣờn giống cây Neem tại xã Phƣợc Dinh, huyện Ninh Phƣớc, tỉnh Ninh Thuận Sau đó, cây Neem đƣợc trồng nhiều ở vùng khô hạn Ninh Thuận, diện tích hiện nay trên 6.000 ha và triển vọng sẽ trở thành cây quan trọng trong chiến lƣợc 4 phát triển của tỉnh trong tƣơng lai, do đặc điểm sinh học thích hợp với điều kiện khí hậu và đất đai của vùng khô hạn Ninh Thuận và những tiềm năng ứng dụng của nó. Ngoài các lợi ích trong việc cải tạo môi trƣờng sinh thái cho vùng bán khô hạn của Ninh Thuận nhƣ: phủ xanh đất cát ven biển và đồi núi trọc, chống xói mòn, cây Neem còn đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau trong nông nghiệp nhƣ chế biến thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo quản nông sản có nguồn gốc thảo mộc, phân bón, dƣợc phẩm, mỹ phẩm cho đến thực phẩm chức năng phục vụ đời sống. Khi diện tích Neem phát triển thì việc thu hoạch, bảo quản và chế biến các sản phẩm từ lá, trái, gỗ cây Neem trong theo hƣớng công nghiệp cần đƣợc nghiên cứu để tăng hiệu suất sử dụng, mở thêm ngành sản xuất mới, tạo công ăn việc làm cho ngƣời dân. Theo Báo Tuổi trẻ Online, ngày 3/7/2011 Ban quản lý rừng phòng hộ ven biển Ninh Phƣớc đã bán 4 tấn lá Neem tƣơi và hơn 10 tấn lá Neem khô cho Công ty quốc tế Phi Long (Hà Nội) với mức giá 2.000 đồng/kg lá tƣơi và 6.000 đồng/kg lá khô. Công ty sẽ xuất khẩu số hàng này sang Nhật Bản làm dƣợc liệu (kem đánh răng, thuốc chữa đau bụng .). 2.1.1. Mô tả cây và giá trị của cây Neem Cây Neem là loại cây gỗ trung bình, đƣờng kính 40-50 cm cao từ 12-15 mét, chịu hạn tốt. Nó là loại cây có lá xanh quanh năm, phát triển tốt ngay cả trên đất cát bạc màu, đất nghèo dinh dƣỡng với khí hậu khô cằn. Cây có nhánh rộng, tán lá hình oval hay hình tròn đƣờng kính khoảng 1 – 1,5m Cây từ 8 tuổi trở đi bắt đầu cho gỗ tốt, dùng cho công nghiệp đồ mộc, làm trụ trồng thanh long, làm giàn nho . cành nhỏ làm củi đốt. Lá Neem thuộc loại lá kép lông chim một lần, dạng mác, bìa lá có khía hình răng cƣa, cuống lá ngắn. Cây ra lá non và khoảng tháng 2 – 4 và bộ lá thƣờng xanh tốt quanh năm, không có thời kỳ rụng lá. Một cây Neem cao 7,5 – 8m cho trung bình hàng năm khoảng 350 kg lá tƣơi (tƣơng đƣơng khoảng 50 kg lá khô). Lá Neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học nhƣ: Nimbin, Nimbinene, Nimbandiol, Nimbolide, Quercetin .có nhiều tác dụng trong việc chữa trị các vết thƣơng lở loét, . hiện đề tài Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt cây Neem (Azadirachta indica A. Juss) . Từ đó làm tiền đề ứng dụng. hiệu suất cao. 3 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về cây Neem Cây Neem (Xoan chịu hạn) tên khoa học Azadirachta indica A. Juss, thu c họ Xoan (Meliaceae),