Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------------------------------- PHẠM THẾ VŨ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------------------------------- PHẠM THẾ VŨ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LƢU THỊ KIM THANH THÁI NGUYÊN - 2009 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Phạm Thế Vũ Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô: Khoa Sau đại học, Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, Viện Khoa học – Công nghệ Việt Nam. - TS. Lưu Thị Kim Thanh đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ giao đề tài, trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. - Bs. Nguyễn Lê Minh giám đốc Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên đã giúp đỡ động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi về tinh thần cũng như vật chất trong quá trình học tập. - NCVC.Ts. Nghiêm Ngọc Minh Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận văn Tôi xin cảm ơn tới : - Cán bộ khoa xét nghiệm Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên, đặc biệt nhóm cán bộ xét nghiệm vi sinh đã không quản ngày, đêm cũng như các ngày nghỉ giúp đỡ tôi thu thập mẫu bệnh phẩm, phân lập vi khuẩn tả, pha chế các loại môi trường, xử lý sấy hấp dụng cụ . - Các Bác sỹ, kỹ thuật viên khoa lây, khoa xét nghiệm của các bệnh viện trực thuộc tỉnh Thái Nguyên (Bệnh viện Đa khoa Trung Ương, Bệnh viện A, Bệnh viện C, Bệnh viện Gang thép, Trung tâm y tế các huyện thành) đã cùng tham gia thu phập mẫu khi có bệnh nhân nhập viện. Thái nguyên, ngày 30 tháng 9 năm 2009 Tác giả Phạm thế Vũ MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 3 3. Những đóng góp mới của đề tài 3 4. Giới hạn nghiên cứu 3 5. Cấu trúc của luận văn 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam 4 1.1.1. Tình hình dịch tả trên Thế giới 4 1.1.2. Tình hình bệnh tả ở Việt Nam 8 1.2. Căn nguyên gây bệnh 11 1.2.1. Ổ chứa và nguồn bệnh 11 1.2.2. Tác nhân gây bệnh 11 1.2.3. Phương thức lây truyền 12 1.2.4. Tính cảm nhiễm 13 1.2.5. Diễn biến bệnh 13 1.2.6. Kháng nguyên và cấu trucas lớp vi khuẩn 14 1.2.7. Độc tố của vi khuẩn tả 16 1.2.8. Một số phương pháp phát hiện Vibrio cholerrae trong phòng thí nghiệm 18 Chƣơng 2. ĐÓI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu 19 2.2. Nguyên liệu nghiên cứu 19 2.3. Hóa chất thiết bị 20 2.4. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.4.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu 21 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.3.1. Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm 22 2.4.3.2. Các phương pháp chẩn đoán Vibrio cholerrae 24 2.4.3.3. Tiêu chuẩn đánh giá Vibrio cholerrae dương tính trong nghiên cứu 27 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đặc điểm chung của các đối tƣợng nghiên cứu 29 3.1.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 29 3.1.2. Phân bố lấy mẫu bệnh phẩm theo địa điểm lấy mẫu 33 3.2. Đánh giá phƣơng pháp nghiên cứu phát hiện Vibrio cholerae O1 35 3.2.1. Nhận biết vi khuẩn di động bằng kỹ thuật soi tươi 34 3.2.2. Nhận biết hình thể và tính chất bắt maufcuar vi khuẩn bằng kỹ thuật nhuộm Gram 37 3.2.3. Phát hiện Vibrio cholerrae bằng kỹ thuật nuôi cấy 38 3.2.4. Nhận biết Vibio cholerrae bằng phương pháp test nhanh 52 3.2.5. Chẩn đoán Vibio cholerrae bằng kỹ thuật PCR 54 3.3. Đánh giá các kỹ thuật chẩn đoán Vibrio cholerae O1 3.3.1. Kỹ thuật soi tươi với kháng huyết thanh đặc hiệu 56 3.3.2. Kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm Gram 57 3.3.3. Kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuôi cấy 58 3.3.4. Kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy 58 3.3.5. Phương pháp test nhanh