Đang tải... (xem toàn văn)
Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA NÓ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI-2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA NĨ Chun ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Quyền Đình Thi Thực tại: Viện Cơng nghệ Sinh học Viện Khoa học công nghệ Việt Nam HÀ NỘI-2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Quyền Đình Thi trƣởng phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên, CN Đào Thị Tuyết tập thể cán Phịng Cơng nghệ Sinh học Enzyme, Viện Cơng nghệ Sinh học tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận văn tạo điều kiện tốt giúp học tập rèn luyện suốt trình thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Sinh trƣờng ĐHSP - Đại học Thái Nguyên giảng dạy tạo điều kiện chu đáo cho tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên giúp đỡ suốt trình học tập để tơi có đƣợc kết nhƣ ngày hơm Với lịng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ q báu ! Thái Ngun, tháng 10 năm 2009 Học Viên Nguyễn Hữu Quân Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐỊNH NGHĨA 1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI 1.2.1 Nguồn gốc 1.2.2 Phân loại enzyme 1.3 CẤU TRÚC 1.3.1 Cấu trúc bậc 1.3.2 Cấu trúc không gian 1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC 1.5 Khái quát Aspergillus oryzae 10 1.6 Ứng dụng 11 1.6.1 Trong công nghiệp sản xuất giấy bột giấy 11 1.6.2 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 12 1.6.3 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 13 1.6.4 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu 14 1.6.5 Trong công nghệ sử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 14 1.7 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE 16 1.7.1 Nguồn carbon 16 1.7.2 Nguồn nitrogen 17 1.7.3 Nhiệt độ nuôi cấy 18 1.7.4 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng 18 1.8 TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA ENZYME 19 1.8.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 19 1.8.2 Ảnh hƣởng pH 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.8.3 Ảnh hƣởng ion kim loại 20 1.8.4 Ảnh hƣởng dung môi hữu chất tẩy rửa 21 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 22 2.1.1 Chủng giống 22 2.1.2 Thiết bị 22 2.1.3 Hóa chất 22 2.1.4 Dung dịch đệm phá tế bào 23 2.1.5 Môi trƣờng 24 2.2 PHƢƠNG PHÁP 25 2.2.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme 25 2.2.2 Định tính endo-β-1,4-glucanase 25 2.2.3 Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase 25 2.2.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng lên khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 27 2.2.5 Tinh sơ endo-β-1,4-glucanase 29 2.2.6 Điện di SDS-PAGE 30 2.2.7 Xác định tính chất lý hóa endo-β-1,4-glucanase 30 2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Sàng lọc chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase cao 36 3.2 Phân loại chủng nấm sợi A oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA 37 3.3 Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 39 3.3.1 Khả sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian 39 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.3 Ảnh hƣởng nguồn carbon 41 3.3.4 Ảnh hƣởng nồng độ carbon 43 3.3.5 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen 44 3.3.6 Ảnh hƣởng nồng độ nitrogen 45 3.3.7 Nhiệt độ nuôi cấy 46 3.3.8 Ảnh hƣởng pH nuôi cấy 47 3.4 Tinh sơ endo-β-1,4-glucanase 48 3.5 Tính chất lý hóa endo-β-1,4-glucanase 50 3.5.1 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu 50 3.5.2 pH phản ứng tối ƣu 51 3.5.3 Độ bền nhiệt 52 3.5.4 Độ bền pH 54 3.5.5 Ảnh hƣởng dung môi hữu 55 3.5.6 Ảnh hƣởng số chất tẩy rửa 56 3.5.7 Ảnh hƣởng ion kim loại 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 TIẾNG VIỆT 61 TIẾNG ANH 64 PHỤ LỤC 69 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thiết bị đƣợc sử dụng thí nghiệm 22 Bảng 2.2 Các hóa chất đƣợc sử dụng thí nghiệm 23 Bảng 2.3 Danh sách dung dịch đệm đƣợc sử dụng thí nghiệm 23 Bảng 3.1 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase 35 chủng A oryzae 37 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nguồn carbon đến khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 42 Bảng 3.2 Tóm tắt q trình tinh endo-β-1,4-glucanase từ chủng A oryzae VTCC-F-045 49 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 57 Bảng 4.1 Đƣờng chuẩn glucose 69 Bảng 4.2 Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA từ chủng A oryzae VTCC-F-045 69 Bảng 4.3 Khả sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian 70 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ CMC tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 70 Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 71 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng nồng độ lactose tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 71 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 72 Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nồng độ bột đậu tƣơng tới khả sinh endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 72 Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 72 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 4.10 Ảnh hƣởng pH nuôi cấy tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 73 Bảng 4.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 73 Bảng 4.12 Ảnh hƣởng pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 74 Bảng 4.13 Độ bền nhiệt endo-β-1,4-glucanase 75 Bảng 4.14 Độ bền pH endo-β-1,4-glucanase 76 Bảng 4.15 Ảnh hƣởng chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 77 Bảng 4.16 Ảnh hƣởng dung môi hữu tới hoạt tính endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 77 Bảng 4.17 Ảnh hƣởng ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 78 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc không gian từ xuống (A) từ bên sang (B) Cel12A từ H grisea Hình 1.2 Cấu trúc vùng liên kết enzyme - chất Cel12A từ H grisea Hình 1.3 Cơ chế thủy phân cellulose (A) phức hệ cellulose (B) cellulase Hình 1.4 Sự thủy phân loại enzyme phức hệ cellulase 10 Hình 1.5 Cấu trúc gene A oryzae 11 Hình 2.1 Đƣờng chuẩn glucose 26 Hình 2.2 Quy trình tinh endo-β-1,4-glucanase từ chủng A oryzae VTCC-F-045 29 Hình 3.1 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase số chủng A oryzae 36 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA chủng A oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp XhoI XbaI (C) 38 Hình 3.3 Cây phân loại chủng A oryzae VTCC-F-045 39 Hình 3.4 Khả sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian chủng A oryzae VTCC-F-045 40 Hình 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ CMC đến khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 41 Hình 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ lactose đến khả sinh tổng hợp endoβ-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 44 Hình 3.7 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen đến khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 45 Hình 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ bột đậu tƣơng đến khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới khả sinh tổng hợp enzyme endoβ-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 47 Hình 3.10 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng tới khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 48 Hình 3.11 Sắc kí đồ cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE chủng A oryzae VTCC-F-045 (B) 49 Hình 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 51 Hình 3.13 Ảnh hƣởng pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 52 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 53 Hình 3.15 Ảnh hƣởng pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 54 Hình 3.16 Ảnh hƣởng dung môi hữu lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 55 Hình 3.17 Ảnh hƣởng chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... chọn đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase xác định tính chất lý hóa Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A oryzae sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase... ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA NÓ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30... endo-β1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ngoại bào từ chủng A oryzae xác định tính chất hóa lý endo-β-1,4glucanase Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