với kỹ thuật nuôi cấy 59 3.3.6. Kỹ thuật nuôi cấy với phương pháp PCR 60 3.4. Tổng hợp kết quả các phƣơng pháp và thời gian 61 KẾT LUẬN 66 ĐỀ NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CT Cholerae Toxi ( Độc tố tả ) RNA Acid deroxy ribonucleic DNA Acid deoxy nucleic E.coli Escherichia coli (Vi khuẩn Ecoli ) KIA Kligler Iron Agar ( Môi trường song đường ) N.A.G Non Aglutinable Vibrios PCR Polymerase Chain Reaction ( Phát hiện độc tố V.cholerae) RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( Môi trường chọn lọc nuôi cấy vi khuẩn tả ) V.cholerae Vibriocholerae (Vi khuẩn tả ) DANH MỤC CÁC BẢNG 1 Bảng 1.1 Tình hình dịch tả ở Việt Nam từ tháng 10/2007 đến tháng 5/2008 9 2 Bảng 1.2 Phân lập V.cholerae typ cổ điển và typ Eltor 15 3 Bảng 2.1 Danh mục một số dụng cụ, hóa chất 20 4 Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 29 5 Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi 31 6 Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân dương tính Vibrio cholerrae theo giới tính 33 7 Bảng 3.4 Tỷ lên thu thập mẫu các địa điểm nghiên cứu 34 8 Bảng 3.5 Tỷ lệ vi khuẩn di động quan sát trên lam kính 36 9 Bảng 3.6 Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm quan sát dưới kính hiển vi 37 10 Bảng 3.7 Phần đánh giá chung trong việc xác định các vi khuẩn 38 11 Bảng 3.8 Tỷ lệ Vbrio cholerrae dương tính bàng kỹ thuật nuôi cấy 39 12 Bảng 3.9 Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trường TCBS 41 13 Bảng 3.10 Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trường thạch kiềm 43 14 Bảng 3.11 Thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 loại môi trường nuôi cấy 44 15 Bảng 3.12 Bảng đọc kết quả trên môi trường sinh vật hóa học 45 16 Bảng 3.13 Phản ứng Oxidase 47 17 Bảng 3.14 Đặc điểm nuôi cấy trên môi trường peptone kiềm 49 18 Bảng 3.15 Phân biệt vi khuẩn tả với các phẩy khuẩn khác thuộc nhóm N.A.G trên 3 loại đường 51 19 Bảng 3.16 Kết quả ngưng kết kháng huyết thanh đa giá và đơn giá 52 20 Bảng 3.17 Phát hiện Vibrio cholerrae O1 bằng kỹ thuật test nhanh 54 21 Bảng 3.18 Tỷ lệ Vibrio cholerrae O1 bằng kỹ thuật PCR 55 22 Bảng 3.19 Đánh giá kỹ thuật soi tươi với kháng huyết thanh đặc hiệu 57 23 Bảng 3.20 So sánh kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm Gram 57 24 Bảng 3.21 Bảng so sánh kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuôi cấy 58 25 Bảng 3.22 Bảng so sánh kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy 59 26 Bảng 3.23 Bảng so sánh phương pháp test nhanh với kỹ thuật nuôi cấy 59 27 Bảng 3.24 Đánh giá kết quả của phương pháp thử Oxidase với kỹ thuật soi tươi 60 28 Bảng 3.25 Bảng so sánh phương pháp nuôi cấy và PCR 61 29 Bảng 3.26 Tổng hợp kết quả các phương pháp và thời gian được áp dụng 61 30 Bảng 3.27 Một số phương pháp có thể áp dụng chẩn đoán nhanh Vibrio cholerrae 62 31 Bảng 3.28 Bảng so sánh kỹ thuật nuôi cấy với (bảng 3.27) 64 [...]... hợp để áp dụng sàng lọc chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae tại labo tuyến huyện khi có dịch tiêu chảy cấp 3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Đề tài nghiên cứu đã đánh giá các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae trên mẫu phân của bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên - Đáp ứng tính ứng dụng và hiệu quả tại labo tuyến huyện 4 GIỚI HẠN NGHIÊN CỨU - Thời gian nghiên cứu ngắn nên ứng dụng đánh... cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008" Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae (V cholerae ) trong giai đoạn từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 7 năm 2008 - Đánh giá hiệu quả các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae (soi tươi, nhuộm soi, test nhanh, nuôi cấy, PCR) - Lựa chọn những kỹ thuật phù... VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được tiến hành từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 9 năm 2009 Thu thập mẫu nghiên cứu từ những bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp nghi ngờ mắc tả tại các khoa lây của 6 bệnh viện trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên Chẩn đoán xác định V cholerae tại phòng thí nghiệm vi sinh Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên Thực hiện kỹ thuật PCR tại phòng vi khuẩn... ngay tại cơ sở có ý nghĩa hết sức quan trọng, không những giúp đỡ bệnh nhân có ngay phác đồ điều trị mà còn giúp các nhà dịch tễ có hướng xử lý khoanh vùng, chủ động trong phòng chống dịch, không để dịch lây lan rộng trong cộng đồng [4], [6] Đáp ứng với tình hình thực tiễn kể trên, chúng tôi tiến hành đề tài: " Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại. .. Dịch tiêu chảy cấp đang có chiều hướng gia tăng ở các địa phương, tính từ 23/10/2007 miền Bắc đã xảy ra ba đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm, số bệnh nhân tiêu chảy cấp đã lên đến 1.335 người, có 136 trường hợp dương tính với phẩy khuẩn tả tại 18 tỉnh / thành phố trong cả nước trong đó có tỉnh Thái Nguyên [13] Khống chế dịch tả là mục tiêu lớn trong chương trình quốc gia phòng chống bệnh tiêu chảy của... Vibrio cholerae - không O1”, sau này được đổi thành Vibrio không gây tả hoặc “nhóm Vibrio không ngưng kết” Hiện nay các nhóm này thuộc các nhóm huyết thanh từ O2 - O138, không có khả năng gây dịch tả Nhóm Vibrio này đôi khi gây tiêu chảy do liên quan đến ăn hải sản, hoặc các nhiễm trùng ngoài đường tiêu hoá như vết thương Vụ dịch tả xảy ra vào đầu năm 1993 tại Ấn Độ và Bangladaesh do một loại Vibrio. .. năng gây bệnh hoặc rất hiếm khi gây bệnh V cholerae O1 thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh độc tố và gây thành đại dịch tả, tuy nhiên có một số ít chủng không sinh ra độc tố và không có gen mã hoá độc tố Các chủng ở môi sinh không có khả năng sinh độc tố và không gây bệnh, ngoại lệ có một só chủng V cholerae O1 phân lập được ở một số bệnh nhân tiêu chảy hoặc nhiễm trùng ngoài đường tiêu hóa, Số. .. giờ có một vụ dịch nào phức tạp như bây giờ, gần như đồng loạt tất cả các Quận huyện của Hà Nội đều có dịch Trong khi đó các ổ dịch lại không liên quan đến nhau, các bệnh nhân không sống cùng nhau, không ăn cùng nhau [13] Tại tỉnh Thái Nguyên, sau nhiều năm không xuất hiện bệnh tả, đến ngày 13/11/2007 có 23 bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp trong đó có 01 bệnh nhân dương tính với V cholerae O1 Dịch bệnh... pháp nuôi cấy; Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang dùng kháng huyết thanh O1; Phản ứng đồng ngưng kết dùng kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên O1; Phản ứng ELISA dùng hạt nhiễm từ để tìm CT; Kít chẩn đoán nhanh Cholera Screen; Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử ( PCR); Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phương pháp Real-time PCR CHƢƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ... 6: Gây ra các vụ dịch lớn ở vùng Trung Cận Đông và bán đảo Ban Căng, từ năm 1921 đến năm 1961, ngoài một vụ dịch tả lớn xảy ra ở Ai Cập năm 1961 với 32.978 trường hợp tả, gây tử vong 20.472 người, dịch tả chủ yếu lưu hành ở các nước thuộc khu vực Đông Nam Á và châu Á, trong 6 vụ đại dịch đầu tiên tác nhân gây bệnh là V cholerae O1, typ sinh học cổ điển Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên . " Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008& quot; Số hóa. PHẠM THẾ VŨ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008 LUẬN VĂN
